焦荻 商紀(jì)鵬 高素燕 王欽 郝建全 何偉 焦定量 呂敬剛 陳則明

摘? ? 要：為了準(zhǔn)確、快速鑒定西瓜雜交種純度，建立8424類型西瓜品種的SSR分子標(biāo)記純度鑒定體系?；?3對(duì)西瓜SSR核心引物，對(duì)天津市靜海區(qū)主要種植的8424類型西瓜品種‘蜜多進(jìn)行分子標(biāo)記純度鑒定。從供試引物中，總共篩選到4對(duì)在雙親上具有多態(tài)性差異的特異性引物，并從中選出2對(duì)多態(tài)性良好，條帶清晰的引物10號(hào)和22號(hào)，應(yīng)用于‘蜜多的分子標(biāo)記純度鑒定。對(duì)4份雜交F1代樣品進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果分別為97.4%、94.9%、98.1%、97.8%，對(duì)比分子鑒定結(jié)果和田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，結(jié)果偏差≤1.5%，表現(xiàn)出高度一致。研究結(jié)果表明，SSR分子標(biāo)記適用于該品種純度鑒定，并可以取締田間表型鑒定，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：西瓜;分子標(biāo)記;SSR;純度鑒定

Abstract：In order to accurately and quickly identify the purity of watermelon hybrids， a SSR molecular marker purity identification system for 8424 type watermelon varieties was established. Based on the 23 pairs SSR core primers in watermelon， the molecular marker purity of 8424 type watermelon variety ‘Miduo which is mainly planted in Jinghai district of Tianjin was identified. From the test primers， a total of 4 pairs of specific primers with polymorphism differences in the parents were selected. Two pairs numbered 10 and 22， which have good polymorphisms and clear bands， were selected out of those 4 pairs to test the molecular purity of the ‘Miduo watermelon. Four hybrid F1 samples were identified by molecular identification， the results were 97.4%， 94.9%， 98.1% and 97.8%. The deviation between the results from the molecular identification and the field morphological identification is less than 1.5%， which reveals a high degree of consistency between the two methods. The results show that the SSR primers are suitable for testing the molecular purity for the ‘Miduo watermelon， and it can be used as an efficient and effective alternative method to the field morphological identification.

Key words： Watermelon;Molecular marker;SSR markers;Purity identification

我國(guó)是西瓜生產(chǎn)與消費(fèi)大國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)2016年我國(guó)西瓜播種面積189.08萬hm2，總產(chǎn)量7 940萬t[1]。天津靜海地區(qū)西瓜栽培歷史悠久，栽培面積1 333 hm2左右[2]，具有代表性的地標(biāo)產(chǎn)品——臺(tái)頭西瓜，是天津市靜?？h臺(tái)頭鎮(zhèn)特產(chǎn)，同樣是中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品，享譽(yù)盛名。目前當(dāng)?shù)卦耘嗟奈鞴掀贩N主要為8424類型，‘蜜多是天津科潤(rùn)蔬菜研究所最新選育的8424類型西瓜品種，該品種果實(shí)發(fā)育期30 d左右，果實(shí)圓形，果皮淺綠色覆墨綠鋸齒條帶，瓤色鮮紅，瓤質(zhì)酥脆多汁，纖維少，口感好，產(chǎn)量較‘早佳（8424）提高，市場(chǎng)表現(xiàn)良好。

為了更好地保障瓜農(nóng)收益，對(duì)于種子企業(yè)來說，嚴(yán)格把控好種子質(zhì)量的四大指標(biāo)（純度、凈度、水分、芽率）顯得尤為重要。西瓜種子純度鑒定一直以來多是依賴于傳統(tǒng)的田間鑒定方法，主要依靠人為進(jìn)行田間的形態(tài)學(xué)觀察[3]。如果親本之間表型差異不明顯，很容易造成田間鑒定不準(zhǔn)確，增加了人為鑒定誤差，并且費(fèi)工費(fèi)時(shí)，鑒定效率不高。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，利用分子標(biāo)記技術(shù)實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物種子純度快速檢測(cè)成為了一種可能[4-6]。目前，基于西瓜全基因組序列開發(fā)出來的能夠最大限度代表了西瓜遺傳多樣性的23對(duì)核心SSR引物[7]，其位點(diǎn)覆蓋全基因組且均勻分布于西瓜的染色體上。筆者正是利用這23對(duì)核心引物，為天津地區(qū)主栽的‘蜜多西瓜品種，尋求一種快捷、準(zhǔn)確的純度檢測(cè)方法，也為今后鑒定該類型西瓜品種種子純度、保證種子質(zhì)量提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)供試材料‘蜜多及其親本由天津科潤(rùn)蔬菜研究所西瓜課題組提供（表1）。田間純度鑒定于2018年9—12月，在海南省樂東縣進(jìn)行。SSR分子標(biāo)記純度鑒定于2018年9—10月在天津科潤(rùn)蔬菜研究所蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 供試西瓜材料及形態(tài)學(xué)差異

[供試材料 種類 形態(tài)學(xué)差異 果皮顏色 果形 蜜多 子一代（F1） 綠花皮 高圓 蜜多母本 親本（♀） 淺綠花皮 圓 蜜多父本 親本（♂） 綠花皮 高圓 ]

1.2 分子標(biāo)記純度鑒定方法

1.2.1 親本DNA提取 親本材料取小片子葉，DNA提取采用CTAB法[8]。

1.2.2 特異性引物篩選 特異性引物來源，參照國(guó)家蔬菜工程研究中心發(fā)表的最大限度代表西瓜遺傳多樣性的23對(duì)核心引物（表2）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為12.5 μL：10× buffer 1.25 μL，dNTPs （2.5 mmol·L-1） 1 μL，每條引物（10 μmol·μL-1） 0.5 μL，TaqDNA聚合酶（2.5 U·μL-1） 0.2 μL，H2O 7.05 μL，DNA 2 μL。TaqDNA聚合酶購(gòu)自全式金公司TransStar TaqDNA Polymerase。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，進(jìn)行銀染顯色，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

1.2.3 雜交種DNA提取及純度鑒定 每份待檢測(cè)樣品取100粒種子催芽。DNA提取采用堿式快速提取法，取1 cm長(zhǎng)度的新鮮種子芽，放入2 mL離心管中，放入2個(gè)鋼珠，加入100 μL NaOH（0.1 mol·L-1）。用組織打碎儀將葉片打碎后沸水浴1 min。取10 μL上清液加入100 μL Tris-HCL（10 mmol·L-1，pH 2.0），吸打混勻，置于4 ℃冰箱保存待用。PCR擴(kuò)增反應(yīng)和聚丙烯酰胺凝膠電泳方法同上，分析電泳結(jié)果。

1.3 田間形態(tài)學(xué)鑒定方法

通過觀察幼瓜果皮顏色和果實(shí)形狀，在坐果期和幼瓜期進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，并將田間鑒定結(jié)果和分子鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本特異性引物篩選結(jié)果

利用23對(duì)SSR核心引物，在‘蜜多品種親本上進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示（圖1），共有3、8、10、22等4對(duì)引物，在雙親之間表現(xiàn)出特異性差異，可作為雜交種純度鑒定候選引物。其中10號(hào)和22號(hào)引物，親本之間差異明顯，擴(kuò)增條帶清晰，無雜帶。適用于雜交種純度鑒定，并進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2 ‘蜜多品種雜交種分子標(biāo)記純度鑒定

待檢測(cè)‘蜜多品種雜交種每份樣品取100粒種子進(jìn)行催芽，選取出芽的94粒種子進(jìn)行純度檢測(cè)。選用10號(hào)和22號(hào)引物進(jìn)行分子標(biāo)記純度鑒定，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果（圖2）。10號(hào)引物擴(kuò)增結(jié)果：94粒種子中有2個(gè)母本帶型，純度結(jié)果為97.9%。22號(hào)引物擴(kuò)增結(jié)果：94粒種子中有1粒未跑出條帶，其余共有3個(gè)母本帶型，純度鑒定結(jié)果為96.8%。10號(hào)引物與22號(hào)引物鑒定結(jié)果吻合率為96.8%/97.9%≈98.9%。2對(duì)引物鑒定結(jié)果基本一致，分子鑒定結(jié)果取平均值為97.4%。

2.3 分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果比對(duì)

2018年9—12月，對(duì)分子標(biāo)記純度鑒定的同批次種子在海南進(jìn)行田間純度鑒定驗(yàn)證。根據(jù)田間形態(tài)學(xué)觀察統(tǒng)計(jì)田間鑒定結(jié)果，并與分子鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)（表3）。

結(jié)果顯示，分子鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果基本相同，兩者的純度偏差≤1.5%，符合允許的誤差范圍（≤2%）。因此可以應(yīng)用10號(hào)引物和22號(hào)引物對(duì)‘蜜多品種進(jìn)行分子標(biāo)記純度鑒定，從而代替田間表型鑒定。

3 討論與結(jié)論

諸如8424類型的西瓜品種及本研究中涉及到‘蜜多西瓜品種，在制種過程中都容易受到外界環(huán)境影響而出現(xiàn)兩性花，授粉過程中去雄不及時(shí)的話，便可能產(chǎn)生自交瓜，導(dǎo)致制種純度下降。為了保證種子純度，一方面，我們要嚴(yán)格按照制種流程，規(guī)范化制種，授粉過程中，對(duì)兩性花株要及時(shí)去除雄蕊[9]。另一方面，要加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)出來的種子，進(jìn)行嚴(yán)格、準(zhǔn)確的純度鑒定。筆者通過在雙親材料上對(duì)23對(duì)核心SSR引物進(jìn)行篩選，得到了4對(duì)特異性引物，為該類型品種進(jìn)行分子標(biāo)記純度鑒定時(shí)提供了一個(gè)參考。但是，此種方法篩選到雜株均為親本帶型的自交材料，對(duì)于外緣的機(jī)械混雜和‘蜜多品種種子真實(shí)性鑒定還存在局限性[10]。

為了進(jìn)行西瓜種子純度和真實(shí)性方面的檢測(cè)，目前的方法多是在核心引物的基礎(chǔ)上進(jìn)一步擴(kuò)大引物篩選，通過建立不同品種的DNA指紋圖譜[11]，利用多對(duì)既可以在2個(gè)親本上表現(xiàn)出特異性，又可以在不同品種雜交種F1代間表現(xiàn)出差異的引物進(jìn)行鑒定。根據(jù)所運(yùn)用的引物對(duì)數(shù)，進(jìn)行多次PCR反應(yīng)，最終分析純度和真實(shí)性結(jié)果[12-13]。但是此種方法反應(yīng)步驟多，較為繁瑣。目前已有研究報(bào)道，利用多對(duì)SSR引物通過建立多重PCR檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)種子純度和真實(shí)性的共同檢測(cè)[14-15]。今后在核心引物的基礎(chǔ)上擴(kuò)大引物篩選，通過多重PCR體系構(gòu)建，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)種子純度和真實(shí)性的共同檢測(cè)。

筆者針對(duì)目前天津市主要栽培的8424類型西瓜品種‘蜜多進(jìn)行分子標(biāo)記純度鑒定，其分子鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果偏差≤1.5%，符合允許的誤差范圍（≤2%），因此可以應(yīng)用分子鑒定的方法來代替田間純度鑒定方法。但是考慮到同類型不同品種的遺傳背景差異性，在進(jìn)行分子標(biāo)記進(jìn)行純度鑒定前提，還應(yīng)該進(jìn)行多次的田間試驗(yàn)驗(yàn)證，已確保所篩選到的特異性SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果可以真實(shí)、準(zhǔn)確反映品種在田間的表型差異。

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