張 霞，高宏元,2，王虎成

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心，甘肅 蘭州 730020）

近年來，我國畜牧業(yè)迅速發(fā)展，粗飼料在反芻動物飼糧中的占比增大，是動物機(jī)體與微生物互作的養(yǎng)分供應(yīng)者[1-2]。拉伸膜裹包技術(shù)已在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用[3-5]，其成品具有運(yùn)輸便捷、市場流通迅速、存放時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)。此外，苜蓿(Medicago sativa)、燕麥 (Avena sativa)、玉米 (Zea mays)裹包青貯等優(yōu)質(zhì)飼草是我國建植栽培草地和黃土高原丘陵溝壑區(qū)進(jìn)行飼草生產(chǎn)的主要資源，亦是反芻動物養(yǎng)殖的主要粗飼料，充分利用優(yōu)質(zhì)飼草(玉米、燕麥、苜蓿青貯等)作為飼草資源，將有助于緩解草畜矛盾、促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，研究裹包青貯為主的優(yōu)質(zhì)飼料在反芻動物瘤胃發(fā)酵情況，對其在反芻動物生產(chǎn)應(yīng)用中具有一定的科學(xué)意義。王立明等[6]比較了幾種主要粗飼料的瘤胃降解特性發(fā)現(xiàn)：不同粗飼料在奶牛瘤胃中的降解規(guī)律為苜蓿的干物質(zhì)(dry matter, DM)和粗蛋白(crude protein, CP)降解率最高，玉米秸稈最低；中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)降解率為全株玉米青貯最高；玉米黃貯、羊草和全株玉米青貯的(aciddetergent fiber, ADF)瘤胃有效降解率較高，玉米秸稈和苜蓿較低；桑丹等[7]通過奶牛體外發(fā)酵試驗(yàn)比較了燕麥干草、青貯玉米及谷草對瘤胃發(fā)酵調(diào)控的影響，表明燕麥干草的發(fā)酵參數(shù)、體外消化率及產(chǎn)氣量均高于青貯玉米和谷草，在奶牛瘤胃中被利用比例大，對瘤胃發(fā)酵的調(diào)控更加有利；高巍等[8]對玉米秸青貯與黃貯及苜蓿干草的體外動態(tài)消化研究研究結(jié)果表明，3種飼料經(jīng)72 h發(fā)酵后對瘤胃液的pH沒有顯著影響，但對發(fā)酵終產(chǎn)物揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)的摩爾百分比有影響。目前多數(shù)研究集中在對裹包青貯飼草(玉米、燕麥、苜蓿裹包青貯)營養(yǎng)成分的比較，但有關(guān)裹包玉米、苜蓿和燕麥青貯作為粗飼料對肉羊體外瘤胃發(fā)酵影響方面的研究鮮有報(bào)道。為此，本研究選用黃土高原丘陵溝壑區(qū)推廣應(yīng)用的裹包玉米、燕麥、苜蓿青貯為試驗(yàn)材料，利用體外產(chǎn)氣法評價(jià)3種裹包青貯飼草的肉羊體外瘤胃發(fā)酵性能，皆在為該研究區(qū)幾種優(yōu)質(zhì)青貯飼草的飼用價(jià)值及合理搭配做初步探究，為科學(xué)高效的肉羊養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和科技支撐，對生產(chǎn)實(shí)踐具有理論指導(dǎo)的意義。

1 材料與方法

1.1 青貯飼草樣品及營養(yǎng)水平分析

試驗(yàn)所用飼草為裹包玉米、苜蓿、燕麥青貯，均購自甘肅民祥牧草有限公司，采集的鮮樣經(jīng)凍干機(jī)凍干后制成粉樣，以備常規(guī)化學(xué)成分分析與體外產(chǎn)氣試驗(yàn)。按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法[9]，測定飼草的營養(yǎng)組成，包括粗蛋白(crude protein, CP)、粗脂肪(ether extract, EE)、粗灰分(Ash)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)和中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF) (表 1)。

表 1 不同裹包青貯的營養(yǎng)組成Table 1 Nutrient composition of different wrapped silage

1.2 瘤胃液供體動物及瘤胃液采取

于定西市祥泰養(yǎng)殖場選取3只健康狀況良好，體重約30 kg的小尾寒羊作為瘤胃液供體動物。試驗(yàn)期間舍飼群養(yǎng)，試驗(yàn)開始前作驅(qū)蟲處理，保持圈內(nèi)清潔干燥，定期進(jìn)行消毒。日糧配制參照中國肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)；每天飼喂兩次(09:00和19:00)，自由飲水。

晨飼前，用瘤胃液采集器經(jīng)口腔采集瘤胃液，迅速裝入充滿CO2的密閉容器，并39 ℃保溫，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室。把取得的瘤胃液經(jīng)四層紗布過濾，得到濾液，并與人工唾液以體積比1∶2混合，39 ℃恒溫，用磁力攪拌器攪拌，同時(shí)通入CO2，得到人工瘤胃液。其中人工唾液的配制采用Menke的方法[10]，然后將其置于39 ℃磁力攪拌器上不斷攪拌，同時(shí)通入CO2(需通入底部)，直至溶液呈還原狀態(tài)，在液面以上持續(xù)通入CO2確保厭氧。

1.3 瘤胃體外發(fā)酵試驗(yàn)

在玻璃注射培養(yǎng)器活塞前端1/3處均勻涂抹凡士林。稱取0.400 0 g處理好的青貯飼草樣品，加入54 μm (300目)的自制尼龍袋(長5 cm、寬2 cm)，每個尼龍袋中加入9 g左右的玻璃珠，并密封。每個樣品3個重復(fù)，每個重復(fù)設(shè)置1個空白(其中只加入9 g玻璃珠)。用分液裝置向裝有尼龍袋樣品的注射器中分別加入40 mL人工瘤胃培養(yǎng)液，排出培養(yǎng)器中的空氣，用橡膠帽堵住注射器前端并用封口膜封口，將其置于已預(yù)熱的(39 ℃)恒溫水浴箱中。

記錄體外培養(yǎng)3、6、9、12、24、36、48 h時(shí)的產(chǎn)氣量，并收集48 h的發(fā)酵培養(yǎng)液和尼龍袋。培養(yǎng)液-20 ℃保存，以備后續(xù)指標(biāo)的測定分析，尼龍袋放進(jìn)冰水中終止發(fā)酵反應(yīng)，然后在25～39 ℃的溫水中洗滌直至洗滌用水清亮為止，晾干，帶回實(shí)驗(yàn)室測定干物質(zhì)消失率(in vtiro dry matter digestibility，IVDMD)。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 累積產(chǎn)氣量(gas production，GP)的計(jì)算

GP = 該時(shí)間段內(nèi)培養(yǎng)管產(chǎn)氣量 - 對應(yīng)空白管產(chǎn)氣量。

1.4.2 產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)估計(jì)

根據(jù)Φrskov和Mcdonald[11]提出的數(shù)學(xué)模型GP =a + b(1 - e-ct)，將各青貯飼草樣不同時(shí)間點(diǎn)的累積產(chǎn)氣量代入公式計(jì)算產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)a、b、c。其中，GP為培養(yǎng)t時(shí)間點(diǎn)的累積產(chǎn)氣量(mL)，t為培養(yǎng)時(shí)間(h)，e為自然對數(shù)；a表示飼草快速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量(mL)，b表示飼草慢速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量(mL)，c表示b的產(chǎn)氣常數(shù)(mL·h-1)，a + b表示潛在產(chǎn)氣量(mL)。

1.4.3 體外干物質(zhì)消失率(IVDMD)和代謝能(ME)

式中：A為發(fā)酵前樣品DM重(g)；ME (MJ·kg-1)的估算按照以下公式進(jìn)行[12]。

式中：GP為24 h產(chǎn)氣量(mL·g-1)，CP為粗蛋白含量(%)，EE為粗脂肪含量(%)。

1.4.4 氨氮(NH3-N)含量及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量的測定

分別對發(fā)酵48 h的培養(yǎng)液進(jìn)行NH3-N含量和VFA含量的測定，其中VFA包括總揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acids, TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸、乙酸丙酸比等。NH3-N濃度測定參照周建偉[13]的方法測定，VFA濃度參照李曉亞[14]的方法使用Aglient 6890N型氣相色譜儀測定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理；用SPSS 19.0軟件中的非線性回歸模型擬合出產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)；利用單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；試驗(yàn)結(jié)果用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，顯著性水平為 P ＜ 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種裹包青貯在肉羊瘤胃體外產(chǎn)氣特征

3種裹包青貯的肉羊瘤胃體外產(chǎn)氣量均隨著時(shí)間的延長而逐漸增加(圖1)。在整個產(chǎn)氣過程中，玉米青貯和燕麥青貯在同一時(shí)間點(diǎn)的累積產(chǎn)氣量差異不顯著(P ＞ 0.05)，但均顯著高于苜蓿青貯(P ＜0.05)。通過產(chǎn)氣動態(tài)曲線的斜率變化，大致可以判斷3種裹包青貯的產(chǎn)氣速率均在0-24 h內(nèi)較快，在24 h后逐漸下降。

圖 1 體外發(fā)酵0-48 h產(chǎn)氣量變化Figure 1 Gas production during 0-48 h with trial forage不同小寫字母表示同一發(fā)酵時(shí)間不同青貯間差異顯著(P ＜ 0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference between three kinds of silages at the same fermentation time at the 0.05 level.

體外產(chǎn)氣動力模型分析結(jié)果(表2)顯示，玉米青貯、苜蓿青貯和燕麥青貯的快速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量 (a)分別為-11.14 、-8.32 和-1.84 mL·g-1，3 種裹包青貯a值均為負(fù)值，說明有產(chǎn)氣滯后現(xiàn)象；3種裹包青貯的產(chǎn)氣速率(c)均無顯著差異(P ＞ 0.05)，玉米青貯和燕麥青貯的慢速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量(b)、潛在產(chǎn)氣量(a + b)及48 h累積產(chǎn)氣量GP均無顯著差異 (P ＞ 0.05)，但二者均顯著高于苜蓿青貯 (P ＜ 0.05)。

2.2 3種裹包青貯在肉羊瘤胃體外發(fā)酵48 h氨態(tài)氮濃度、干物質(zhì)消失率及代謝能比較

玉米青貯和燕麥青貯的氨態(tài)氮(NH3-N)濃度和代謝能(ME)均無顯著差異(P ＞ 0.05)，但均與苜蓿青貯存在顯著差異(P ＜ 0.05)，二者NH3-N濃度顯著低于苜蓿青貯，ME顯著高于苜蓿青貯(P ＜ 0.05)(表3)。3種裹包青貯的pH、體外干物質(zhì)消失率(IVDMD)均無顯著差異 (P ＞ 0.05)。

2.3 3種裹包青貯在肉羊瘤胃體外發(fā)酵48 h總揮發(fā)性脂肪酸比較

體外發(fā)酵48 h后，3種裹包青貯的總揮發(fā)性脂肪酸 (TVFA)和丁酸含量均無顯著差異(P ＞ 0.05)；乙酸含量和乙酸/丙酸(A/P)均為苜蓿青貯顯著高于玉米青貯和燕麥青貯(P ＜ 0.05)；苜蓿青貯丙酸含量顯著低于玉米青貯和燕麥青貯(P ＜ 0.05) (表4)。

3 討論

3.1 3種飼草裹包青貯體外發(fā)酵產(chǎn)氣特性

體外發(fā)酵產(chǎn)氣量是反芻動物瘤胃底物發(fā)酵的一個重要的指標(biāo)，可在一定程度上反映動物體內(nèi)飼料的降解規(guī)律，亦反映瘤胃微生物的活性和底物發(fā)酵能力[10,15-17]，其大小取決于可發(fā)酵有機(jī)物含量和瘤胃微生物活力。產(chǎn)氣量主要來源于微生物對飼料中碳水化合物和蛋白質(zhì)含碳部分的降解，快速降解產(chǎn)氣量和慢速降解產(chǎn)氣量反映飼料發(fā)酵前期和后期可降解部分，其值越大表示該階段可發(fā)酵成分含量越高。本研究中的玉米青貯、燕麥青貯和苜蓿青貯，其結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量相較秸稈等低品質(zhì)粗飼料較高，各粗飼料的最高GP均在48 h之后出現(xiàn)，且玉米青貯和燕麥青貯的發(fā)酵啟動時(shí)間短，主要因?yàn)楹瘫究骑暳舷鄬Χ箍骑暡莺懈嗟囊装l(fā)酵碳水化合物所致；其次，本研究中3種裹包青貯的產(chǎn)氣動態(tài)均為在24 h內(nèi)產(chǎn)氣較快，在24 h后產(chǎn)氣速率變慢，產(chǎn)氣動態(tài)曲線逐漸變得平緩，這與體外產(chǎn)氣的基本規(guī)律相一致。

表 2 產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)Table 2 Gas production kinetics and estimated parameters

表 3 體外發(fā)酵48 h的pH、體外干物質(zhì)消失率、氨態(tài)氮含量及代謝能Table 3 IVDMD, NH3-N concentrations, and ME after 48 h in vitro fermentation

表 4 體外發(fā)酵48 h后培養(yǎng)液總揮發(fā)性脂肪酸含量Table 4 Total volatile fatty acid content of culture fluid after 48 h in vitro fermentation

3.2 體外培養(yǎng)48 h后干物質(zhì)消失率、pH和氨態(tài)氮

pH是瘤胃內(nèi)環(huán)境與發(fā)酵水平綜合反映指標(biāo)之一，其大小受日糧類型、唾液分泌和瘤胃代謝物利用等諸多因素的影響[18]，一般認(rèn)為最佳變化范圍在5.5～7.5。一般情況，體外發(fā)酵培養(yǎng)液pH隨著飼料發(fā)酵時(shí)間的延長而顯著下降，主要因?yàn)榘l(fā)酵產(chǎn)酸增加及累積引起[19]。本研究中，盡管pH受粗飼料類型的影響，但3種裹包青貯培養(yǎng)液pH (5.88～5.98)在適宜范圍內(nèi)，表明發(fā)酵48 h不會影響瘤胃微生物生長繁殖。

NH3-N作為微生物分解含氮物質(zhì)的終產(chǎn)物，可被瘤胃微生物合成微生物蛋白[20]，反映日糧蛋白質(zhì)的降解和重新利用情況，濃度過高或過低均不利于微生物生長繁殖的環(huán)境，若供應(yīng)不足，則微生物合成受阻，動物生產(chǎn)性能降低，相反，過高則會加重機(jī)體氮代謝的負(fù)擔(dān)[21]。一般情況下，瘤胃氨氮水平處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但瘤胃NH3-N的含量變動很大，其最佳范圍為6.58～36.7 mg·dL-1[22]。本研究中，3種裹包青貯NH3-N濃度變化范圍為11.57～29.98 mg·dL-1，其均在最佳范圍，這說明其濃度可以確保瘤胃微生物的正常生長。

DM瘤胃降解率的大小可以反映飼料消化的難易程度，降解率越高，飼料的可利用程度就越高[23]。DM的降解主要是CP、EE和CF等物質(zhì)的降解[24]，瘤胃碳氮比適中，更有利于微生物活動，亦對應(yīng)高的IVDMD。本研究條件下，玉米青貯和燕麥青貯的IVDMD分別為72.80%和73.76%，高于苜蓿青貯(64.24%)，其玉米青貯的IVDMD高的原因是青貯后的玉米富含易被瘤胃微生物發(fā)酵利用的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物；而燕麥青貯IVDMD高的原因可能是其養(yǎng)分間的碳氮比合適，易于微生物利用。此外，亦有研究[25]表明較低的飼料粗灰分和ADF含量會對應(yīng)較高的IVDMD，可能也是玉米青貯和燕麥青貯IVDMD較高的原因之一。

3.3 體外發(fā)酵48 h培養(yǎng)液的總揮發(fā)性脂肪酸含量

揮發(fā)性脂肪酸是一個能量指標(biāo)，為反芻動物的生長提供大部分能量，濃度的變化對維持瘤胃內(nèi)環(huán)境有重要作用[17,26]，其中乙酸主要來自結(jié)構(gòu)性碳水化合物的分解，而丙酸等則主要來自淀粉和可溶性糖的降解。乙酸和丙酸以不同的代謝途徑提供養(yǎng)分和能量，乙酸/丙酸的比值大小可改變瘤胃發(fā)酵模式[21]。發(fā)酵底物結(jié)構(gòu)和微生物活性是影響VFA濃度及比例的主要因素[27]。李建國和安永福研究表明，反芻動物瘤胃內(nèi)乙酸、丙酸、丁酸占總揮發(fā)性脂肪酸的比例分別為50%～65%、18%～25%和12%～20%[28]，據(jù)此推算，乙酸/丙酸范圍應(yīng)為2.0～3.6，且其值受動物、飼料及飼養(yǎng)條件等因素的影響。本研究中，3種裹包青貯的VFA的各成分中皆以乙酸的濃度為最高，乙酸、丙酸含量均介于上述范圍或下限；其中苜蓿青貯的TVFA相對較高，表明本研究條件下，苜蓿青貯在瘤胃中消化利用率高，與史卉玲等[29]研究結(jié)果不一致，究其原因可能是瘤胃液供體動物及飼喂日糧不同所致，相應(yīng)機(jī)理需更進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究條件下，禾本科飼草(玉米、燕麥裹包青貯)，其體外產(chǎn)氣量、體外干物質(zhì)消化率和代謝能均高于豆科飼草(苜蓿裹包青貯)，但其氨態(tài)氮和總揮發(fā)性脂肪酸濃度方面苜蓿裹包青貯高于禾本科飼草(玉米、燕麥裹包青貯)，為今后肉羊飼糧配制提供參考；繼續(xù)深入裹包型青貯優(yōu)質(zhì)飼草的組合效應(yīng)對今后飼料高效利用十分必要。