張 凱，刁衛(wèi)平，郭廣君，潘寶貴，戈 偉，劉金兵，王述彬1,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

辣椒(Capsium)起源于美洲熱帶地區(qū)，屬茄科(Solanaceac)，茄亞族(SolaninaeDunal)，辣椒屬(Capsicumspp.)，一年生或多年生草本植物，灌木，半灌木，多分枝，是一種世界性的蔬菜作物。Hunziker(1956)將辣椒屬劃分為22個(gè)野生種和5個(gè)栽培種(C.annuum、C.chinense、C.frutescens、C.baccatum和C.pubescens)[1-2]，其中一年生辣椒C.annuum是全世界種植最為廣泛的栽培種[3]，但由于長(zhǎng)期較高的人工選擇壓力,其遺傳基礎(chǔ)已漸趨狹窄[4-5]。育種上可以利用別的栽培種與一年生辣椒C.annuum進(jìn)行雜交，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)優(yōu)異種內(nèi)基因的轉(zhuǎn)移，拓寬一年生辣椒C.annuum的遺傳基礎(chǔ)，增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。

漿果狀辣椒C.baccatum起源于秘魯，主要分布于拉丁美洲[1]，有很多優(yōu)良抗性性狀，如抗煙草花葉病毒(TMV)，抗黃瓜花葉病毒(CMV)，抗疫病[6]等。灌木辣椒(C.frutescens)以植株高大著稱,植株灌木狀、多年生，限于熱帶和亞熱帶進(jìn)行栽培或野生[7]。灌木辣椒常被作為調(diào)味品種植，果實(shí)多用于制干、腌漬和提煉辣椒油[8]，具有抗曲頂病毒病[9]、卷葉病毒病[10]、白粉病[11]、疫病和黃萎病[12]等多種有利抗病性狀。

有研究表明，一年生辣椒C.annuum與C.frutescens部分親和，兩者相互雜交能得到F1，與C.baccatum完全不親和[13]，兩者相互雜交不能得到F1，最后利用胚拯救的技術(shù)獲得C.annuum和C.baccatum的雜種F1[14]。所以如何實(shí)現(xiàn)一年生辣椒C.annuum和栽培種C.baccatum之間基因的直接轉(zhuǎn)移也顯得尤為迫切。下一步可以利用C.frutescens作為基因橋獲得C.annuum×(C.baccatum×C.frutescens)三元雜種，實(shí)現(xiàn)一年生辣椒C.annuum和栽培種C.baccatum的雜交，進(jìn)而有效改良一年生C.annuum栽培種，提高其產(chǎn)量，改善其品質(zhì)，以及增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和對(duì)病蟲(chóng)害的抗性。Egawa[15]和程志芳[6]等曾經(jīng)進(jìn)行C.baccatum與C.frutescens雜交，正反交均未獲得F1。目前國(guó)內(nèi)暫無(wú)C.baccatum和C.frutescens雜交成功的報(bào)道。本文成功實(shí)現(xiàn)了C.baccatum與C.frutescens雜交并獲得F1，為后續(xù)辣椒育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為具有多種抗性性狀的漿果狀辣椒C.baccatumPI441570和灌木辣椒C.frutescensPI634826。兩者均引自美國(guó)國(guó)家種質(zhì)資源試驗(yàn)室，經(jīng)多代自交純化，上述材料均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種間雜交方法 雜交試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所試驗(yàn)場(chǎng)的塑料大棚內(nèi)進(jìn)行。2017年3月9日定植。在開(kāi)花盛期，5月25～7月15期間，以C.baccatum為母本，C.frutescens為父本，選擇早上8：00～11：00和下午15：30～17：00進(jìn)行雜交試驗(yàn)，使用鑷子去雄雜交、掛牌，授粉后55 d左右收獲成熟果實(shí)。為保證父本花粉的純度，在雜交前1 d下午將父本次日要開(kāi)放的花蕾用醫(yī)用膠布粘住，雜交時(shí)再取下這些花收集新鮮花粉。盡量選擇健壯的母本植株，以提高坐果率。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 2017年7月30日將P1、F1和P2分批播種于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所試驗(yàn)場(chǎng)的大棚內(nèi)，2017年9月5日定植。隨機(jī)選取F1及雙親各8株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察鑒定，包括株高、株幅、葉縱徑、葉橫徑、葉形指數(shù)、葉色、始花節(jié)位、花色、花藥色澤、每節(jié)花數(shù)、花徑、花萼生長(zhǎng)狀態(tài)、果縱徑、果橫徑、果形指數(shù)、主莖色、果實(shí)朝向、幼果色、成熟果色，成熟果重共20個(gè)指標(biāo)。其中葉形指數(shù)=葉縱徑/葉橫徑，果形指數(shù)=果縱徑/果橫徑，具體參照陳學(xué)軍等[16]的方法進(jìn)行。

1.2.3 花粉育性觀察 盛花期時(shí)對(duì)辣椒雜種植株進(jìn)行花粉可染率(1%醋酸洋紅染色)的觀察。隨機(jī)選取盛開(kāi)的親本和雜交F1花3朵,置于載玻片上,滴一小滴醋酸洋紅溶液,輕輕擠壓花藥,置于載玻片上,蓋上蓋玻片,片刻后在顯微鏡下觀察,有活力的花粉被染成紅色，用OLYMPUSBX-51顯微鏡在物鏡40×的標(biāo)準(zhǔn)下觀察拍照，每朵花鏡檢5個(gè)視野，每視野至少觀察50個(gè)花粉粒，最后取平均值。

1.2.4 分子標(biāo)記分析 辣椒DNA提取:本文采用改良的CTAB法[17]提取父母本及F1新鮮幼嫩葉片基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

EST-SSR標(biāo)記分析:利用Ince等[17]用于辣椒種間雜種鑒定的45對(duì)SSR引物對(duì)P1、F1和P2進(jìn)行SSR分析。SSR引物由生工公司合成。PCR總反應(yīng)體積10 μL，其中正、反引物各1μL、DNA 1 μL、Mix 5 μL、ddH2O2μL。Mix、Marker均購(gòu)自TaKara公司，PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃、4 min;94 ℃、30 min，55 ℃、30 min，72 ℃、50min，30個(gè)循環(huán);72 ℃、7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，220 V恒定電壓，跑膠2 h，改良的Charters銀染方法檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種間雜種的獲得

在江蘇南京生態(tài)條件下，春季大棚里C.baccatum和C.frutescens均能正常開(kāi)花結(jié)果，經(jīng)人工去雄雜交，雜交30朵花，授粉后55 d左右，成功獲得4個(gè)C.baccatum和C.frutescen種間雜交成熟果實(shí)，雜交率達(dá)到13.3%。每個(gè)雜交果含有8～10粒種子，種子飽滿不一，F(xiàn)1發(fā)芽率在35%以上。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)親本和雜種F1在生長(zhǎng)期間對(duì)其進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀調(diào)查與比較。根據(jù)植物學(xué)性狀差異，可以將其分為5種類型，如表1所示：(1)雜種優(yōu)勢(shì)型：株高，株幅，每節(jié)花數(shù)，花徑表現(xiàn)超雙親的特性。(2)特異型：果實(shí)重量，果橫徑，果縱徑，果形指數(shù)卻不如雙親。(3)中間型：葉縱徑，葉橫徑，葉形指數(shù)，葉色，主莖色，始花節(jié)位，花色，果縱徑，果實(shí)朝向，青果色澤，熟果色澤都介于雙親之間。(4)偏母型：株高，株幅，葉橫徑，花色，花藥色澤，花徑，青果色澤，花萼明顯程度，偏向母本。(5)偏父型：葉縱徑，葉形指數(shù)，始花節(jié)位，每節(jié)花數(shù)，果重，果橫徑，果縱徑，果形指數(shù)，偏向父本。雜種F1的花形、花瓣的長(zhǎng)寬度、花瓣所帶C.baccatum種特有的嫩黃色具有顯著的中間型特征，表明其雜種的真實(shí)性(圖1、圖2)。

表1 親本及 F1 表型性狀

圖1 P1(C.baccatum PI441570)、P2(C.frutescens PI634826)及其雜種F1花的形態(tài)特征

2.3 花粉育性觀察

利用醋酸洋紅對(duì)親本C.baccatum、C.frutescens以及雜交F1的花粉育性進(jìn)行觀察，如果花粉粒呈現(xiàn)深紅色則說(shuō)明具有活力，呈現(xiàn)淡紅色則表明花粉粒具有部分活力，而無(wú)色空癟、畸形的花粉粒則表明是死的和不育的[18]。按照以上標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，種間雜種F1平均花粉可染率僅為4.9%，而親本C.baccatum和C.frutescens的平均花粉可染率分別為42.0%和87.0%。如圖3所示，根據(jù)鏡檢結(jié)果可以看出，P1和P2雖然花粉數(shù)差不多，但是能被染上色的P1花粉比P2花粉少很多，雜種F1雖然鏡檢花粉很多，但是成功被染上色的最少，說(shuō)明這2個(gè)種之間雜交的困難程度。

2.4 種間雜種的EST-SSR分析

本研究利用45對(duì)EST-SSR引物對(duì)父母本及雜種F1進(jìn)行擴(kuò)增分析，由表2和圖4可知：37對(duì)引物在雙親和F1中擴(kuò)增出清晰條帶總共127條，8對(duì)引物沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，占比17.8%，其中P1、P2和F1共有帶30條，占22.2%，它反映了F1與雙親DNA的同源關(guān)系;F1與母本共有帶6條，占4.4%，F(xiàn)1與父本共有帶20條，占比14.8%。其中6對(duì)引物(Primer ID：AGi009、AGi054、AGI080、AGi086、AGi100、AGi101)的擴(kuò)增的雜種F1譜帶既有母本的特征帶，又有父本的特征帶，擴(kuò)增條帶表現(xiàn)為雙親互補(bǔ)型，進(jìn)一步在分子水平上證明了雜種的真實(shí)性。

3 討論

種間雜交是實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移的有效途徑之一[19-20]。本研究以下垂?jié){果狀辣椒C.baccatum為母本，以灌木C.frutescens為父本，成功實(shí)現(xiàn)了種間雜交并獲得雜種。這是國(guó)內(nèi)首次獲得C.baccatum和C.frutescens種間雜交的報(bào)道,填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)的空白。

圖2 P1 (C. baccatum PI441570)、P2 (C. frutescens PI634826)及其雜種F1 的形態(tài)特征(A：果實(shí)；B：葉)

圖3 P1 (C. baccatum PI441570)、P2 (C. frutescens PI634826) 及其雜種 F1 的花粉活力

引物名稱正向引物(5′→3′)反向引物(5′→3′)AGi009GAGGCTTTTTAGCAGGGTGAGCAGACAACTTCGCATCTACAAGi054CAGTGTGCGATTTTCAACAGGAGCAGAGAGGGTGAGAAGI080TTGGTTTCAATTTTATTTCTCCATTGAAAGATTAAAAACCTGGGTGCTAGi086AGTCCTTGCCGATGTTGAAGGCAGCAGCAGTTAACCATGAAGi100TTCCTTCACACCCACAACCACTTTCTTGGCTTTACCACCAGAGi101TGAGGAGACAAACTTCAACTGGGATGAGGACAAAACCAAGGACT

本文成功實(shí)現(xiàn)了C.baccatum和C.frutescens的雜交，與程志芳等[8]得出的結(jié)果不同，分析其原因可能是：(1)本次試驗(yàn)采用重復(fù)授粉法[21]，第1次授粉將去雄后當(dāng)天開(kāi)放的花朵作為授粉對(duì)象；第2次授粉為第1天授粉過(guò)后、第2天做重復(fù)授粉；第3次授粉為第1天授粉過(guò)后，分別于第2天和第3天做重復(fù)授粉處理。根據(jù)每天的天氣狀況采取合適的時(shí)間段來(lái)授粉。(2)另一個(gè)原因可能因?yàn)楸敬卧囼?yàn)的父母本在江蘇南京環(huán)境下已自交純化連續(xù)種植多年，生長(zhǎng)習(xí)性可能已經(jīng)適應(yīng)這個(gè)環(huán)境。(3)在本試驗(yàn)授粉過(guò)程中，盡量摘除母本植株上自交的果實(shí)，防止自交果實(shí)在營(yíng)養(yǎng)上對(duì)雜交授粉的一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)。

SSR是一種近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的以特異引物PCR為基礎(chǔ)的新型分子標(biāo)記技術(shù)，具有表現(xiàn)為多態(tài)性，共顯性、需要DNA量少[22]。已廣泛應(yīng)用于作物遺傳多樣性、親緣關(guān)系的研究，品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生以及遺傳圖譜和基因定為等研究[23-24]。但普通的SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用較大，從EST數(shù)據(jù)庫(kù)中建立的SSR標(biāo)記更為快捷、經(jīng)濟(jì)，而且通用性好，比較穩(wěn)定和費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。本研究利用EST-SSR對(duì)種間雜種進(jìn)行鑒定，部分EST-SSR引物在父母本及F1的擴(kuò)增結(jié)果表明種間F1具有雙親的共有條帶，顯示其標(biāo)記的共顯性特征，通過(guò)分子手段進(jìn)一步驗(yàn)證了種間雜種的真實(shí)性。

圖4 不同 EST-SSR引物在P1 (C. baccatum PI441570)、P2 (C. frutescens PI634826) 及雜種 F1 的電泳結(jié)果

因此，C.baccatum×C.frutescens種間雜種的獲得，為深入開(kāi)展不同栽培種種間優(yōu)異基因的轉(zhuǎn)移、分子遺傳圖譜構(gòu)建、新材料創(chuàng)制和聚合育種奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，為下一步開(kāi)展C.annuum×(C.baccatum×C.frutescens)三元雜交提供了可能。