張成玲,孫厚俊,趙永強,楊冬靜,徐 振,馬居奎,謝逸萍

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部 甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室,江蘇 徐州 221131)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam]是世界上重要的糧食作物,也是動物飼料、能源及工業(yè)原料的重要原料作物[1-2]。甘薯具有耐旱、耐鹽、耐貧瘠、適應(yīng)性強等特點,在世界上100多個國家或地區(qū)種植。中國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國,年產(chǎn)量占世界甘薯總產(chǎn)量的 75%以上,近幾年隨著甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,種薯、種苗等的頻繁調(diào)運,加重了甘薯病蟲害尤其是病毒病及真菌性病害的發(fā)生和擴展,阻礙了甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

甘薯根腐病是制約我國甘薯生產(chǎn)的三大重要病害之一,是我國北方甘薯生產(chǎn)區(qū)重要的真菌病害,在甘薯苗床和大田期均有發(fā)生[4]。甘薯根腐病菌侵染苗期甘薯后造成死苗、弱苗,侵染大田甘薯后造成植株生長緩慢、葉片黃化脫落、甘薯開花、不結(jié)薯塊或薯塊小而少等。一般田塊發(fā)病后減產(chǎn)10%～20%,危害嚴重的達50%,甚至絕收,對甘薯的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)威脅極大[5-7]。常見甘薯根腐病病原為茄病鐮孢菌甘薯?；蚚Fusariumsolani(Mart) sacc. f. sp.batatasMeClure,簡稱FSB],也是報道最早、最為常見的一種病原。除茄病鐮孢菌甘薯?；屯?尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)、爪哇鐮孢(F.javanicumKoord)及其根生變種(F.javanicumvar.radicicola)、串珠鐮孢菌(F.moniliforme)、腐霉菌(Pythiumultimum)等均能侵染甘薯引起甘薯根腐病[8-11]。

不同地區(qū)甘薯根腐病病菌的優(yōu)勢菌群不同,因此為了明確江蘇省徐州市甘薯根腐病病原菌的優(yōu)勢菌株,本研究采集徐州市發(fā)病薯苗薯塊,利用組織分離法獲得病原菌,在室內(nèi)測定了8種殺菌劑對其菌絲生長的抑制活性,旨在了解這些藥劑對鐮刀菌屬真菌的抑制活性及作用特點,同時,結(jié)合大田藥效試驗篩選高效防治該類病害的藥劑。

1 材料與方法

1.1 病原菌采集及分子鑒定

1.1.1 病原菌的分離和純化 2013年和2017年于江蘇徐州甘薯研究中心試驗基地采集甘薯莖部為褐色、凹陷、縱裂、皮下組織疏松等典型甘薯根腐病病斑的樣品(圖1a),按常規(guī)組織分離法[12],采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板在25 ℃條件下進行病原分離培養(yǎng),利用柯赫氏法則(Koch’s rule)驗證病原菌。

1.1.2 病原菌的鑒定 將純化的病原菌接種到PDA培養(yǎng)基平板上,在25 ℃、每天12 h黑暗(或光照)的條件下培養(yǎng),觀察菌落及孢子形態(tài)。

將病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中,在25 ℃、125 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5～7 d,過濾收集菌絲體用于DNA提取。采用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,北京)獲得菌體的總DNA。利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對病原菌的rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增[13]。PCR產(chǎn)物送交生工生物工程(上海)有限公司進行測序,利用DNAstar等軟件進行分析,通過GenBank數(shù)據(jù)庫(www. ncbi.nlm. nih. gov)進行BLAST比對,利用MEGA6軟件[14]中的鄰接法(Neighbour-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2 防治藥劑的篩選

1.2.1 供試藥劑 本研究所用藥劑如下:50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑(WP,江蘇省蘇州富美實植物保護有限公司);1000億個/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(WP,中國農(nóng)科院植保所廊坊農(nóng)藥中試廠);50%二氯異氰尿酸鈉可溶性粉劑(SG,山東省曲阜市爾福農(nóng)藥廠)；80%代森錳鋅可濕性粉劑(WP,利民化工股份有限公司);40%腈菌唑可濕性粉劑(WP,美國陶氏益農(nóng)公司);40%菌核凈可濕性粉劑(WP,山東恒利達生物科技有限公司);50%苯菌靈可濕性粉劑(WP,江蘇藍豐生物化工股份有限公司);97%噁菌靈原藥(TG,濰坊華諾生物科技有限公司)。對這8種藥劑進行室內(nèi)藥劑篩選研究,對前3種藥劑同時進行田間防治效果試驗。

1.2.2 測定方法及數(shù)據(jù)分析 利用菌絲生長速率法測定8種藥劑的室內(nèi)毒力。將PDA培養(yǎng)基完全融化后,冷卻到45 ℃左右,分別配成含藥量為1、10、100、1000 μg/mL的含藥培養(yǎng)基,搖勻后倒入直徑9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中,每皿15 mL,每個濃度處理重復(fù)3次,并設(shè)清水對照。用直徑為5 mm的打孔器將活化好的供試菌種打取菌餅接入含藥培養(yǎng)基平板中央,置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后,對照培養(yǎng)皿內(nèi)菌絲長滿前,用十字交叉法測量菌落直徑。

田間試驗于2016～2017年6～10月在江蘇省徐州市邳州市港上鎮(zhèn)甘薯田進行,試驗品種為沖繩100。試驗田土壤質(zhì)地為沙壤土,試驗地每年僅種植一茬甘薯,連續(xù)種植多年。試驗每處理設(shè)置3個重復(fù),每個重復(fù)20株,共60株,在田間采用“Z”字形間隔排列。在栽種封穴前澆灌施藥,栽種時第一次施藥,此后每間隔10 d噴施1次,連續(xù)施藥3次。其他管理措施統(tǒng)一按常規(guī)栽培要求。在施藥后40 d和收獲時分別調(diào)查甘薯根腐病的發(fā)病情況[15-16]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 用下式計算菌絲相對抑制率:相對抑制率(%)=(對照菌落平均直徑-處理菌落平均直徑)/對照菌落平均直徑×100。利用Excel及DPS軟件進行統(tǒng)計分析,計算毒力回歸方程、菌絲生長抑制中濃度(EC50)、EC90、置信區(qū)間及相關(guān)系數(shù)(R) 。田間實驗計算病情指數(shù)，公式如下：病情指數(shù)(%)=∑(病級值×病級對應(yīng)株數(shù))/(最高病級值×處理總株數(shù))×100。用DPS 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

2013年和2017年從發(fā)病甘薯樣品中分離病原菌,經(jīng)單孢純化后接種到甘薯薯苗上,用柯赫氏法則(Koch’s rule)驗證 (圖1b)后,得到30個致病菌株。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)初期正面產(chǎn)生白色至淡黃色絨毛狀菌絲,后期菌絲變?yōu)榉奂t色,少數(shù)為白色；培養(yǎng)6 d后菌落直徑為58～68 mm。在顯微鏡下觀察,30個分離物均產(chǎn)生兩種不同的分生孢子,一類大型分生孢子鐮刀形,稍彎曲,頂端略尖,分隔數(shù)多為3個，小型分生孢子橢圓形、腎形到矩圓形等,多為單細胞,占總分離物的56.7%；另一類大型孢子鐮刀形,3～5個分隔,稍彎曲,兩端鈍，小型分生孢子橢圓形,0～1個分隔,占總分離物的40%。依據(jù)Leslie等文獻[13]將其鑒定為鐮孢菌(Fusariumspp.)。

將培養(yǎng)性狀及孢子一致且分離頻率最高的13-GF、17-GF1、17-GF2和17-GF3這4個菌株進行分子鑒定。利用ITS1和ITS4引物對擴增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到550 bp左右的條帶,經(jīng)測序后分別獲得了544、535、568和568 bp的序列,核苷酸一致率為88%～100%。經(jīng)NCBI比對,13-GF和17-GF1與Genbank中登錄號為MG356946的尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)的核苷酸一致率最高,分別達到100%和97.98%；而17-GF2和17-GF3分別與MK418649的茄病鐮孢菌(F.solani)的核苷酸一致率最高,均為100%。以甘薯長喙殼菌(Ceratocystisfimbriata)為外圍,對與4個菌株核苷酸一致率較高的菌株rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,分為兩個組,13-GF和17-GF1位于尖孢鐮孢菌組,結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定為尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)；17-GF2和17-GF3位于茄病鐮孢菌組,結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定為茄病鐮孢菌(F.solani)(圖2)。

圖1 甘薯根腐病的田間癥狀(a)及回接40 d后的癥狀(b)

圖2 基于ITS基因的甘薯根腐病病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 防治藥劑的篩選

以分離頻率最高的尖孢鐮孢菌17-GF1為參試菌株進行室內(nèi)藥劑篩選，結(jié)果表明,供試的8種藥劑均對甘薯根腐病病菌菌絲的生長表現(xiàn)出一定的抑制作用,但不同殺菌劑或同一殺菌劑的不同濃度具有不同的殺菌效果(圖3)。具體來說，在低濃度下,50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑和1000億個/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對甘薯根腐病菌17-GF1的室內(nèi)抑制效果居前2位,1 μg/mL的防效均達到50%以上,分別為74.70%和72.26%,其EC50分別為0.0095 μg/mL和0.0001 μg/mL；此外，50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑的EC90較低，為275.31 μg/mL(圖3、表1)，而1000億個/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的EC90較高,為1.77×106μg/mL(表 1)。50%二氯異氰尿酸鈉可溶性粉劑、40%菌核凈可濕性粉劑和50%苯菌靈可濕性粉劑低濃度的抑制效果較差,但濃度達到1000 μg/mL時抑制率均為92.70%,且EC50值較高。80%代森錳鋅可濕性粉劑整體抑制效果較差,抑制率為16.79%～36.74%。

圖3 不同殺菌劑在4個濃度下對甘薯根腐病病菌的菌絲生長抑制率

藥劑毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)EC50/(μg/mL)平均95%置信區(qū)間EC90/(μg/mL)平均95%置信區(qū)間咪鮮胺錳鹽y=5.5810+0.2871x0.95950.00950.00030.30275.3170.121081.03枯草芽孢桿菌y=5.5361+0.1193x0.91980.00018.02×10-90.131.77×1062309.221.35×109二氯異氰尿酸鈉y=3.8541+0.7211x0.895438.826.61227.922323.8075.0171993.75代森錳鋅y=3.9931+0.2301x0.959723718.741325.974.24×1058.78×1093.056×1062.522×1013腈菌唑y=4.8181+0.3735x0.96583.070.8411.178281.69846.1581057.77菌核凈y=3.8312+0.9841x0.963315.415.4843.27308.9481.831166.34苯菌靈y=3.5263+1.0353x0.969226.5110.6865.81458.42123.961695.37噁霉靈y=3.2040+0.8351x0.9619141.4643.75457.404844.35522.5344911.78

栽種后40 d調(diào)查甘薯苗期根腐病的發(fā)生情況,結(jié)果表明：各個藥劑處理甘薯苗期根腐病的病情指數(shù)均低于清水對照的,其中施用50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑的效果最好,病情指數(shù)最低,為27.92%,與對照差異顯著。收獲時的調(diào)查結(jié)果表明：1000億個/g枯草芽孢桿菌的防效最好,與對照差異顯著；其余兩個處理之間防效無顯著性差異(表2)。收獲時調(diào)查發(fā)現(xiàn),所有處理的發(fā)病植株占100%,僅發(fā)病程度不同。

表2 栽種40 d和收獲時甘薯根腐病的病情指數(shù)

3 討論

甘薯根腐病是由多種病原菌引起的,且不同病原菌之間存在致病差異性[9],因此在不同地區(qū)甘薯根腐病菌有不同的優(yōu)勢種群。銀鈴等[11]從內(nèi)蒙古根腐病樣中分離獲得了45個腐霉菌株,其中43個菌株被鑒定為終極腐霉(P.ultimumvar.ultimum)。1924年Harter報道了美國新澤西、馬里蘭等地區(qū)甘薯苗期根腐病是由腐霉菌引起的[17]。Scruggs等發(fā)現(xiàn)美國北卡羅來納州貯藏期甘薯根腐病是由6種鐮刀菌引起的,其中茄病鐮孢菌是主要的一種病原菌[18]。李凌燕等[10]發(fā)現(xiàn)北京大興甘薯根腐病是由尖孢鐮孢菌引起的。準確鑒定病原菌種類,明確病菌的優(yōu)勢種群對了解當?shù)夭『α餍幸?guī)律及有效防控該病害、培育當?shù)乜剐云贩N具有重要意義[18-19]。本研究通過2013年和2017年甘薯根腐病鑒定,發(fā)現(xiàn)徐州市甘薯根腐病病原主要為尖孢鐮孢菌,其次為茄病鐮孢菌,并且兩年兩種病原菌種類所占比例幾乎沒有發(fā)生變化。

尖孢鐮孢菌普遍存在于自然界中,是重要的土傳病害,也是多種作物的重要致病菌[19-21]。對鐮刀菌的防治研究主要集中在生物控制[22-23],在實際病害防治應(yīng)用中,一般使用化學(xué)藥劑。趙永強等[24]采用生長速率法測定了6種生物源殺菌劑對甘薯根腐病菌的室內(nèi)抑菌毒力,認為四霉素和中生菌素在甘薯根腐病防治中具有較高的潛力。馬志民等[25]的研究表明,施用鉀肥可以降低甘薯根腐病的病情指數(shù),明顯提高防治效果,但當硫酸鉀濃度超過2 mg/L時會抑制甘薯根系的發(fā)育。本研究通過室內(nèi)篩選8種藥劑防治甘薯根腐病,發(fā)現(xiàn)咪鮮胺錳鹽和枯草芽孢桿菌對甘薯根腐病菌的室內(nèi)抑制效果居前2位，1 μg/mL的防效即可達到50%以上,且其EC50值低,分別為0.0095 μg/mL和0.0001 μg/mL。栽種后40 d田間調(diào)查結(jié)果表明,咪鮮胺錳鹽的施用效果最好,病情指數(shù)最低；在收獲時,枯草芽孢桿菌的防效最好,但與對照差異不顯著；但是這幾種藥劑對甘薯根腐病的持久防治效果不明顯,收獲時發(fā)病植株均達到100%。因此，在實際生產(chǎn)中可考慮增施有機肥料來提高甘薯的抗性,同時采用兩種及以上藥劑的復(fù)配,與生物防治菌劑搭配使用,從而達到持續(xù)有效防治的目的。