張 禹，張 韻，孫世琪，馬小軍，張小麗*，郭慧琛*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜病病原生物學(xué)國家重點實驗室/OIE/國家口蹄疫參考實驗室，甘肅蘭州730046)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)為單鏈、環(huán)狀DNA病毒[1]，包括無致病性的PCV1型(PCV1)和有致病性的PCV2型(PCV2)[2]。PCV2不僅引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)，還與豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、增生性壞死性肺炎(PNP)以及繁殖障礙等疾病的發(fā)生有關(guān)[3]，是對豬群危害較嚴(yán)重的一種病原[4]。為了有效控制該疫病的暴發(fā)，盡可能降低經(jīng)濟損失，大多數(shù)發(fā)展中國家采取強制免疫措施。為準(zhǔn)確評價免疫效果，目前國際上多采用病毒中和試驗(VNT)和液相阻斷ELISA(LPB-ELISA)[5]等方法檢測免疫畜群的抗體效價。雖然這些檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但技術(shù)要求高、耗時長，在基層推廣有一定難度。近年來國內(nèi)市場上出現(xiàn)一些利用單一抗原位點的表達蛋白或線性的表位肽作為標(biāo)記檢測抗原的PCV2抗體快速檢測免疫層析試紙條[6-7]，均具有操作方便，特異性好的優(yōu)點，但該方法很難涵蓋所有的流行病毒株抗原表位，常導(dǎo)致檢測抗體水平與實際免疫情況不符合[8]。

病毒樣顆粒(VLPs)是由病毒的衣殼蛋白形成的空心顆粒，具有和天然病毒粒子相同或相似的形態(tài)，但不含病毒遺傳物質(zhì)，不能自主復(fù)制，粒徑大小均一，自身具有佐劑的特性，更容易刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答[9-10]，相對于滅活病毒和以Cap蛋白為基礎(chǔ)的亞基而言，VLPs具有更強的免疫原性和更高的生物安全性[11]，為準(zhǔn)確評估豬群的免疫狀態(tài)，制定合理有效的免疫方案，本實驗用純化組裝的PCV2 VLPs作為抗原，研制了PCV2抗體的金標(biāo)檢測層析試紙條，用于PCV2型疫苗的免疫效果評價，對于及時進行疫苗補種和預(yù)防PCV非常有利。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 BSA購自Roche公司；氯金酸購自上海國藥公司；G蛋白購自Sigma公司；硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維膜、吸水紙、PVC板、包裝外殼均購自GE公司；微電腦自動斬切機及XYZ三維劃膜噴金儀均購自上海金標(biāo)生物公司；PCV2抗體ELISA檢測試劑盒購自荷蘭賽迪公司。兔IgG、PCV 2抗體陽性血清、陰性血清及A型塞內(nèi)卡病毒(SVA)、豬細小病毒(PPV)、偽狂犬病毒(PRV)和O型口蹄疫病毒(FMDV)抗體陽性血清由中農(nóng)威特股份有限公司、國家口蹄疫參考實驗室以及本實驗室提供。100份臨床PCV 2血清樣本采集自甘肅省平?jīng)鍪星f浪鄉(xiāng)某豬場。

1.2 PCV2 VLPs的制備與鑒定 將本實驗室制備保存的psKM-Cap/BL21(DE3)陽性克隆菌株[12]在含Can+、Amp+、Chl+培養(yǎng)基中按 1∶100 接種，培養(yǎng)至菌液OD600nm值為0.6～0.8，向菌液中加入終濃度為1 mmol/L的誘導(dǎo)劑(IPTG)，在18℃條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)16 h，將菌液收集到離心瓶中4 000 r/min離心30 min，之后用10 mL～20 mL冰浴處理的buffer A(20 mmol/L Tris-HCl， 500 mmol/L NaCl， 5 mmol/L Imidazol，pH8.0)重懸細菌沉淀，冰上超聲破碎菌體細胞。在4℃下，將超聲后裂解菌液12 000 r/min離心20 min取上清后利用鎳親和層析樹脂柱純化，然后將收集的純化蛋白裝入透析袋中，置于1 L的酶切緩沖液(40 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、1 mmol/L CaCl2、pH7.4)中，在磁力攪拌器上輕微旋轉(zhuǎn)，4℃過夜。切除SUMO標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)蛋白自行組裝為VLPs。取蔗糖密度梯度離心后的25 μg樣品，室溫吸附到碳膜包被的銅網(wǎng)上2.5 min，濾紙除去銅網(wǎng)上多余液體，用2%～3%的磷鎢酸負染5 min后，濾紙除去多余液體后，使用透射電鏡(TEM)分析鑒定VLPs。

1.3 膠體金的制備及質(zhì)量檢測 用檸檬酸三鈉還原法[13]制備的膠體金通過紫外分光光度計全波長掃描，確定其最大吸收峰(λmax)；利用TEM觀察制備的膠體金，觀察膠體金粒徑及分布情況。

1.4 膠體金溶液最適pH與G蛋白最適標(biāo)記量的選擇 用0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金pH至6.5、7.5、8.5、9.5，置于振蕩器上充分混勻后再加入濃度為1 mg/mL的G蛋白20 μL，混合均勻，靜置5 min后各加入200 μL 10%NaCl溶液，充分混勻，室溫靜置10 min，不穩(wěn)定的膠體金聚沉變色，膠體金顏色不發(fā)生明顯變化者的pH即為最佳pH。

取8只1.5 mL的EP管，各加入1 mL調(diào)節(jié)為最佳pH的膠體金溶液，之后每管分別加入1 mg/mL的 0、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL G蛋白混合均勻，室溫靜置10 min后加入10%的NaCl溶液200 μL，室溫靜置10 min，觀察顯色情況，G蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金溶液的各孔出現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象，而G蛋白量達到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紫紅色不變，選擇顏色沒有發(fā)生變化的最低G蛋白的孔為其最佳標(biāo)記量。

1.5 免疫膠體金的制備 取調(diào)節(jié)為最佳pH的膠體金溶液1 mL，按最佳標(biāo)記量加入G蛋白，磁力攪拌10 min，加入10%BSA至終濃度為1%，磁力攪拌10 min。將制備好的免疫膠體金溶液10 000 r/min離心30 min，將沉淀用金膠緩沖液重懸，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCV2抗體檢測試紙條的制備及最佳蛋白包被量的確定 將標(biāo)記的膠體金用噴膜儀噴涂于玻璃纖維紙上，37℃干燥，制成金標(biāo)墊。純化的VLPs與兔IgG分別稀釋至終濃度1.2 mg/mL、1 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL，再用噴膜儀噴于NC膜的不同區(qū)域分別作為T帶與C帶。干燥后封閉，再干燥。將制備好的NC膜、金標(biāo)墊與樣品墊、吸收墊按順序裝配，裁成寬度為2.5 mm的條狀，即制成PCV2抗體金標(biāo)檢測試紙條。對PCV2抗體陽性血清以及陰性血清進行檢測，根據(jù)結(jié)果選擇NC膜T帶與C帶的最佳蛋白包被量。

1.7 PCV2血清檢測及結(jié)果判定 將待檢血清50倍稀釋后吸取40 μL樣品滴在檢測試紙條上靜置5 min后觀察結(jié)果。若C帶與T帶均出現(xiàn)清晰可見紅色條帶，則結(jié)果為陽性(根據(jù)T帶紅色的深淺不同，可分為強陽性、陽性、弱陽性)；若僅C帶出現(xiàn)清晰可見紅色條帶，則結(jié)果為陰性；若C帶不出現(xiàn)紅色條帶，則試紙條無效。

1.8 特異性試驗 用制備的PCV2抗體檢測試紙條檢測PCV2抗體陽性血清10份、陰性血清5份以及SVA、PPV、PRV和O型FMDV抗體陽性血清各3份，根據(jù)顯色結(jié)果觀察該試紙條的特異性反應(yīng)以及與其它動物病毒的交叉反應(yīng)性，分析該方法特異性。在不同的時間重復(fù)3次。

1.9 敏感性試驗 將PCV2抗體陽性血清50倍稀釋，再2倍倍比稀釋至1∶50～1∶25 600后滴在制備好的PCV2抗體檢測試紙條上，室溫靜置5 min，觀察并判定結(jié)果以確定該試紙條的敏感性。

1.10 重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗 制備PCV2抗體檢測試紙條3批，批號分別為：201807、201808、201809。利用其檢測不同效價的30份PCV 2血清，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。根據(jù)各個樣品的批間、批內(nèi)變異系數(shù)確定該試紙條是否具有良好的重復(fù)性，同時將該試紙條置于4℃保存6個月，每隔30 d檢測PCV2抗體陽性及陰性血清，每次檢測重復(fù)3次，以確定不同保存期內(nèi)試紙條的穩(wěn)定性。

1.11 符合率試驗 利用制備的PCV2抗體檢測試紙條檢測100份臨床采集的PCV2血清樣本，與PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒的檢測結(jié)果相比較，并計算試紙條與ELISA試劑盒兩種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 PCV2 VLPs的制備與鑒定 將純化的Cap蛋白在酶切緩沖液中自行酶切、組裝，通過蔗糖密度梯度離心經(jīng)磷鎢酸負染后透射電鏡觀察。結(jié)果顯示經(jīng)TEM分析所制備的VLPs粒徑為20±1 nm。表明制備的VLPs效果良好，與預(yù)期結(jié)果相符合。

2.2 膠體金的制備及質(zhì)量檢測 用檸檬酸三鈉還原法制備的膠體金用分光光度計全波長掃描。結(jié)果顯示，膠體金最大吸光值(Amax)為0.892，最大吸收峰位于(λmax)為520 nm(圖1)，表明制備的膠體金符合標(biāo)記用膠體金的要求。

用TEM分析制備的膠體金。結(jié)果顯示，所制備的膠體金粒徑為20±1 nm，形狀規(guī)則，分布均勻(圖2)。表明制備的膠體金符合使用要求。

圖1 膠體金的分光光度計掃描結(jié)果Fig.1 Spectrophotometer scan results of colloidal gold

圖2 膠體金電鏡掃描結(jié)果Fig.2 Transmission electron microscopy result of colloidal gold

2.3 膠體金溶液最佳pH值與G蛋白最適標(biāo)記量的選擇 用0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)不同pH值的膠體金，結(jié)果顯示，在pH為7.5時膠體金顏色不發(fā)生明顯變化，表明膠體金溶液最適pH為7.5；最適蛋白標(biāo)記量試驗結(jié)果見表1，將各管膠體金溶液中分別加入不同濃度的G蛋白、再加入10%NaCl溶液后，室溫反應(yīng) 10 min，結(jié)果顯示 10 μL/管(10 μg)是膠體金溶液顏色保持紫紅色不變的最低蛋白用量，表明1 mL膠體金加10 μL 1 mg/mL的G蛋白應(yīng)為最佳的標(biāo)記量。

表1 G蛋白與膠體金最佳標(biāo)記量的選擇Table 1 Selection of optimal labeling concentration of Protein G and colloidal gold

2.4 PCV2抗體檢測試紙條的制備及最佳蛋白包被量的確定 經(jīng)不同濃度的篩選結(jié)果顯示，采用濃度為0.8 mg/mL的VLPs和1 mg/mL的兔IgG分別做為T線和C線，檢測PCV 2抗體陽性血清，結(jié)果顯示T線和C線均出現(xiàn)紫紅色條帶，無拖尾現(xiàn)象，檢測陰性血清時，T線不顯色。表明該包被量下PCV2檢測試紙條達到了最佳檢測條件。

2.5 特異性試驗結(jié)果 利用制備的試紙條對PCV2、SVA、PPV、PRV和O型FMDV抗體陽性血清進行特異性交叉試驗。結(jié)果顯示僅PCV2抗體陽性血清呈陽性反應(yīng)，而PCV2陰性血清及其它病毒血清均呈陰性反應(yīng)(圖3)。表明該試紙條與其它病毒不存在交叉反應(yīng)，特異性較強。

圖3 試紙條特異性試驗Fig.3 Specificity of the immunochromatographic strip test

2.6 敏感性試驗結(jié)果 利用本實驗建立的膠體金試紙條檢測2倍倍比稀釋的PCV2抗體陽性血清，結(jié)果顯示將其稀釋至1∶6 400時仍能夠檢出，而稀釋至1∶12 800時則呈陰性(圖4)。表明該試紙條有較高的敏感性。

圖4 試紙條敏感性試驗Fig.4 Sensitivity of the immunochromatographic strip test

2.7 重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗結(jié)果 選取不同效價的PCV2血清30份，用3批試紙條分別進行批內(nèi)、批間重復(fù)性檢測。結(jié)果顯示30份血清重復(fù)測定9次，批內(nèi)、批間變異系數(shù)CV均小于5%，批次間變異程度低；4°保存6個月，其特異性和敏感性無任何變化(表2)。表明制備的試紙條重復(fù)性及穩(wěn)定性較好。

表2 3批試紙條重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2 Repeatability test results of three batches

2.8 符合率試驗結(jié)果 用制備的PCV2抗體檢測試紙條檢測100份臨床采集的血清樣本，與荷蘭賽迪PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒的檢測結(jié)果比較，經(jīng)計算，PCV2試紙條與ELISA試劑盒的符合率為98%(表3)。表明制備的試紙條與ELISA方法相關(guān)性較好，可以用于臨床樣品的檢測。

3 討論

宋萬杰等將去除N端信號肽的Cap截短蛋白(PCV2 dcap)和其單克隆抗體分別噴涂于T線和C線上制備的PCV2抗體檢測試紙與ELISA的符合率為99.58%，二者一致性較高，但其敏感性略低[14]。Jin等用膠體金標(biāo)記PCV2重組Cap蛋白后制備金標(biāo)墊，T線和C線分別是葡萄球菌蛋白A和純化的豬抗PCV2抗體，研制成PCV2抗體檢測試紙條，能夠用于PCV2抗體的現(xiàn)場檢測[15]。張文通等分別以重組PCV2 ORF2蛋白和豬IgG作為檢測線和質(zhì)控線，制作了PCV2抗體檢測膠體金免疫層析試紙條，其特異性較強但敏感性偏低[16]而本研究將Cap結(jié)構(gòu)蛋白組裝為完整的VLPs，作為試紙條檢測抗原，不僅克服傳統(tǒng)層析方法中純化病毒造成的生物安全風(fēng)險，而且與抗原肽或病毒蛋白相比，VLPs作為檢測抗原擴大了檢測抗原譜，盡可能多的涵蓋了抗原位點，減少漏檢，使得免疫評價效果更加準(zhǔn)確，可靠，更能客觀準(zhǔn)確的反應(yīng)抗體的實際水平。

表3 金標(biāo)試紙條和ELISA方法對100份血清樣品的檢測結(jié)果Table 3 Test results of 100 serum samples by colloidal gold test strip and ELISA method

本研究制備的PCV2抗體金標(biāo)層析試紙條檢測PCV2抗體陽性血清時，將其稀釋至1∶6 400時還能檢出，說明其敏感性較高；通過對常見豬源SVA、PPV、PRV、O型FMDV及PCV2抗體陽性豬血清檢測，表明制備的膠體金試紙條特異性較強。試紙條在4℃保存6個月，其特異性和敏感性無明顯變化。本研究將臨床采集的血清用試紙條和ELISA方法同時進行檢測，結(jié)果證實二者具有較高的符合率，達到98%。該方法操作簡便，具有更好的安全性、良好的反應(yīng)性，以及更高的靈敏度及特異性，可以廣泛應(yīng)用于基層。