陳攀麗，唐建榮，張逸強(qiáng)

0 引言

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌發(fā)病率居第三位，約占所有病例的10%[1]。早期結(jié)腸癌可以通過手術(shù)治愈，而已經(jīng)發(fā)生肝臟或其他部位轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌通常難以治愈，五年生存率低[2]?；熓侵委熤型砥诮Y(jié)腸癌的主要手段，順鉑和氟尿嘧啶是常見的藥物，但毒副作用較大，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3-4]。黃芪為傳統(tǒng)中藥材，廣泛分布于溫帶地區(qū)。黃芪中提取出的天然活性成分有多糖、三萜、黃酮等，其中黃芪甲苷是黃芪的主要天然藥物活性成分；目前黃芪甲苷含量常作為黃芪藥材優(yōu)劣的評判標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。研究顯示，黃芪甲苷有免疫調(diào)節(jié)、器官保護(hù)、降血糖血脂、抗炎、抗病毒等多種藥理作用[7-8]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能增強(qiáng)結(jié)腸癌的化療敏感度和調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[9-10]，但黃芪甲苷對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響尚未見報道。本文以體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞為研究對象，探討黃芪甲苷對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞研究中心；黃芪甲苷（純度＞98%,CAS: 83207-58-3）購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒購自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素雙抗購自美國Hyclone公司；二甲亞砜購自美國Sigma公司；Hoechst33342購自美國Sigma公司；兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)（#2586T）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2, bcl-2）（#3498）、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X, Bax)（#5023）、cleaved caspase-3(#9664S)和cleaved caspase-9(#20750)購自美國Cell Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。蛋白濃度測定試劑盒和超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及處理

SW480細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%～80%時，0.25%胰酶室溫下消化5 min，反復(fù)吹打為單細(xì)胞懸液后進(jìn)行傳代。細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈對數(shù)生長期時用于實(shí)驗。黃芪甲苷溶于二甲亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO），加入含血清的培養(yǎng)基，經(jīng)孔徑為0.22 μm的濾頭過濾后保存。

1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/毫升，取100 μl細(xì)胞懸液至96孔板，在37℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h。棄上清液，更換黃芪甲苷終濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μmol/L的培養(yǎng)基，對照組中加相應(yīng)濃度的DMSO。每組設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，換含CCK-8檢測液的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在酶標(biāo)儀下檢測450 nm處的吸光度。

將細(xì)胞分為對照組（SW480細(xì)胞）、黃芪甲苷低劑量組（5 μmol/L）、黃芪甲苷中劑量組（10 μmol/L）和黃芪甲苷高劑量組（20 μmol/L）。按照上述操作步驟，以黃芪甲苷終濃度為5、10和20 μmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)SW480細(xì)胞，對照組中加相應(yīng)濃度的DMSO。酶標(biāo)儀下檢測0、1、2、3、4 d時450 nm處的吸光值，計算細(xì)胞增殖倍數(shù)。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá) SW480細(xì)胞在不同濃度黃芪甲苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，胰酶消化細(xì)胞，加蛋白裂解緩沖液，冰上超聲裂解。12 000 r/min離心20 min，取上清液，測蛋白濃度。取40 μg總蛋白用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜后，取聚偏二氟乙烯膜至5%脫脂牛奶的封閉液中，室溫下緩慢搖晃封閉1 h，轉(zhuǎn)移至一抗（1:1 000），4℃振蕩孵育過夜，TBST（tris buffered saline tween）緩沖液洗3次，每次10 min；加二抗（1:2 000），室溫下振蕩器上搖晃孵育1 h，TBST緩沖液洗3次，每次10 min。將A液和B液混合后，覆蓋到膜上，凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描及灰度值分析。

1.2.4 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化后，接種于24孔板中，各組培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的黃芪甲苷。于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次。將配好的Hoechst染液（10 μg/ml）加到24孔板中，37℃避光處理20 min，立即在熒光顯微鏡紫外激發(fā)光下觀察，拍照并記錄。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，消化后接種于相應(yīng)濃度黃芪甲苷的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，磷酸緩沖液洗2次，加入200 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；加入10 μl Annexin V后混勻，4℃孵育30 min，加入10 μl PI后迅速上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件分析處理實(shí)驗數(shù)據(jù)。兩組間比較使用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷細(xì)胞毒性的檢測

CCK-8實(shí)驗結(jié)果顯示，黃芪甲苷濃度低于20 μmol/L時，對SW480細(xì)胞的存活率基本沒有影響。當(dāng)黃芪甲苷濃度高于20 μmol/L時，SW480細(xì)胞存活率出現(xiàn)明顯的降低趨勢，見圖1。計算得出IC50濃度為168 μmol/L，綜合上面結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗選擇黃芪甲苷的濃度為5、10和20 μmol/L。

2.2 黃芪甲苷對SW480細(xì)胞增殖的影響

圖1 CCK-8檢測黃芪甲苷對SW480細(xì)胞存活率的影響Figure1 Effect of astragaloside A on viability of SW480 cells detected by CCK-8

黃芪甲苷加藥處理SW480細(xì)胞后第4天，與對照組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量組細(xì)胞增殖倍數(shù)均顯著降低，黃芪甲苷濃度越高，效果越明顯（P低=0.0064； P中=0.0051； P高=0.0023），見圖2。

圖2 CCK-8檢測SW480細(xì)胞增殖Figure2 Proliferation of SW480 cells detected by CCK-8

2.3 黃芪甲苷對細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot進(jìn)一步檢測黃芪甲苷對SW480細(xì)胞中增殖標(biāo)志蛋白的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，黃芪甲苷低劑量組Ki67的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.086），PCNA的表達(dá)水平顯著降低（P=0.0046）。黃芪甲苷中、高劑量組與對照組相比，Ki67（P中=0.0048； P高=0.0021）和PCNA（P中=0.0035； P高=0.0023）的表達(dá)水平均顯著降低，且隨著濃度的增加效果越明顯，見圖3。

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測Ki67和PCNA的表達(dá)Figure3 Expression levels of Ki67 and PCNA detected by Western blot

2.4 黃芪甲苷對SW480細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst染色結(jié)果顯示，對照組中細(xì)胞核呈圓形，且形狀基本一致。在黃芪甲苷加藥組中，可見細(xì)胞核固縮及新月形核，黃芪甲苷高劑量組中甚至出現(xiàn)細(xì)胞核破裂，見圖4A。與對照組相比，黃芪甲苷各劑量組凋亡細(xì)胞比率均顯著升高（P低=0.0082； P中=0.0056； P高=0.0043），且隨著黃芪甲苷濃度的增高，效果越明顯，見圖4B。

2.5 黃芪甲苷對SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測黃芪甲苷對SW480細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，與對照組相比，黃芪甲苷加藥各組細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)顯著降低（P低=0.0089；P中=0.0072； P高=0.0011），Bax（P低=0.0076； P中=0.0062； P高=0.0033）、cleaved caspase-3（P低=0.0069； P中=0.0051； P高=0.0039）和cleaved caspase-9（P低=0.0084； P中=0.0055； P高=0.0049）的表達(dá)水平均顯著升高，并呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5。

3 討論

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已屬中晚期。結(jié)腸癌的治療以手術(shù)為主，化療、放療和射頻消融等作為輔助手段，但中晚期結(jié)腸癌患者生存期和預(yù)后效果均不佳。許多研究顯示，中藥提取物在延長腫瘤生存期、提高患者生活質(zhì)量、增加腫瘤藥物敏感度等方面有著明顯的效果，如雙氫青蒿素可以誘導(dǎo)頭頸癌細(xì)胞周期阻滯[11]。人參中提取出來的天然活性成分，人參皂苷更是被證明有多種癌癥的抑制作用[12]。因而中藥提取物在腫瘤治療中的研究日漸增多。黃芪甲苷是中藥黃芪中提取出的天然化合物，被證實(shí)能通過干擾免疫功能來抑制肺癌細(xì)胞的發(fā)展，還能抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲[13-14]。據(jù)報道，黃芪甲苷能增加結(jié)直腸癌細(xì)胞對順鉑的藥物敏感度和調(diào)控細(xì)胞自噬，為進(jìn)一步探討黃芪甲苷對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用，本文在體外實(shí)驗中檢測黃芪甲苷對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

圖4 Hoechst染色(A)和流式細(xì)胞術(shù)(B)檢測各組SW480細(xì)胞凋亡情況Figure4 Apoptic rates of SW480 cells in each group detected by Hoechst staining(A) and fl ow cytometry(B)

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Figure5 Expression levels of apoptotic-related proteins detected by Western blot

本文首先采用含一系列不同濃度黃芪甲苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，CCK-8檢測黃芪甲苷對SW480細(xì)胞存活的影響。結(jié)果顯示，黃芪甲苷濃度高于20 μmol/L時，細(xì)胞存活率顯著降低，提示黃芪甲苷濃度過高。黃芪甲苷濃度低于20 μmol/L時，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的存活率未見明顯變化，因此后續(xù)實(shí)驗選擇黃芪甲苷的濃度為5 、10和20 μmol/L。

細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)失常是惡性腫瘤細(xì)胞具有無限增殖能力的關(guān)鍵因素。有研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷對多種類型的腫瘤有增殖抑制作用，如肝癌、胃癌和乳腺癌[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞經(jīng)不同濃度黃芪甲苷作用后，細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著降低，且黃芪甲苷對SW480細(xì)胞增殖的抑制作用呈時間和劑量依賴關(guān)系。Ki67為增殖細(xì)胞中核抗原，其表達(dá)量與細(xì)胞分裂密切相關(guān)，是廣泛運(yùn)用的增殖細(xì)胞標(biāo)志之一[18]。增殖細(xì)胞核抗原PCNA是真核生物DNA所必需的蛋白，在S期細(xì)胞中含量最高，PCNA的含量已經(jīng)作為評價腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要手段[19]。大量研究顯示，在結(jié)腸癌實(shí)體瘤中Ki67和PCNA高表達(dá)，抗腫瘤藥物抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖伴隨著PCNA和Ki67表達(dá)水平的下調(diào)[20]。Western blot檢測細(xì)胞中增殖標(biāo)志蛋白Ki67和PCNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SW480細(xì)胞經(jīng)黃芪甲苷作用后，細(xì)胞中Ki67和PCNA的表達(dá)水平顯著降低，間接反映SW480細(xì)胞增殖能力的降低。結(jié)果與CCK-8的結(jié)果一致，表明黃芪甲苷抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖。然而黃芪甲苷抑制SW480細(xì)胞增殖的具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步實(shí)驗探究。

在本研究中，我們用Hoechst染色檢測了暴露于黃芪甲苷的SW480細(xì)胞核的形態(tài)變化和凋亡細(xì)胞的比率。研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷加藥組發(fā)生凋亡的細(xì)胞比率明顯高于對照組，并呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。從形態(tài)學(xué)上觀察，SW480細(xì)胞經(jīng)黃芪甲苷作用后，細(xì)胞核變小、出現(xiàn)核固縮甚至是破碎，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)。同時黃芪甲苷加藥組細(xì)胞中活化的caspase-3和caspase-9的蛋白含量顯著高于SW480組。Caspase的活化是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中不可或缺的部分。在Caspase蛋白家族中，Caspase-9處于上游蛋白酶，通過激活Caspase-3促使凋亡的不可逆轉(zhuǎn)的進(jìn)行[21]。大量研究顯示，活化的Caspase-3蛋白含量增高，酶解下游一系列凋亡抑制蛋白和DNA合成相關(guān)蛋白，加速SW480細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。楊雨等研究顯示，阿托曼黃素通過上調(diào)Caspase-3和β-catenin的表達(dá)，誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡[22]。本實(shí)驗結(jié)果表明，黃芪甲苷能誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡。

人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞經(jīng)黃芪甲苷作用后，細(xì)胞增殖倍數(shù)顯著降低，細(xì)胞增殖標(biāo)志蛋白Ki67和PCNA的表達(dá)水平顯著降低，提示黃芪甲苷抑制SW480細(xì)胞增殖的作用；Hoechst染色顯示，黃芪甲苷作用后的SW480細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加，細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生凋亡性變化，Western blot結(jié)果也顯示細(xì)胞中活化后的caspase-3和caspase-9的表達(dá)顯著上升。綜上所述，黃芪甲苷抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。下一步計劃，構(gòu)建荷瘤小鼠模型，體內(nèi)實(shí)驗檢測黃芪甲苷對結(jié)腸癌增殖和凋亡的影響。