張智安，牛驍麟，李 飛，李發(fā)弟,2

（1. 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2. 甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 民勤 733300）

SARA (subacute ruminal acidosis)是由于反芻動(dòng)物采食過量易發(fā)酵碳水化合物后瘤胃內(nèi)產(chǎn)生大量揮發(fā)性脂肪酸，過量酸不能及時(shí)被吸收或中和，導(dǎo)致瘤胃pH維持在5.2～5.8并超過3 h而引起的一種營養(yǎng)代謝性疾病[1]。隨著現(xiàn)代集約化生產(chǎn)發(fā)展，增加日糧谷物及易發(fā)酵碳水化合物的比例是提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)效率的重要手段，該方法在滿足反芻動(dòng)物能量需求的同時(shí)亦增加其患SARA等營養(yǎng)代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn)。該疾病對(duì)動(dòng)物瘤胃健康、利用年限及經(jīng)濟(jì)效益造成巨大負(fù)面影響。據(jù)報(bào)道，北美地區(qū)每年因SARA最多可損失約10億美元，我國眾多農(nóng)場(chǎng)也深受其害[2-4]。研究表明，SARA會(huì)導(dǎo)致機(jī)體干物質(zhì)采食量(dry matter intake, DMI)、乳脂及乳蛋白含量等顯著降低(P ＜ 0.05)[5]，并增加肝膿腫、腹瀉、蹄葉炎等營養(yǎng)代謝疾病的患病機(jī)率[6-8]。該疾病具有隱蔽性，在群體養(yǎng)殖中不易被發(fā)覺[9]，對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)管理造成一定難度。沈泰鈺[10]研究發(fā)現(xiàn)，患SARA奶牛首次發(fā)情天數(shù)、產(chǎn)犢間隔、初配天數(shù)等指標(biāo)均顯著高于健康奶牛(P ＜ 0.01)，且DMI減少，患瘤胃炎-肝膿腫-蹄葉炎綜合征的風(fēng)險(xiǎn)大幅增加。即使遺傳背景一致、飼養(yǎng)管理方式相同的反芻動(dòng)物(奶牛、肉牛及綿羊)在飼喂相同日糧后，其個(gè)體對(duì)SARA的易感性仍存在明顯差異[11]，該差異會(huì)對(duì)反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能和瘤胃健康產(chǎn)生不同影響(表1)。因此，有必要尋找能衡量SARA易感性的標(biāo)志物。但目前關(guān)于篩選和衡量SARA風(fēng)險(xiǎn)與易感性的生物標(biāo)志物研究報(bào)道較少，相關(guān)數(shù)據(jù)還不完善[12,15]，需要進(jìn)一步的研究。

1 反芻動(dòng)物SARA易感性差異及其影響因素

飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，飼喂相同日糧的肉牛[17]、綿羊[18]及奶牛[19]，其個(gè)體間瘤胃pH、患SARA的風(fēng)險(xiǎn)卻存在明顯差異[20-21]。Khiaosa-ard等[16]以18頭西門塔爾牛為研究對(duì)象，飼喂精粗比為60∶40的日糧，持續(xù)監(jiān)測(cè)瘤胃動(dòng)態(tài)pH變化5周，結(jié)果表明，與耐受組奶牛相比，易感組瘤胃pH ＜ 6.0持續(xù)時(shí)間顯著增加(P ＜ 0.01)。Gao等[12]給16頭荷斯坦奶牛飼喂精粗比為65∶35的日糧，結(jié)果發(fā)現(xiàn)奶牛最低pH差異較大，范圍為5.16～6.04；酸中毒指數(shù)也存在較大差異，范圍為0.0～10.9。目前關(guān)于SARA的定義主要基于瘤胃pH，而瘤胃pH主要通過瘤胃中酸的產(chǎn)生和移除共同作用來確定，瘤胃中酸的移除途徑主要有唾液中和(咀嚼)、流向后腸道的速率(挑食)、瘤胃上皮細(xì)胞吸收(吸收功能)等[22-23]。大量研究表明，SARA的發(fā)生與動(dòng)物咀嚼行為、挑食行為及瘤胃上皮吸收功能等息息相關(guān)，與SARA高風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物相比，采食同一日糧后，低風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物機(jī)體唾液分泌量更多、飼料產(chǎn)酸潛力較小、瘤胃酸移除速率更快[14,18,24-25]，其主要機(jī)制如圖1所示。

表 1 SARA易感性差異對(duì)反芻動(dòng)物采食行為、泌乳行為和微生物區(qū)系的影響Table 1 Effect of SARA susceptibility differences on feeding behavior, lactation behavior, and microflora of ruminants

1.1 咀嚼行為

咀嚼行為與SARA密切相關(guān)[14]，咀嚼可以促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體分泌唾液，唾液分泌量是闡釋酸中毒發(fā)生差異的關(guān)鍵因素[16,26]。研究發(fā)現(xiàn)，唾液中含有碳酸氫鹽和磷酸鹽，能有效中和反芻動(dòng)物因采食易發(fā)酵日糧后瘤胃中產(chǎn)生的大量有機(jī)酸，約37%的質(zhì)子可以通過唾液中和[23]。這表明咀嚼行為能影響動(dòng)物患SARA的風(fēng)險(xiǎn)。Khiaosa-ard等[16]選用西門塔爾育肥肉牛為研究對(duì)象，飼喂精粗比為60∶40的日糧，結(jié)果表明易感組奶牛采食每千克日糧所用的咀嚼時(shí)間 (50.5 min·kg-1)比耐受組更長 (39.5 min·kg-1)。同時(shí)，在Gao等[12]的研究中給奶牛飼喂65%精料和35%粗飼料的日糧，研究表明，耐受組奶牛總咀嚼時(shí)間為768 min·d-1，而易感組奶?？偩捉罆r(shí)間為830 min·d-1。奶牛對(duì)瘤胃pH的降低具有適應(yīng)性反應(yīng)，SARA易感性奶牛瘤胃內(nèi)pH較低，此時(shí)奶牛會(huì)通過增加咀嚼時(shí)間來增加唾液分泌或增加來自瘤胃的微粒和液體運(yùn)動(dòng)來緩解瘤胃pH的降低[27-29]。通常情況下，瘤胃pH保持在正常生理范圍內(nèi)，如果攝入過量易發(fā)酵碳水化合物，大量揮發(fā)性脂肪酸(VFA)及乳酸在瘤胃聚集，機(jī)體的調(diào)節(jié)能力無法再有效維持瘤胃pH平衡，增加SARA的患病風(fēng)險(xiǎn)[30]。

1.2 挑食行為

反芻動(dòng)物飼養(yǎng)管理過程中，由于動(dòng)物對(duì)日糧成分的喜食程度不同，從而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生挑食行為。對(duì)TMR的過度挑食會(huì)增加易發(fā)酵碳水化合物過量攝入而減少物理有效中性洗滌纖維(peNDF)攝入，導(dǎo)致瘤胃中VFA大量產(chǎn)生并累積，同時(shí)咀嚼行為減少，不能及時(shí)中和瘤胃中產(chǎn)生的過多有機(jī)酸，增加動(dòng)物患SARA的風(fēng)險(xiǎn)[31]。Devries等[32]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)奶牛泌乳早期飼喂精粗比為55∶45日糧時(shí)，它們的挑食行為與瘤胃pH有關(guān)：奶牛挑食中等和短粒徑飼料越多，其最高、最低和平均瘤胃pH就越小。還有研究發(fā)現(xiàn)，SARA耐受型和易感型奶牛都喜食中、短粒徑飼料，但易感奶牛挑食程度更嚴(yán)重(挑食指數(shù) = 105 vs. 102； P = 0.05)。此外，易感奶牛有拒絕采食長粒徑飼料的行為，而耐受奶牛沒有這一行為 (挑食指數(shù) = 87.6 vs. 97.9； P = 0.05)[13]。先前大量研究表明，即使飼喂全混合日糧，動(dòng)物也會(huì)選擇性地采食喜愛的日糧成分[33-35]，當(dāng)瘤胃pH較低時(shí)，動(dòng)物通常會(huì)通過采食一定長粒徑飼料來滿足其對(duì)peNDF的需求[36-37]。過度挑食中、短粒徑飼料會(huì)增加動(dòng)物對(duì)易發(fā)酵碳水化合物的攝入，減少peNDF的采食，急劇增加瘤胃中酸的產(chǎn)生[37]，從而提高患SARA的風(fēng)險(xiǎn)。以上研究表明，挑食行為是導(dǎo)致SARA變異性的因素之一。

圖 1 同一日糧條件下引發(fā)SARA敏感性差異的因素及其主要途徑[13, 23-25]Figure 1 Factors causing differences in SARA sensitivity and main pathways under the same diet conditions[13, 23-25]AR: 代表耐受型動(dòng)物；AS: 代表易感型動(dòng)物；↑表示顯著增加；↓表示顯著降低。AR: tolerant animal； AS: susceptible animal； ↑: increase significantly； ↓ : decrease significantly.

1.3 瘤胃上皮吸收功能

瘤胃是反芻動(dòng)物前胃系統(tǒng)中最大的組成部分，瘤胃產(chǎn)生的有機(jī)酸能夠?yàn)闄C(jī)體提供65%～75%能量[19]，而瘤胃中產(chǎn)生的中短鏈脂肪酸主要通過瘤胃上皮吸收來移除[38]，可以移除瘤胃中約53%的有機(jī)酸[23]。因此，瘤胃上皮的吸收能力對(duì)維持瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。瘤胃上皮為多層鱗片狀結(jié)構(gòu)[39]，從黏膜層到漿膜層依次為顆粒層、角質(zhì)層、基底層和棘突層。研究表明，SARA會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物瘤胃上皮角質(zhì)化不全，細(xì)胞間緊密連接程度降低，細(xì)胞間通透性增加，在瘤胃內(nèi)產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，對(duì)機(jī)體造成炎癥反應(yīng)，最終影響動(dòng)物生產(chǎn)性能[40-41]。盡管管理?xiàng)l件及飼喂日糧組成都保持相同，但不同SARA易感性動(dòng)物瘤胃上皮對(duì)VFA的吸收能力卻存在很大差異[18]。Gregory等[18]通過給成年綿羊灌注葡萄糖誘導(dǎo)SARA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐受組與易感組綿羊相比，前者吸收乙酸和丁酸更多，其他VFA含量之間變化很小，總VFA含量耐受組數(shù)值上要低于耐受組，說明耐受組對(duì)VFA有著更強(qiáng)的吸收能力。另外有研究表明，瘤胃pH的下降常常會(huì)伴隨著瘤胃上皮一些相關(guān)基因的改變[42-43]，如瘤胃上皮炎癥、H+轉(zhuǎn)運(yùn)、VFA吸收及代謝相關(guān)基因會(huì)隨著pH的改變而發(fā)生相應(yīng)的變化。張瑞陽等[44]通過體外發(fā)酵技術(shù)，以裝有瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛(n =4)為研究對(duì)象，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行間歇性SARA誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果表明，飼喂高精料日糧奶牛的瘤胃乳頭中炎癥相關(guān)基因(IL-1β，IL-2，IL-6和IL-8)的mRNA表達(dá)更高。Yan等[45]增加山羊飼喂精料的比例(10%vs. 35%)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著日糧精料的增加，氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體(DRA、PAT1及AE2)、Na+/H+交換載體(NHE1、NHE2及NHE3)及一元羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(MCT1和MCT4)的mRNA表達(dá)量升高，有助于瘤胃酸的移除和VFA的吸收。以上研究表明，瘤胃上皮對(duì)瘤胃酸吸收功能的強(qiáng)弱會(huì)影響動(dòng)物患SARA風(fēng)險(xiǎn)大小。但目前關(guān)于不同SARA易感性反芻動(dòng)物之間H+轉(zhuǎn)移及VFA吸收相關(guān)基因表達(dá)差異的研究鮮有報(bào)道，在瘤胃上皮中的表達(dá)位置尚不明確，各基因表達(dá)產(chǎn)物是否存在轉(zhuǎn)運(yùn)特異性等[46]，因此關(guān)于反芻動(dòng)物瘤胃上皮吸收功能需要更進(jìn)一步的研究。

2 SARA標(biāo)志物研究進(jìn)展

2.1 脂多糖

動(dòng)物采食過量可發(fā)酵碳水化合物后使瘤胃內(nèi)pH急劇下降，瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生明顯改變，纖維素分解菌對(duì)pH較敏感，隨著瘤胃pH的降低纖維素分解菌數(shù)量下降，大量革蘭氏陰性菌死亡崩解，內(nèi)毒素被釋放出來導(dǎo)致瘤胃中以游離脂多糖(LPS)為主的內(nèi)毒素物質(zhì)含量增加[47-50]。Khafipour等[51]用紫花苜蓿(Medicago sativa)顆粒飼料對(duì)8頭泌乳期荷斯坦奶牛進(jìn)行6周SARA誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果顯示瘤胃內(nèi)游離LPS濃度從第1周的42 122 EU·mL-1增加至第 6周的 145 593 EU·mL-1，這表明 SARA與LPS之間存在密切的聯(lián)系，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加瘤胃內(nèi)游離LPS含量增加。Stefanska等[52]以13個(gè)牧場(chǎng)共305頭高產(chǎn)奶牛為研究對(duì)象，探究SARA對(duì)奶牛瘤胃中游離LPS的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常奶牛群相比，患SARA奶牛群瘤胃游離LPS濃度較高(43 000 EU·mL-1vs. 32 225 EU·mL-1)。該結(jié)果與Gozho等[53]研究結(jié)果相一致。此外，由于患SARA動(dòng)物個(gè)體瘤胃內(nèi)毒素含量較高，會(huì)引發(fā)黏膜發(fā)炎、損傷，瘤胃上皮通透性增加，致使血液中毒素可能也會(huì)增加[54-55]。綜上大量研究表明，反芻動(dòng)物過量采食易發(fā)酵日糧導(dǎo)致有機(jī)酸聚集，引起反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)微生物群落的改變，纖維分解菌在較低pH情況下大量死亡并釋放出LPS，增加動(dòng)物患SARA的風(fēng)險(xiǎn)，這表明瘤胃中游離LPS的含量可以反映瘤胃中微生物區(qū)系的狀況及動(dòng)物患SARA風(fēng)險(xiǎn)大小。

2.2 奇數(shù)碳和支鏈脂肪酸

奇數(shù)碳和支鏈脂肪酸(odd-and branched-chain fatty acids, OBCFA) 主要來源于脫離瘤胃細(xì)菌的膜脂質(zhì)，其內(nèi)源合成量十分有限，主要存在于反芻動(dòng)物乳脂和脂肪組織中[56]。不同瘤胃細(xì)菌OBCFA組成不同，當(dāng)動(dòng)物患SARA時(shí)瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生改變，造成瘤胃細(xì)菌OBCFA以及乳中OBCFA含量不同，可以將其用于瘤胃微生物種群組成、變化及其代謝產(chǎn)物的評(píng)估，同時(shí)可以作為判別反芻動(dòng)物患SARA風(fēng)險(xiǎn)大小的標(biāo)志物[56-57]。瘤胃的纖維分解菌(cellulolytic bacteria)富含奇數(shù)異構(gòu)脂肪酸，淀粉分解菌支鏈脂肪酸含量較少，但直鏈奇數(shù)碳脂肪酸或者反式異構(gòu)脂肪酸含量較高。研究發(fā)現(xiàn)，在瘤胃液中不同細(xì)菌的種群數(shù)量與OBCFA含量的相互關(guān)系是有差異的[58]。在劉可園[59]的研究中發(fā)現(xiàn)瘤胃十五烷酸(C15∶0)和總奇數(shù)碳脂肪酸與用于分析的各種細(xì)菌都存在相關(guān)關(guān)系，瘤胃C15∶0的含量與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)和白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)種群數(shù)量負(fù)相關(guān)，卻與牛鏈球菌(Streptococcus bovis)的種群數(shù)量正相關(guān)，這說明瘤胃C15∶0和總奇數(shù)脂肪酸可以作為瘤胃細(xì)菌種群的一種標(biāo)記物。此外，瘤胃異構(gòu)脂肪酸與纖維分解菌的種群數(shù)量呈正相關(guān)，與淀粉分解菌的種群數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，這說明瘤胃異構(gòu)脂肪酸的含量也具有預(yù)測(cè)瘤胃細(xì)菌數(shù)量的潛力[59-61]。Colman等[62]用富含小麥(Triticum aestivum)的高谷物日糧對(duì)奶牛進(jìn)行5周的SARA誘導(dǎo)試驗(yàn)，在第6周發(fā)現(xiàn)奶牛乳脂中OBCFA與動(dòng)物患病前變化很大。在第4周奶牛乳脂中C15∶0和C17∶0含量開始升高，第5周異構(gòu)十四烷酸(iso C14∶0)含量顯著降低 (P ＜ 0.05)，反式油酸 (C18∶1trans-10)含量顯著升高(P ＜ 0.05)。因此，可以將C18∶1trans-10、C15:0和C17:0作為瘤胃酸中毒的標(biāo)記物。

2.3 瘤胃相關(guān)微生物數(shù)量

瘤胃中纖維分解菌對(duì)pH敏感，隨著奶牛日糧精料比例增加，瘤胃中相應(yīng)微生物構(gòu)成、密度及多樣性都會(huì)發(fā)生變化[63-65]，因此推測(cè)可以利用瘤胃中主要纖維分解菌含量來判斷發(fā)生SARA風(fēng)險(xiǎn)的大小。有研究表明，瘤胃內(nèi)pH ＜ 6.0時(shí)間超過330 min·d-1，纖維分解菌的增殖會(huì)受到抑制[66-67]。Nagaraja等[54]也發(fā)現(xiàn)，瘤胃中主要纖維分解菌，包括白色瘤胃球菌和黃化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)，產(chǎn)琥珀酸死狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)對(duì)低瘤胃pH環(huán)境是比較敏感的。Plaizier等[68]發(fā)現(xiàn)隨著動(dòng)物日糧精料比例的增加，瘤胃pH降低，同時(shí)白色瘤胃球菌、黃化瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸死狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌的含量明顯減少，這說明瘤胃pH降低會(huì)使主要纖維分解菌含量減少，相反也可以通過瘤胃中pH敏感細(xì)菌含量的變化來反映瘤胃中動(dòng)態(tài)pH狀況。Li等[15]通過給湖羊公羔飼喂相同日糧發(fā)現(xiàn)，瘤胃pH、VFA及纖維分解菌之間存在明顯差異，與亞急性瘤胃酸中毒低風(fēng)險(xiǎn)組(LSR)相比，亞急性瘤胃酸中毒高風(fēng)險(xiǎn)(HSR)的羔羊表現(xiàn)出較低的瘤胃pH(P = 0.013)和乙酸鹽與丙酸鹽的(乙丙比)比率(P =0.018)，且具有較高的乳酸濃度(P = 0.035)和丙酸的比例(P = 0.033)。在LSR組中，羔羊瘤胃中擬桿菌、纖維桿菌和變形菌門的相對(duì)豐度高于HSR組(P ＜ 0.05)。此外，高精料日糧誘導(dǎo)的SARA會(huì)導(dǎo)致瘤胃中淀粉分解菌含量增加[69-70]。在Fernando等[71]的研究中把高粗糧轉(zhuǎn)換成高精料日糧后，與淀粉分解有關(guān)的反芻獸新月單胞菌(Selenomonas ruminantium)、牛鏈球菌(Streptococcus bovis)和普雷沃氏菌(Prevotella brevis)數(shù)量增加。還有研究表明，當(dāng)反芻動(dòng)物患SARA時(shí)瘤胃內(nèi)乳酸產(chǎn)生菌和乳酸利用菌會(huì)增加，而原蟲數(shù)量會(huì)相應(yīng)減少[72]。動(dòng)物對(duì)高谷物日糧敏感性的差異是一個(gè)值得關(guān)注的問題，因?yàn)樵诖笠?guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)中動(dòng)物日糧通常是針對(duì)群體動(dòng)物配制，有可能導(dǎo)致易感型個(gè)體經(jīng)歷SARA，導(dǎo)致部分個(gè)體生產(chǎn)性能降低，而對(duì)其余個(gè)體無顯著影響。因此，有必要找到簡易判別反芻動(dòng)物畜群SARA的標(biāo)志物，以衡量動(dòng)物個(gè)體患SARA風(fēng)險(xiǎn)大小，并對(duì)SARA進(jìn)行早期預(yù)防，這對(duì)實(shí)現(xiàn)動(dòng)物最大生產(chǎn)效率是極具重要意義的。

3 結(jié)論與展望

反芻動(dòng)物飼喂同一高精料日糧，由于動(dòng)物咀嚼行為、挑食行為及瘤胃上皮吸收能力的差異而導(dǎo)致個(gè)體患SARA的風(fēng)險(xiǎn)不同。動(dòng)物采食過量易發(fā)酵碳水化合物會(huì)導(dǎo)致瘤胃內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量和OBCFA發(fā)生改變，瘤胃內(nèi)主要纖維分解菌含量(如白色瘤胃球菌、黃化瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸死狀桿菌和溶纖維丁酸弧 菌)、淀粉分解菌和乳酸菌含量、內(nèi)毒素及瘤胃中奇數(shù)碳和支鏈脂肪酸(包括C18∶1 trans-10、C15∶0和C17∶0)可作為判別動(dòng)物患SARA風(fēng)險(xiǎn)大小的生物標(biāo)志物。但目前關(guān)于判斷SARA的生物標(biāo)志物的研究還很少，且研究方法也不太成熟，對(duì)SARA生物標(biāo)志物的研究還需要進(jìn)一步探索。隨著宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)研究方法的不斷成熟，可以考慮在以后SARA生物標(biāo)志物的研究中引入這些技術(shù)，通過宏基因組學(xué)進(jìn)一步探索反芻動(dòng)物消化道中還未被發(fā)現(xiàn)的微生物，通過代謝組學(xué)以動(dòng)物體內(nèi)某些小分子代謝產(chǎn)物為研究對(duì)象，根據(jù)其發(fā)生的變化以及能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響來尋找能判別動(dòng)物患SARA的生物標(biāo)志物，這對(duì)進(jìn)一步認(rèn)知生物標(biāo)志物具有重要的科學(xué)意義。