常佳偉，萬佳宏，王 曈，陳 程，王桂琴

(寧夏大學農(nóng)學院，寧夏銀川750021)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是革蘭氏陽性菌，可以引起人和動物感染化膿性疾病及毒素性疾病。S.aureus能夠附著在一些醫(yī)用器材上和宿主組織中，建立成熟的生物被膜(Bacterial biofilm，BF)，從而引起持續(xù)性感染。細菌生物被膜一旦形成，不僅保護細菌免受宿主吞噬細胞的殺傷作用，而且對抗菌藥物的耐藥性增強，同時細菌對低氧、低營養(yǎng)環(huán)境的耐受性也增強，這是細菌適應(yīng)環(huán)境的一種自我保護形式，使對其的臨床治療變得更加困難。所以，研究S.aureus生物被膜的形成及調(diào)控機制，對預防與治療S.aureus引起的感染具有重大意義。

1 細菌生物被膜的概念及形成過程

生物被膜是指細菌在生長過程中，其細胞及其分泌的多種蛋白質(zhì)、多糖等胞外多聚物(Extracellular Polymeric Substance，EPS)及細胞外DNA(eDNA)粘聚在一起，形成膜狀物質(zhì)的細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)包裹在細菌的表面，并附著在生物及非生物表面[1]。細菌生物被膜的形成是由多種因素共同調(diào)控的，它的形成、聚集、解離是一個動態(tài)變化(圖1)[2]。細菌從浮游狀態(tài)到生物被膜的產(chǎn)生，主要分為5個階段：第一階段是可逆的附著：細菌通過非特異性的靜電、范德華力、空間相互作用可逆的附著在機體表面；第二階段稱為不可逆的黏附定植：即浮游細菌經(jīng)過可逆的黏附階段，并逃避了宿主的清除后，產(chǎn)生一些相關(guān)蛋白及聚集因子，使其能夠牢固的黏附在機體上[3]；第三階段為結(jié)構(gòu)分化：細菌經(jīng)過附著與黏附后形成一些微小菌落，在細菌某些基因的表達下，使包裹在其外部的菌落結(jié)構(gòu)分化；第四階段是生物被膜的成熟發(fā)展：細菌通過細胞分裂并與細胞外基質(zhì)相互作用，使細菌生物被膜形成緊密相連的、多層次的三維蘑菇狀結(jié)構(gòu)[4]；第五階段為解聚再定植：細菌生物被膜不斷增厚后，在特定基因的調(diào)控或外界因素的影響下，生物被膜內(nèi)的細胞解聚，又重新回到浮游狀態(tài)，再定植在其它的部位，從而形成一個循環(huán)過程[5]。

圖1 S.aureus生物被膜形成示意圖

2 S.aureus生物被膜的形成機制

S.aureus生物被膜的結(jié)構(gòu)非常復雜，它的形成機制也很復雜，是由多種因素及多種基因共同調(diào)控的，并不是單一因素直接作用而形成。其主要是由多糖細胞間粘附素(PIA)依賴機制、相關(guān)蛋白依賴機制、eDNA共同作用的。

2.1 PIA依賴機制 細菌生物被膜基質(zhì)的主要成分是PIA，后者由β-1，6-連接的N-乙酰葡糖胺聚合物組成，也稱為聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)[6]。PIA聚合物在生物被膜的結(jié)構(gòu)完整性中具有重要作用，并且其合成及修飾是由ica基因座編碼的蛋白質(zhì)所調(diào)控。ica包含4個功能基因(icaA、icaB、icaC、icaD)和1個調(diào)節(jié)基因(icaR)，ica基因編碼的蛋白質(zhì)含有PIA糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，icaD與icaA基因編碼的蛋白協(xié)同增強糖基轉(zhuǎn)移酶的活性[2]，icaB基因編碼外分泌蛋白，是去乙?；?，若失去icaB，PIA/PNAG被乙?；?，就不能形成生物被膜[7]，icaC編碼的蛋白質(zhì)參與多糖粘附因子的糖鏈修飾，并合成長鏈多糖，使之具有生物學功能[8]。icaR是一種阻遏基因，其與icaA啟動子區(qū)域結(jié)合并且負調(diào)控ica的表達，有研究顯示，當敲除icaR后，能夠顯著增加細菌ica操縱子的表達及PIA生成[1]。

2.2 相關(guān)蛋白依賴機制 盡管ica編碼的蛋白調(diào)控PIA的合成是生物被膜形成的重要機制，但越來越多的研究表明細菌表面蛋白以獨立于ica依賴的機制介導附著、促進細胞間粘附及生物被膜的積累與成熟。S.aureus表達28種表面蛋白，從牛乳房炎中分離出來的S.aureus生物被膜相關(guān)蛋白(Bap)、表皮葡萄球菌中分離出的積累相關(guān)蛋白(Aap)及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)中發(fā)現(xiàn)的纖連結(jié)合蛋白(FnBPs)，均可以介導生物被膜的形成[9]。此外，S.aureus的胞外粘附蛋白(Eap)、細胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白(Emp)、表面決定簇蛋白C(IsdC)及細胞黏附素聚集因子(Clf A、Clf B）也參與生物被膜的形成。

纖維結(jié)合蛋白(FnBPs)促進MRSA菌株生物被膜的形成，F(xiàn)nBPA和FnBPB均具有N末端A結(jié)構(gòu)域，其與凝聚因子ClfA、表皮葡萄球菌SdrG蛋白在結(jié)構(gòu)、功能上具有相關(guān)性，并在A結(jié)構(gòu)域的N2和N3末端通過DLL(dock、lock、latch)機制的變化與纖維蛋白原相結(jié)合，形成高度穩(wěn)定的復合物，纖維蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域是一個無序的串聯(lián)重復序列，F(xiàn)nBPA介導的S.aureus生物被膜在N末端A結(jié)構(gòu)域的N2和N3亞結(jié)構(gòu)域形成，DLL機制不參與生物被膜的累積(圖2)[10]。

圖2 S.aurcusFnBPA蛋白的示意圖

Bap依賴的S.aureus生物被膜最初在牛乳房炎中檢測到，但從未在人的分離菌株中檢測到，Bap通過獨立于胞外多糖的機制促進細菌初始附著到生物及非生物表面。Bap是具有多結(jié)構(gòu)域特征的表面蛋白且含2 276個氨基酸和86個殘基序列的13個重復序列[11]。N末端結(jié)構(gòu)域(819個氨基酸)包含細胞外分泌的信號序列，且大部分不含重復序列；核心結(jié)構(gòu)域(aa820～aa2148)由86個氨基酸序列(C重復序列)的串聯(lián)重復序列組成，有預測這些C重復會折疊成新的結(jié)構(gòu)參與細胞粘附，在這個長重復序列區(qū)域Bap富含絲氨酸和天冬氨酸殘基序列片段，其與葡萄球菌表面蛋白Sdr家族的SD重復序列具有同源性。Bap的C末端含有典型的細胞壁附著區(qū)域，其包含LPETG基序(圖3)[12]。Taglialegna等研究表明，Bap的N末端區(qū)域被釋放到細胞外介質(zhì)中并組裝成類淀粉樣纖維，而C末端重復區(qū)域的一部分錨定在被膜中，在感染過程中，Bap通過增強對上皮細胞的粘附來促進在乳腺中的持久性，并與宿主受體結(jié)合阻止細胞內(nèi)化，從而干擾FnBPs介導的侵入途徑[13]。這表明Bap具有雙重作用：一方面介導細菌與細菌之間的相互作用，另一方面介導細菌與宿主之間的相互作用。

圖3 S.aureusBap蛋白的示意圖

S.aureus表面蛋白G(SasG)與Aap密切相關(guān)，Aap和SasG蛋白結(jié)構(gòu)與功能非常相似，兩種蛋白均有重復的G5結(jié)構(gòu)域，SasG蛋白與Aap可以促進生物被膜形成的主要附著或積累階段[14]。此外，分泌蛋白如Eap在生物被膜成熟過程中發(fā)揮作用，其能夠促進細胞聚集并與細胞表面結(jié)合[15]。

2.3 eDNA依賴機制 eDNA也是S.aureus生物被膜的細胞外基質(zhì)組成成分之一，其參與生物被膜的早期粘附階段與成熟階段，由于DNA聚合物的負電荷，其作為靜電荷聚合物，將細胞固定到物體表面或宿主中。eDNA通過細胞裂解而釋放出來的，主要是由cid基因調(diào)控，cidA是一種編碼胞壁質(zhì)水解酶活性效應(yīng)器及調(diào)節(jié)細胞死亡的基因。研究顯示，cidA基因突變促進細菌裂解，從而增加eDNA的釋放；lrg基因是另一種與胞壁質(zhì)水解酶和細胞死亡有關(guān)的調(diào)節(jié)基因，但其與cidA基因有所不同，研究顯示，IrgAB基因突變，可以抵消cidA基因介導的DNA釋放效應(yīng)[16]。此外，一些細胞外蛋白如表面活性肽(PSM)、β毒素及免疫顯性表面抗原B(IsaB)能夠與eDNA結(jié)合形成不溶性寡聚體，可能具有穩(wěn)定ECM結(jié)構(gòu)的作用[17]。

3 S.aureus生物被膜調(diào)控系統(tǒng)

3.1 群感應(yīng)系統(tǒng)(QS)葡萄球菌有兩種QS系統(tǒng)，即Agr和AI-2(Autoinducer-2)，它們以不同的途徑降低生物被膜的形成。Agr基因編碼兩個不同的轉(zhuǎn)錄物，分別是由P2和P3啟動子驅(qū)動的RNAII和RNAIII，RNAII中含有4個基因(AgrA、AgrB、AgrC和AgrD)，AgrD編碼自體誘導肽(AIP)的前體，AgrB是一種多功能內(nèi)肽酶和伴侶蛋白，有助于AIP的成熟和輸出，AgrC和AgrA包含雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，其中AgrC是膜組氨酸激酶，AgrA是響應(yīng)調(diào)節(jié)劑[18]。Agr系統(tǒng)依賴于細胞密度和自誘導物信號分子的積累。在S.aureus中，AIP在培養(yǎng)基中積累，當其濃度達到一定的閾值時，就會結(jié)合并激活組氨酸激酶AgrC，AgrC激活后磷酸化AgrA，AgrA再激活P3啟動子轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生調(diào)控RNA分子(RNA III)，調(diào)節(jié)幾種毒力因子和生物被膜相關(guān)基因的表達[19]。Agr基因?qū)ι锉荒さ恼{(diào)控是多方面的，主要參與生物被膜的附著、黏附、增殖、成熟和分散階段。在已經(jīng)建立的生物被膜中，添加AIP可以重新激活agr，并通過增加細胞外蛋白酶的分泌促進生物被膜的分離，AgrA調(diào)控PSM表達并參與生物被膜解離，當PSM為單體時，其促進生物被膜的解離，但當其聚合形成淀粉樣纖維時，則促進生物被膜的形成[20]。AgrB可以調(diào)節(jié)生物被膜的分散，因為生物被膜生物量(細胞、細胞外聚合物質(zhì)和eDNA)與agrB的表達呈負相關(guān)[21]。RNAIII控制生物被膜形成和積累，并且高RNAIII被認為具有抗生物被膜效應(yīng)[22]。

AI-2信號分子是由4,5-二羥基-2,3-戊二酮(DPD)衍生的，由LuxS酶催化合成，目前已有研究表明LuxS/AI-2系統(tǒng)參與細菌生物被膜的形成。有研究顯示，LuxS/AI-2系統(tǒng)可以通過激活S.aureus中的icaR來抑制icaA基因的轉(zhuǎn)錄[23]，隨后在Ma R等研究中顯示，luxS突變體中icaR基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，icaA的表達量顯著增加，在luxS突變體中補充DPD，luxS突變體又恢復抑制生物被膜形成的能力，表明AI-2信號激活icaR基因，再降低icaA操縱子轉(zhuǎn)錄。LuxS/AI-2系統(tǒng)通過抑制S.aureus中rbf基因的表達來調(diào)節(jié)PIA依賴性生物被膜的形成，這主要是因為Rbf通過直接結(jié)合sarX啟動子來上調(diào)sarX的轉(zhuǎn)錄，而sarX又下調(diào)icaR的表達[24]，因此，LuxS抑制rbf基因的表達，降低icaA基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而使PIA依賴性的生物被膜形成減少。

3.2 全局調(diào)控因子 Sar基因座編碼DNA結(jié)合蛋白SarA，其是一種14.7 ku翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)控S.aureus主要毒力基因的表達，同時也調(diào)控生物被膜的形成。研究顯示，SarA可以影響120個基因的轉(zhuǎn)錄，其中SarA可以促進agr基因的表達，若agr突變，S.aureus生物被膜形成能力會增加[25]，在agr基因座的P2和P3間隔區(qū)具有SarA的結(jié)合位點，SarA與該區(qū)域結(jié)合，影響生物被膜的形成[26]。Valle等研究顯示，SarA突變能夠抑制ica基因的轉(zhuǎn)錄，使PIA的表達量下降，從而影響細菌生物被膜的形成[27]。Tormo等研究表明，ica啟動子序列間存在多個DNA結(jié)合位點，SarA易與ica操縱子中的DNA位點結(jié)合，促進ica操縱子的表達，SarA還可以上調(diào)icaR基因的表達，從而抑制PIA依賴性生物被膜的生成[28]。除此之外，SarA與Bap啟動子特異性的結(jié)合，促進Bap基因的表達，從而促進生物被膜的形成[29]。

SigB調(diào)節(jié)子參與調(diào)節(jié)S.aureus的毒力、色素沉著以及生物被膜的形成，SigB突變減弱了SigB蛋白和nuc基因啟動子之間的直接相互作用，從而降低nuc的表達并增強生物被膜的形成[30]。目前已有研究表明sigB和agr不是直接調(diào)節(jié)一些蛋白酶的轉(zhuǎn)錄，而是需要中間參與者，其中最重要的一個是毒素抑制劑(Rot)[31]。Rot來自SarA金黃色葡萄球菌家族的DNA結(jié)合蛋白，具有雙重調(diào)控作用，因為其促進編碼表面蛋白和免疫調(diào)節(jié)劑(如蛋白A和超抗原樣蛋白)基因的表達，并抑制編碼外毒素和胞外酶的基因表達。研究表明，Rot在agr下游起作用并抑制毒素和胞外酶的產(chǎn)生，當agr被激活時，RNA III水平升高并阻止Rot蛋白的翻譯，減輕Rot抑制效應(yīng)[32]，因此，Rot也是S.aureus生物被膜形成的必要調(diào)節(jié)因子。

3.3 其它調(diào)控系統(tǒng) 目前發(fā)現(xiàn)了一種新的msaABCR操縱子，其中msa C和msa R對msaABCR操縱子表達至關(guān)重要。msaABCR不僅能夠調(diào)控S.aureus的生物被膜形成與毒力，而且還調(diào)節(jié)sarA、agr和sigB基因的表達[33]。經(jīng)生物信息學工具I-TASSER預測msaA是一種保守的假想蛋白，與雙精氨酸信號結(jié)合蛋白有很高的相似性，對其結(jié)構(gòu)分析還表明，其可能位于細胞質(zhì)中，可能參與小GTPase介導的信號轉(zhuǎn)導[34-35]。在msaA缺失突變體中，由于msaA基因的刪除，導致agr、sarA和sigB的表達量減少，在msaC缺失突變體中，sarA在生物被膜生長期間表達減少，上游基因(msaA、masB)的表達量下降[36]。msaB基因序列分析顯示，其在S.aureus中編碼一種冷休克蛋白，msaB基因調(diào)節(jié)細菌色素沉著減少，蛋白酶活性增加，細胞死亡增加，生物被膜形成減少[37]。Sahukhal等研究表明，msaABCR操縱子調(diào)控4種細胞外蛋白酶(Aur、Scp、Ssp、Spl)在各種生長條件中的表達，包括在生物被膜中，這些蛋白酶可以調(diào)節(jié)atl基因的活性、穩(wěn)定性和易位，并影響S.aureus生物被膜的自溶與發(fā)育[38]。所以，msaABCR操縱子在維持生物被膜內(nèi)自溶和生長間的平衡具有關(guān)鍵作用。

4 展望

隨著耐藥細菌的逐年增加，越來越多的細菌能夠形成生物被膜，形成生物被膜是S.aureus慢性感染持續(xù)存在的重要因素。本實驗室從寧夏地區(qū)奶牛乳房炎中分離出234株S.aureus，生物被膜陽性率為79.06%，并且生物被膜陽性菌株耐藥性均高于生物被膜陰性菌株，通過對生物被膜相關(guān)基因檢測分析顯示，其相關(guān)基因在生物被膜的形成過程中具有一定的作用，但在其陰性菌中也有相關(guān)基因的存在，這可能是受到環(huán)境或轉(zhuǎn)錄水平的影響，由此表明，S.aureus生物被膜的形成以及解離非常復雜且受到多種基因及調(diào)控系統(tǒng)的影響，需要進一步深入地研究。目前研究中藥、聯(lián)合抗生素及一些微生態(tài)制劑干預S.aureus生物被膜感染的較多，而針對生物被膜的調(diào)節(jié)基因靶向抑制劑的研究很少。因此，深入研究S.aureus生物被膜形成及調(diào)控機制是非常有必要的，有助于發(fā)現(xiàn)生物被膜的特異性藥物干預靶點。從Agr、SarA、SigB、Rot等調(diào)控系統(tǒng)特異性靶向干預生物被膜的形成機制研究為抗細菌生物被膜藥物的研發(fā)提供新的思路。