閆建培 張曉曉 季葦芹 楊玉文 關(guān)巍 趙廷昌

摘? ? 要：在生物體中，血紅素氧化酶（Heme oxygenase， HemO）在血紅素代謝、鐵循環(huán)和氧化應(yīng)激等過程中發(fā)揮重要作用。在一些病原菌中，血紅素氧化酶可參與調(diào)控其致病能力。在西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）中，存在一個(gè)編碼血紅素氧化酶的基因hemO，然而其功能尚未可知。以西瓜噬酸菌Aac5菌株為研究對(duì)象，通過基因敲除構(gòu)建hemO缺失突變體菌株，分析致病力及生物學(xué)表型，并檢測(cè)致病相關(guān)基因表達(dá)量，初步探究HemO在西瓜噬酸菌中的功能。結(jié)果表明，hemO基因缺失會(huì)促進(jìn)菌株生物膜的形成，并導(dǎo)致菌株運(yùn)動(dòng)性、生長能力、致病力降低，顯著影響致病相關(guān)基因的表達(dá)，但不影響病原菌誘導(dǎo)煙草過敏性反應(yīng)的能力。這表明hemO基因參與西瓜噬酸菌的致病力調(diào)控過程。

關(guān)鍵詞：西瓜噬酸菌; hemO; 致病力

Abstract： Heme oxygenase （HemO） plays an important role in the process of heme metabolism， iron cycle and oxidative stress in living organisms. Heme oxygenase can be involved in the regulation of pathogenicity in some pathogenic bacteria. The hemO gene was identified in Acidovorax citrulli genome. However， the biological function of the gene remains unclear. In this study， the hemO mutant strain was constructed by gene knockout， the pathogenicity and biological phenotype were analyzed， and the expression levels of related pathogenetic genes was detected to explore the function of HemO based on the wild type strain Aac5. The results showed that the deletion of hemO gene promoted biofilm formation， caused the decline in motility， growth ability and pathogenicity， and significantly influenced the expression of related pathogenic genes， but did not affect the ability to induce hypersensitive reaction in non-host Nicotiana tabacum. These results indicated hemO is involved in the pathogenic regulation process of A. citrulli.

Key words： Acidovorax citrulli; hemO; pathogenicity

瓜類細(xì)菌性果斑?。˙acterial fruit blotch，BFB）是發(fā)生在西、甜瓜等葫蘆科作物上的種傳細(xì)菌性病害，該病害因發(fā)生范圍廣、流行速度快、危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，給我國的西、甜瓜產(chǎn)業(yè)帶來巨大威脅，其病原菌為革蘭氏陰性細(xì)菌西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）[1-3]。該病害在致病機(jī)制方面的研究較少，而以藥劑防治為主的防控手段在防治果斑病方面也較為有限[4-5]，因此對(duì)該病害致病機(jī)制的解析有助于為果斑病的防控提供新的策略。

血紅素氧化酶（Heme oxygenase，HemO）首先在真核生物中發(fā)現(xiàn)，隨后在原核生物中也有該蛋白的報(bào)道[6]。它是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種微粒體酶，參與細(xì)胞內(nèi)血紅素的氧化裂解反應(yīng)，并產(chǎn)生鐵離子、膽綠素（Biliverdin，BV）和一氧化碳[7-8]。該反應(yīng)是幾乎所有生物生理過程中必不可少的，如哺乳動(dòng)物中鐵的再利用和細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，藍(lán)細(xì)菌和高等植物中捕光色素的合成，以及細(xì)菌對(duì)鐵的獲取等[9]。

在金黃葡萄球菌、銅綠假單胞等動(dòng)物病原細(xì)菌中，血紅素加氧酶可影響其致病性[6， 10]，但在植物病原細(xì)菌中尚未見報(bào)道。通過生物信息學(xué)分析，在西瓜噬酸菌中存在一個(gè)編碼血紅素氧化酶的基因hemO，但該基因是否會(huì)影響西瓜噬酸菌的致病力還需要進(jìn)一步明確。筆者通過對(duì)西瓜噬酸菌基因hemO敲除來探究其對(duì)西瓜噬酸菌生物膜、運(yùn)動(dòng)性、致病力等多種表型的影響，從而初步解析該基因的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株、質(zhì)粒和植物材料 試驗(yàn)所用的菌株及質(zhì)粒詳見表1。西瓜噬酸菌Aac5菌株分離自中國臺(tái)灣，并由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜病害課題組保存。西瓜噬酸菌野生型菌株及其他相關(guān)菌株在28 °C條件下培養(yǎng)48 h ，大腸桿菌感受態(tài)菌株及相關(guān)菌株在37 °C下培養(yǎng)12～18 h。氨芐霉素終質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1;卡那霉素質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1;氯霉素終質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1。西瓜品種為‘中蔬瑞宏，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供;煙草品種為‘枯斑三生煙（Nicotiana tabacum var. Samsun NN），由植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 KingB （KB）培養(yǎng)基（胰蛋白胨 20 g，硫酸鎂 1.5 g，磷酸氫二鉀 1.5 g，丙三醇 15 mL，pH 7.0）;LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，氯化鈉 10 g，pH 7.0）;半固體瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌蛋白胨 0.3 g，酵母粉 0.3 g，氯化鈉 3 g，pH 7.0）;M9培養(yǎng)基（十二水和磷酸氫二鈉 15.12 g，磷酸二氫鉀 3 g，硫酸銨 1 g，檸檬酸鈉 2 g，硫酸鎂 0.246 g，pH 7.0），將上述培養(yǎng)基加入蒸餾水定容至1 000 mL，然后121 ℃進(jìn)行高溫滅菌20 min（M9培養(yǎng)基用于蔗糖篩選時(shí)應(yīng)加入10%的蔗糖，并于110 ℃滅菌15 min），相應(yīng)的培養(yǎng)基可加入1.5%的瓊脂，即為固體培養(yǎng)基。

試劑：細(xì)菌提取試劑盒（百泰克生物公司）;質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒、PCR清潔回收試劑盒（Axygen）、2×Taq PCR Master Mix、SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）、FastQuant RT Kit （with gDNase）、DNA Green試劑盒（天根）;KOD高保真酶（TOYOBO）;Infusion無縫連接酶（諾維贊）;相關(guān)抗生素（Sigma-Aldrich）;試驗(yàn)涉及引物合成和序列測(cè)序由北京六合華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 突變體及其互補(bǔ)菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證 通過KEGG數(shù)據(jù)庫獲取西瓜噬酸菌基因hemO上下游序列，通過Primer 軟件設(shè)計(jì)引物hemO -1F/R、hemO-2F/R，并用KOD plus NEO克隆hemO左右臂片段，使用overlap PCR[15]連接左右臂片段，將連接產(chǎn)物與自殺性質(zhì)粒pK18mobsacB連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒pK18-hemO。利用三親接合的方法，將重組載體通過助手菌pRK600導(dǎo)入到野生型菌株Aac5菌株中，通過抗生素篩選獲得攜帶有重組載體的野生型菌株Aac5菌株。由于重組載體攜帶的sacB位點(diǎn)具有蔗糖致死的特性，將經(jīng)過抗性篩選后的菌株進(jìn)一步在含10%蔗糖的M9固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，在選擇壓力的作用下，菌株基因組與質(zhì)粒的左右臂連接片段發(fā)生同源交換，導(dǎo)致hemO基因缺失[16]。使用西瓜噬酸菌特異性引物 WFB1/WFB2[17]及hemO特異性引物 hemO-TF/R進(jìn)行PCR驗(yàn)證，獲得正確的hemO基因缺失突變菌株。

設(shè)計(jì)引物ChemO-F/R克隆目的基因，并將其連接至載體pBBR1MCS-2，構(gòu)成互補(bǔ)載體pBBR-hemO。測(cè)序驗(yàn)證正確后，將互補(bǔ)載體通過三親接合的方法導(dǎo)入突變體菌株中，經(jīng)過氨芐青霉素和卡那霉素抗性篩選，并使用西瓜噬酸菌特異性引物 WFB1/WFB2及hemO特異性引物 hemO-TF/R進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證，獲得正確的hemO基因互補(bǔ)菌株（表2）。

1.2.2 致病力測(cè)定 將供試菌株（野生型Aac5、hemO缺失突變株及互補(bǔ)菌株）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心去除培養(yǎng)基成分，用無菌水重懸菌體后，調(diào)整菌懸液濃度至104 CFU·mL-1，用1 mL無菌注射器將菌液從葉背注滿完全展葉的2周齡西瓜子葉;接種后將西瓜苗置于光照氣候培養(yǎng)箱（設(shè)定16 h光照、28 ℃，8 h黑暗、16 ℃，相對(duì)濕度85%）中培養(yǎng)72 h，每個(gè)處理取6片子葉打孔，葉盤面積約為0.5 cm2，用MP研磨儀研磨，將樣品懸液逐步稀釋，涂布于KB瓊脂培養(yǎng)基中，28 ℃ 培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量[18]。以清水作為陰性對(duì)照，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.3 煙草過敏性反應(yīng)測(cè)定 將野生型、突變株及互補(bǔ)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整菌懸液濃度至108 CFU·mL-1。用注射器注射接種至幼嫩煙草葉片背面，24 h后觀察葉片過敏性反應(yīng)的產(chǎn)生情況[19]。以清水作為陰性對(duì)照，每個(gè)菌株3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4 生物膜形成能力測(cè)定 在聚苯乙烯24孔培養(yǎng)板中加入1 mL M9培養(yǎng)基，將野生型、突變體和互補(bǔ)菌株的菌懸液濃度調(diào)整至108 CFU·mL-1，取10 μL加入到培養(yǎng)板的培養(yǎng)基中，28℃ 靜置培養(yǎng)48 h后倒盡培養(yǎng)液，用無菌水洗去游離的細(xì)胞，將培養(yǎng)板置于80 ℃ 固定20 min;然后每孔中加入1 mL 0.1%結(jié)晶紫溶液染色45 min;用無菌水清洗 3次后，37 ℃ 烘干;加入1.5 mL的95%乙醇，靜置2 h，以溶解生物膜。其后用分光光度計(jì)測(cè)定各處理溶液于OD575的值[20-21]。每個(gè)菌株8個(gè)生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.5 運(yùn)動(dòng)性測(cè)定 將野生型、突變株及互補(bǔ)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心去上清，用無菌水重懸菌體，調(diào)整菌懸液濃度至108 CFU·mL-1，各取2 μL輕輕點(diǎn)接于含0.3%瓊脂的半固體培養(yǎng)基上，28 ℃正置培養(yǎng)，48 h后統(tǒng)計(jì)菌落暈圈直徑[22]。每個(gè)菌株6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.6 生長能力測(cè)定 將供試菌株在KB液體培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，將菌懸液濃度調(diào)至108 CFU·mL-1，稀釋100倍后置于細(xì)胞培養(yǎng)板上28 ℃培養(yǎng)，每2 h測(cè)1次OD600的吸光度值。每個(gè)菌株4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.7 致病相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定 使用TRizol法提取西瓜噬酸菌Aac5菌株和突變體菌株?hemO的總RNA，將總RNA濃度調(diào)為一致后，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA[23]。以rpoB為內(nèi)參基因[12]，測(cè)定菌株內(nèi)趨化性相關(guān)基因cheA、鞭毛相關(guān)基因fliC、胞外水解酶基因eng、菌毛相關(guān)基因pilQ以及Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲ secretion system，T3SS）關(guān)鍵基因hrpG和hrpX的表達(dá)量，引物設(shè)計(jì)見表3?；虮磉_(dá)水平通過2-??Ct法進(jìn)行計(jì)算[24]。

1.3 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜病害課題組進(jìn)行，起止時(shí)間為2018年3—12月。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體及互補(bǔ)菌株獲得及驗(yàn)證

通過構(gòu)建自殺性重組質(zhì)粒，根據(jù)同源重組雙交換的原理構(gòu)建了hemO基因的突變體菌株?hemO。通過西瓜噬酸菌引物WFB1/WFB2驗(yàn)證，突變體菌株可擴(kuò)增出360 bp的目的條帶（圖1-A），證明?hemO為西瓜噬酸菌。通過hemO基因特異性引物hemO-TF/R驗(yàn)證，?hemO菌株無法擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶（圖1-B）。以同樣的方法對(duì)獲得的互補(bǔ)菌株進(jìn)行驗(yàn)證，互補(bǔ)菌株仍為西瓜噬酸菌，且能擴(kuò)增出hemO基因的特異性條帶。說明hemO基因的突變株和互補(bǔ)菌株已獲得。

2.2 hemO缺失減弱西瓜噬酸菌的致病力

在西瓜子葉背面注射野生型菌株、突變體菌株和互補(bǔ)菌株的菌懸液，結(jié)果顯示，72 h后注射了3個(gè)菌株的子葉均出現(xiàn)水浸狀病斑（圖2-A）。與野生型相比，接種突變體菌株?hemO的西瓜子葉病斑面積較小，通過統(tǒng)計(jì)單位面積的菌落數(shù)發(fā)現(xiàn)，菌落數(shù)量要顯著少于野生型菌株;互補(bǔ)菌株與突變菌株無顯著不同，表明基因的回補(bǔ)未恢復(fù)野生型的致病水平（圖2-B）。

2.3 hemO缺失不影響菌株煙草過敏性反應(yīng)

在同一煙葉片上對(duì)野生型菌株、突變體菌株和互補(bǔ)菌株的煙草過敏性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3示，3個(gè)菌株均能引起非寄主煙草的過敏性反應(yīng)。表明基因hemO缺失不影響西瓜噬酸菌引起煙草過敏性反應(yīng)的能力。

2.4 hemO缺失促進(jìn)菌株生物膜形成

對(duì)野生型菌株、突變體菌株和互補(bǔ)菌株所形成的生物膜進(jìn)行染色并用乙醇洗脫，通過測(cè)定OD575的值來定量生物膜形成能力的強(qiáng)弱。由圖4可知，與野生型相比，突變體菌株?hemO的生物膜形成能力顯著增強(qiáng);而互補(bǔ)菌株?hemO-comp部分恢復(fù)生物膜的形成能力。

2.5 hemO正調(diào)控菌株運(yùn)動(dòng)性

在含0.3%瓊脂的半固體培養(yǎng)基上對(duì)野生型、突變株和互補(bǔ)菌株的游動(dòng)能力進(jìn)行測(cè)定，以菌落所形成的暈圈直徑反映菌株游動(dòng)能力的強(qiáng)弱。由圖5可知，與野生型相比，突變體菌株?hemO所形成的暈圈直徑顯著縮小，表明hemO基因的缺失減弱了西瓜噬酸菌的運(yùn)動(dòng)能力;而互補(bǔ)菌株?hemO-comp所形成的暈圈直徑與野生型無顯著差異，表明hemO基因的回補(bǔ)恢復(fù)了西瓜噬酸菌的運(yùn)動(dòng)能力。

2.6 hemO缺失影響菌株生長能力

由圖6可知，與野生型相比，突變體菌株?hemO在由對(duì)數(shù)生長期向平穩(wěn)期過渡時(shí)，生長能力出現(xiàn)下降趨勢(shì);而互補(bǔ)菌株與野生型顯著性差異不大。表明基因hemO的缺失影響西瓜噬酸菌的生長能力。

2.7 hemO缺失影響致病相關(guān)基因表達(dá)

通過對(duì)基因缺失后的致病相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，在突變體菌株?hemO中，趨化性相關(guān)基因cheA、鞭毛相關(guān)基因fliC、胞外水解酶基因eng、菌毛相關(guān)基因pilQ以及T3SS關(guān)鍵基因hrpG和hrpX，這些與致病力相關(guān)的基因均出現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢(shì)（圖7），表明hemO的缺失影響了這些基因的表達(dá)。

3 討 論

血紅素氧化酶在生物體內(nèi)具有抗氧化、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)等功能，其產(chǎn)物BV也有氧化應(yīng)激的作用，而一氧化碳可能在胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮作用。在一些非光和細(xì)菌中，血紅素氧化酶也可以參與光敏色素發(fā)色團(tuán)的合成。在植物病原細(xì)菌中，如丁香假單胞（Pseudomonas syringae）和野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）等，血紅素氧化酶參與光敏色素BphP的組裝過程，有證據(jù)顯示BphP可以在P. syringae和X. campestris的運(yùn)動(dòng)性、生物膜、胞外水解酶以及對(duì)寄主植物致病力的調(diào)節(jié)過程發(fā)揮作用[25-27]。

革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)鐵離子和血紅素具有潛在的毒性，血紅素氧化酶對(duì)于維持胞內(nèi)正常的鐵離子和血紅素動(dòng)態(tài)平衡具有重要意義[28]。動(dòng)物病原細(xì)菌中血紅素氧化酶在鐵離子和血紅素代謝中發(fā)揮作用，如在參與鐵吸收調(diào)控的過程中，銅綠假單胞血紅素氧化酶PigA被鑒定與鐵吸收調(diào)控蛋白（ferric uptake regulator，F(xiàn)ur）同屬于一個(gè)多順反子[29];而在革蘭氏陽性菌中，金黃色葡萄球菌血紅素氧化酶IsdG的轉(zhuǎn)錄也同樣受到Fur的調(diào)控[30]。Fur是全局性的調(diào)控因子，也是植物病原細(xì)菌重要的致病因子[31-32]，正向或負(fù)向調(diào)控P. syringae和X. campestris多種生理功能[33-34]，因此不排除血紅素氧化酶可以在植物病原菌致病力調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

為了探究血紅素氧化酶對(duì)西瓜噬酸菌功能的影響，筆者構(gòu)建了西瓜噬酸菌血紅素氧化酶基因hemO的突變體菌株。研究發(fā)現(xiàn)，血紅素氧化酶基因hemO缺失后，與野生型相比，西瓜噬酸菌在對(duì)數(shù)期生長沒有顯著變化，而在過渡到平穩(wěn)期時(shí)菌量減少，這表明血紅素氧化酶在外界環(huán)境因素飽和的情況下，可能通過氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)來參與西瓜噬酸菌的生長增殖過程。與野生型相比，突變體菌株?hemO的游動(dòng)能力減弱，由于趨化性和鞭毛影響西瓜噬酸菌的游動(dòng)能力，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相應(yīng)的趨化性基因cheA和鞭毛素基因fliC的表達(dá)量也出現(xiàn)了下調(diào)。生物膜的形成能力在基因缺失后出現(xiàn)了上調(diào)，可能是由于存在其他如群體感應(yīng)等信號(hào)通路的調(diào)控作用。煙草過敏性反應(yīng)的試驗(yàn)也說明hemO不影響西瓜噬酸菌與非寄主煙草的不親和互作，煙草葉片組織的受侵部位壞死，限制病菌擴(kuò)展。同時(shí)，西瓜噬酸菌對(duì)寄主西瓜的致病力調(diào)節(jié)也會(huì)受到hemO的影響，這一過程中可能涉及多個(gè)毒力因子，因?yàn)樵摶虻娜笔沟冒ū廾?、菌毛、胞外水解酶和T3SS等的關(guān)鍵基因表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)，其中胞外水解酶是由Ⅱ型分泌系統(tǒng)（Type II secretion system，T2SS）分泌的重要致病力因子，而hrpG和hrpX是調(diào)控T3SS的關(guān)鍵基因。以上結(jié)果表明hemO對(duì)西瓜噬酸菌致病力的調(diào)控機(jī)制可能是由這些因素共同參與的。

在此研究中，血紅素氧化酶基因hemO在西瓜噬酸菌的致病力等多種生物學(xué)表型的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用，而血紅素氧化酶調(diào)控這些過程的分子機(jī)制仍不明確，還有待于進(jìn)一步的解析。

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