至今已發(fā)現(xiàn)90多個(gè)與疾病相關(guān)的三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter 1， ABCA1)基因變異位點(diǎn)，這些單核苷酸多態(tài)性變異位點(diǎn)分布在編碼區(qū)和非編碼區(qū)(包括啟動(dòng)子區(qū)也就是基因調(diào)控區(qū))，位于基因調(diào)控區(qū)(啟動(dòng)子)序列中的單核苷酸多態(tài)性則會(huì)影響基因表達(dá)量，對(duì)人體有重大影響，也是目前基因組研究的一個(gè)熱點(diǎn)。因此本課題重點(diǎn)研究基因調(diào)控區(qū)(啟動(dòng)子區(qū))-565C/T基因單核苷酸多態(tài)性在內(nèi)蒙古地區(qū)人群中的分布和差異，分析其與冠心病易感性及與血脂的關(guān)系，并通過(guò)冠狀動(dòng)脈造影檢查探討-565C/T基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系，通過(guò)確定ABCA1多基因核苷酸序列多變異差異與表型、疾病風(fēng)險(xiǎn)和冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，解釋內(nèi)蒙古地區(qū)個(gè)體對(duì)冠心病遺傳易感性和疾病嚴(yán)重程度的差異，分析對(duì)藥物耐受性和不同環(huán)境因素的反應(yīng)差異。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 冠心病組為2009年1月—2015年12月在我院心內(nèi)科行冠狀動(dòng)脈造影陽(yáng)性(至少1支冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%)病人141例，對(duì)照組204例為經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影排除冠心病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重肝腎功能不全、血液病、結(jié)核、腫瘤、大動(dòng)脈炎等疾病。通過(guò)問(wèn)卷訪談收集研究對(duì)象的基礎(chǔ)資料、既往史、家族史、吸煙史等。吸煙史的標(biāo)準(zhǔn)為過(guò)去1年或1年以上每天吸煙10支以上。所有研究對(duì)象均未服用調(diào)脂相關(guān)藥物。

冠狀動(dòng)脈三支動(dòng)脈為左前降支、左回旋支和右冠狀動(dòng)脈，根據(jù)動(dòng)脈粥樣硬化受累支數(shù)分為單支、雙支和多支病變，其中左主干受累定義為雙支病變，雙支以上病變?yōu)槎嘀Р∽?。本研究分為單支病變組、雙支病變組和多支病變組。根據(jù)美國(guó)心臟學(xué)院/美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(ACC/AHA)的PTCA指南按照冠狀動(dòng)脈病變特征分為A型病變、B型病變和C型病變3種。A型病變指冠狀動(dòng)脈病變范圍為孤立性短病變(長(zhǎng)度<10 mm)、無(wú)或輕度鈣化、同心性、非完全閉塞、容易到達(dá)、非開(kāi)口部、管壁光滑、未累積大分支、無(wú)血栓、非成角病變(<45°)；B型病變指冠狀動(dòng)脈病變?yōu)楣軤瞠M窄(10～20 mm)、中重度鈣化、偏心性、完全閉塞(<3個(gè)月)、近端血管中度彎曲、開(kāi)口部病變、管壁不光滑、需要導(dǎo)絲保護(hù)的分叉病變、冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓、成角病變(>45°，<90°)；C型病變指冠狀動(dòng)脈病變?yōu)閺浡?長(zhǎng)度>20 mm)、不能保護(hù)的大分支、近端血管彎曲、易碎的脆性退化靜脈橋病變、完全閉塞(>3個(gè)月)、重度成角病變(>90°)。

1．2 方法

1.2.1 血脂水平的檢測(cè) 所有化驗(yàn)檢查均采用次日清晨空腹采集靜脈血3 mL，分離血清測(cè)定血脂水平，三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)以氧化酶法測(cè)定，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)用PEG變構(gòu)酶法測(cè)定，試劑均為L(zhǎng)eadman公司生產(chǎn)。儀器為日本OLYMPUS AU 600全自動(dòng)生化分析儀。

1.2.2 DNA提取 用EDTA抗凝真空采血管采集外周靜脈血3 mL，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照血?細(xì)胞-組織基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明提取血液DNA。

1.2.3 設(shè)計(jì)PCR引物 -565C/T基因的上下游引物分別是5′GGCTTTGACCGATAGTAACCT 3′和5′CTCTTTCTCCTACCCCTTGAC 3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.2.4 ABCA1基因多態(tài)片段的PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)在PTC-200型循環(huán)儀中進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系50 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA 2.0 μL，上游和下游引物分別為1.0 μL，滅菌超純水21 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸5 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的酶切消化 取PCR產(chǎn)物4 μL，分別加入內(nèi)切酶AciI 1 μL和10×Buffer 2 μL，加入滅菌超純水14 μL，37 ℃水浴酶切16 h。取酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)并確定樣品基因型，DNA Marker為BioMarkerⅠ。內(nèi)切酶AciI、BsmA I和10×buffer由美國(guó)BioLabs公司提供。

2 結(jié) 果

2.1 冠心病組和對(duì)照組基線資料比較 對(duì)冠心病組和對(duì)照組的基因型分布進(jìn)行平衡檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)表明ABCA1基因-565C/T各4種基因型的分布符合Hardy-Weinberg平衡遺傳定律，具有群體代表性。詳見(jiàn)表1。

表1 冠心病組和對(duì)照組基線資料比較(±s)

與對(duì)照組比較，1)P<0.05

2.2 -565C/T各基因型和等位基因分布頻率及血脂比較 冠心病組-565C/T各基因型及其等位基因與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。冠心病組-565C/T CC、TC、TT 3種基因型HDL-C、LDL-C、TG、TC比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表3。

表2 冠心病組和對(duì)照組-565C/T位點(diǎn)各基因型及等位基因頻率分布比較 例(%)

表3 冠心病組-565C/T 3種基因與血脂指標(biāo)比較(±s) mmol/L

2.3 冠心病組-565C/T基因多態(tài)性各基因型與冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)的關(guān)系 -565C/T基因的雙支病變組、多支病變組各基因型及其等位基因與單支病變組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明-565C/T這兩個(gè)基因的TT基因型和T等位基因與冠狀動(dòng)脈病變范圍有關(guān)，TT基因型和T等位基因增加冠狀動(dòng)脈病變范圍。詳見(jiàn)表4。

表4 冠心病組-565C/T基因型與冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)的關(guān)系 例(%)

2.4 冠心病組-565C/T基因多態(tài)性各基因型與冠狀動(dòng)脈病變程度的關(guān)系 -565C/T B型病變組、C型病變組各基因型及其等位基因與A型病變組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明-565C/T這兩個(gè)基因的TT基因型和T等位基因與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度相關(guān)，可以增加冠狀動(dòng)脈的病變程度。詳見(jiàn)表5。

2.5 -565C/T基因酶切電泳圖(見(jiàn)圖1) TT型等位基因的351bp擴(kuò)增產(chǎn)物有278bp、73bp兩個(gè)片段，而CC基因型可被切成148bp、130bp、73bp 3個(gè)片段，TC基因可被切成278bp、148bp、130bp、73bp 4個(gè)片段。

圖1 -565C/T酶切產(chǎn)物及Marker電泳圖

3 討 論

ABCA1的功能是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)過(guò)量膽固醇外流到載脂蛋白，并將其包裝成HDL-C，ABCA1是調(diào)節(jié)血漿HDL-C及細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的重要載體，對(duì)控制動(dòng)脈粥樣硬化的形成起著舉足輕重的作用。如果ABCA1基因突變，膽固醇從巨噬細(xì)胞內(nèi)流出至細(xì)胞外的過(guò)程發(fā)生障礙，使膽固醇和磷脂流出減少，進(jìn)而使載脂蛋白A1不能與之有效結(jié)合，很快經(jīng)腎臟清除，由此HDL-C合成障礙，會(huì)引起大量膽固醇和膽固醇脂在巨噬細(xì)胞內(nèi)積聚而成為泡沫細(xì)胞，繼而浸潤(rùn)血管壁，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生發(fā)展。ABCA1基因不同位點(diǎn)的變異與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及血脂密切相關(guān)，有一些變異使HDL-C水平增高[1-2]，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和減少冠心病危險(xiǎn)性的作用[3-6]，如：R219K。有些變異使HDL-C水平下降，如R230C、R1587K、V8251[7]，在啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性增加冠心病的危險(xiǎn)性，如：C69T[8-9]。有些變異可能沒(méi)有或很少影響到ABCA1的功能，與血漿HDL-C水平變化無(wú)明顯相關(guān)性，如-14bp和ZNF位點(diǎn)[10]。

ABCA1基因位于染色體9q31，其啟動(dòng)子區(qū)的-565C/T位點(diǎn)基因多態(tài)性 r82422493是胸腺嘧啶取代胞嘧啶。關(guān)于冠心病與-565C/T基因多態(tài)性的相關(guān)研究，國(guó)內(nèi)外有不同的研究結(jié)論報(bào)道。Babashamsi等[11]報(bào)道-565C/T T等位基因增加α低脂蛋白血癥風(fēng)險(xiǎn)，并且降低HDL-C，升高TG、IL-6和C反應(yīng)蛋白。Ruiz等[12]報(bào)道-565C/T T等位基因增加亞臨床型心血管疾病的危險(xiǎn)性，并且與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度相關(guān)。Rejeb等[13]的報(bào)道與Ruiz等[12]不一致，Rejeb等[13]研究結(jié)果表明突尼斯人-565C/T變異與冠心病無(wú)相關(guān)性，說(shuō)明-565C/T不是冠心病的易感基因，這與本研究結(jié)果基本一致，即ABCA1基因-565C/T等位基因變異在冠心病和對(duì)照組之間的分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與冠心病的發(fā)病亦無(wú)顯著相關(guān)性，但-565C/T TT基因型和T等位基因與冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)和冠狀動(dòng)脈病變程度相關(guān)，也就是說(shuō)-565C/T TT基因型和T等位基因雖然不是冠心病的易感基因但增加冠狀動(dòng)脈病變范圍和加重冠狀動(dòng)脈病變程度，Qi 等[14]研究表明這種增加冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的原因與TT基因型ABCA1的蛋白表達(dá)以及膽固醇外流功能減低有關(guān)，推測(cè)TT基因型通過(guò)影響ABCA1蛋白表達(dá)進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞膽固醇外流功能，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈病變范圍和嚴(yán)重程度進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展，它是不依賴于影響中間表型如HDL-C、 LDL-C、TG等變化的。

本研究雖然未能發(fā)現(xiàn)-565C/T基因多態(tài)性與冠心病及HDL-C等有關(guān)聯(lián)性，但發(fā)現(xiàn)TT基因型和T等位基因雖然不是冠心病的易感基因但增加冠狀動(dòng)脈病變范圍和加重冠狀動(dòng)脈病變程度，這對(duì)于將來(lái)開(kāi)發(fā)和尋找有關(guān)ABCA1基因表達(dá)具有特異性調(diào)控作用的藥物奠定了一定的基礎(chǔ)，對(duì)預(yù)防和治療高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等都具有十分重要的意義。由于在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)及防治心血管疾病方面的重要作用，近幾年ABCA1引起了人們的廣泛興趣，其表達(dá)調(diào)控成為研究的熱門(mén)領(lǐng)域。隨著對(duì)ABCA1基因認(rèn)識(shí)的深入，針對(duì)ABCA1介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)運(yùn)及基因多態(tài)性的研究將有助于探討人類重大疾病冠心病的發(fā)病機(jī)制以及其與冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重程度的關(guān)系，將為ABCA1的基因診斷及基因治療的開(kāi)展提供重要的依據(jù)。