董蕾

摘要基于聚合酶鏈式反應技術的食品溯源和轉基因原材料檢測，取決于DNA模板量和品質。而在食品加工過程中，溫度、pH值、發(fā)酵、機械力作用等都會導致原材料DNA降解，為后續(xù)食品溯源、摻偽檢測和轉基因原料檢測帶來挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，雖然加工過程會導致DNA降解，但加工食品DNA提取后進行PCR擴增仍可實現(xiàn)。本文總結食品加工過程中的溫度、pH值、發(fā)酵、機械力作用等對DNA的影響，以期為加工食品溯源、摻偽檢測和轉基因原料檢測提供理論依據(jù)。

關鍵詞 食品加工;DNA降解;聚合酶鏈式反應

中圖分類號 TS201.1

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）05-0212-04

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展和大量應用，以PCR技術為基礎的食品溯源檢測摻偽檢測和GMO成分分析快速發(fā)展，但食品加工過程中的多種因素會對原材料DNA造成巨大影響，導致DNA一級結構被破壞，使DNA水解、氧化或脫氨基1-2，影響PCR的定性或定量檢測，造成檢測結果不穩(wěn)定或失敗。同時，加工食品的DNA提取方法也會影響檢測結果。如何最大限度地獲得加工食品中的原料DNA，去除多糖、多酚、蛋白質等對后續(xù)PCR過程的影響或抑制，也成為食品安全分子檢測的重要考慮因素。

本文總結了近年來國內外針對加工食品的DNA提取、檢測及檢測方法，并進行簡要分析，以期為我國食品安全檢測、食品溯源和GMO成分分析的進一步發(fā)展提供理論參考。

1加工食品DNA提取影響因素

進行加工食品檢測的第一步是提取DNA.DNA的品質（數(shù)量、純度）決定后續(xù)檢測效果。對于單一原料食品，如豆腐、玉米片等，可以認為原料同一，則提取難度降低。但對于復合原料食品，如餅干、披薩等，原料的復雜性會導致DNA提取難度上升。在這類食品的處理過程中，就需要確定主要檢測原料，并制訂相應提取方案。

一般情況下，加工食品的植物性原材料DNA提取利用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）方法進行，該方法具有去除植物性多糖S8和成本低廉的優(yōu)勢910。另外，也有利用磁珠富集的方式進行DNA提取，產物直接進行PCR擴增"。但由于食品加工過程的許多因素都可以造成DNA降解，導致DNA純度或濃度下降，因而在提取過程中通?？紤]這2個因素的折中方案。表1總結了前人進行食品DNA提取中的優(yōu)化方案，這些方案通過凝膠成像、UV分光光度計、熒光檢測、傳統(tǒng)PCR巢式PCR或RT一PCR等方法進行驗證，獲得最優(yōu)結果。

食品中存在許多化學成分，這些化學成分會影響DNA的提取。如各種殺菌劑加工過程中物理性質或化學性質的改變，使DNA附著在非溶解性物質上，降低DNA的抽提效果21-2）;氧化劑或酶水解縮短DNA長度！P21加工過程中的一些處理，如加熱冷凍等，也會降低DNA片段長度，從而改變DNA提取效率。

2DNA的數(shù)量、純度與PCR的關系

DNA的數(shù)量：與純度決定PCR擴增效率。一般通過檢測DNA片段長度或平均分子量來判斷所提DNA的質量，而DNA的質量與所檢材料種類、加工過程和DNA提取方法相關（262）。在轉基因食品檢測中，通過PCR擴增目標片段（外源基因片段）分析是否為轉基因加工食品。

食品基質中存在的大量化學物質對于DNA純度有嚴重影響。DNA提取過程的選擇和優(yōu)化，可以消除潛在干擾和反應抑制物，使基于DNA基礎的檢測技術獲得成功80-31。首先，原料自身包含的蛋白質、多糖、脂類或多酚可能引起DNA污染25.31-32;其次，提取DNA時所用的CTABEDTA、酚類氯仿、SDS、乙醇、異丙醇等，都會干擾Taq酶活性，從而抑制PCR反應18.3-31;再次，緩沖液中包含的鹽類、糖類以及其他化合物也會不同程度地降低PCR反應效率35-37。因此，在進行加工食品PCR擴增時，往往需要稀釋DNA提取液，通過降低干擾物的濃度來提高PCR反應效率陽通過分光光度計進行DNA純度檢測，確定在230、260、280nm處的吸光值，計算A2xo/A280和Azo/A20當A20/A280吸收值為1.5～2.0、A206A20超過1.7時，所提取DNA適用于PCR反應839。眾多研究發(fā)現(xiàn)，用于PCR的樣品需要DNA的數(shù)量在20～200ng之1間4.31.4042，濃度過高影響反應效率明，而過低則容易導致擴增失敗。

加工食品中往往包含多種原材料，并且經過多重工序。由于原材料的特性不同，就會影響DNA的提取效率。對于不同食品，往往無法適用一種或幾種通用的提取方法，需要根據(jù)不同材料優(yōu)化不同提取過程。

3目標片斷選擇和引物設計與PCR的關系

提取DNA是為了進行后續(xù)的PCR檢測。普通PCR是使用最普遍的一種分子檢測手段。一般認為，普通PCR作為一種定性分析手段，對目標片段有很好的擴增性。表2總結了大豆轉基因食品PCR評估DNA方法。另外，在小麥146-48]、精煉菜籽油149、馬鈴薯加工23.50-54等加工食品的研究中也常用普通PCR進行。

與其他材料的PCR過程相似，加工食品DNA檢測的PCR過程，其引物序列、引物濃度、酶體系大小和程序設定都會對檢測結果有重要影響。而由于加工食品的DNA隨著加工步驟的不斷進行已經出現(xiàn)不同程度的降解，終產品的目標片段長度往往僅有100～300bp，因而目標片段選擇和弓物設計至關重要。

4加工過程對原材料DNA的影響

加工過程種類繁多，溫度、pH值、微生物發(fā)酵等均對食品原材料的DNA有影響，不同材料對于不同的加工過程也會有不同的降解效率，從而影響后續(xù)PCR反應1586-9）。因此，了解不同加工過程對不同原料DNA的影響十分關鍵。

4.1溫度

高溫容易使DNA發(fā)生物理降解，即變性，其作用機理是高溫引起DNA的脫氨基或脫嘌呤作用。雖然高于100C會導致DNA鏈斷裂，二級結果被破壞5961，但高溫滅菌或灌制時使用121C進行15min處理并不會導致全部DNA破壞。因此，這種加工過程處理后的食品，進行DNA有效提取后仍可進行PCR擴增反應40但如果再有后續(xù)的烹煮、烘烤、干燥等加熱過程，會5|起DNA的進一步降解，而這些過程會導致DNA被切斷成小片段，使PCR效率降低。

4.1.1干熱加工。高溫伴隨干燥過程對DNA影響很大。在薯片制作過程中，70C、2h烘干會導致馬鈴薯DNA降解！21。而溫度越高，DNA的降解速率越快。94C、5min烘烤玉米過程就會導致玉米DNA577bp大小的片段全部消失;同時，研究人員發(fā)現(xiàn)，在玉米片加工過程中1009C烘烤會導致玉米基因組DNA降解7，但大部分經過烘烤加工的食品中仍有小分子片段存在，使PCR擴增成為可能。

4.1.2濕熱加工。Ogasawara等6對比利用千豆和濕豆制作豆奶制品的過程，同樣是100C60min以上的處理，千豆DNA未出現(xiàn)明顯的改變，而濕豆的830bp和1022bp片段都發(fā)生嚴重降解。加熱DNA溶液是影響DNA片段最簡便的方法（通過改變時間和溫度）.Hupfer等I62發(fā)現(xiàn)，95C60min后，DNA片段長度損失600bp以上。同樣，Debode等網(wǎng)發(fā)現(xiàn)，在99C7h烹煮后，DNA平均片段仍保持在400bp。微波處理0～15min800W條件下，每次保持最長時間（15min）3次，中間冷卻，會導致DNA嚴重降解，但DNA片段大小仍大于目標片段。

煮沸過程中添加化學成分也會增加DNA的損失。在玉米粉制作過程中，添加1%石灰粉煮沸20min，這一聯(lián)合效果使DNA片段降解到585bp以下。但后續(xù)沉降蛋白質所加人酸和氯化鈣并不會導致DNA進一步降解19但在豆腐制作過程中，酸和CaCl的添加并未影響目標595bp大片段的擴增61。在polenta（一種玉米淀粉制作的粥狀食物）制作過程中，玉米面粉溶解在0.4%氯化鈉溶液中30min煮沸，1914bp片段消失，然而211bp片段在105min加熱后仍可檢測到6。這些結果均顯示，水煮加熱時間越長，對片段的降解程度越高。

4.1.3油炸。在薯片的加工過程中，植物DNA在175C3min和150C1min下嚴重降解，只有96bp片段能夠被擴增（終產品中）8。然而在油豆腐中，175C對其影響比較小，595bp擴然增仍然能陂擴增161。另外，對比油炸濕masa和烤干masa，油炸濕masa降解較低，表明水分的存在緩沖了油炸的熱沖擊。

4.2pH值

4.2.1酸性環(huán)境。水果或蔬菜的汁液通常均為酸性環(huán)境，或處理過程中環(huán)境為酸性。如番茄汁，pH值在4.0～4.4之間網(wǎng)。DNA在酸性環(huán)境下，純度下降，同時導致DNA斷裂網(wǎng)。在酸性環(huán)境下，輔以熱處理也會加速酸催化反應66.70，BauerT等發(fā)現(xiàn)，在番茄醬制作過程中，pH值為4.3、溫度為65C時會導致DNA快速降解，在面粉發(fā)酵過程中，由于酵母菌發(fā)酵降低面團pH值，使小麥DNA出現(xiàn)酸降解現(xiàn)象1-7）。濕磨玉米（酸性環(huán)境下浸泡）比單獨濕磨玉米更容易使DNA降解7。4.2.2堿性環(huán)境。相比酸性環(huán)境，DNA在堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較高。pH值為8.5～9.5之間時，DNA雙螺旋結構解鏈但并不會斷裂6。在墨西哥卷餅制作的最初階段，需要添加pH值較高的溶液同時加熱，形成pH值為11.0的加熱水溶液，這一過程導致DNA降解。在墨西哥，許多食物（如trilla，玉米片、tacoshells）均需要這種堿性溶液加熱處理。Kharazmi等發(fā)現(xiàn)，585bp片段擴增失?。?0），但Hupfer卻發(fā)現(xiàn)，pH值9.0加熱60min，仍能夠檢測到1914bp片段大小DNA。

4.3發(fā)酵

在發(fā)酵過程中，由于微生物以食品原材料為原料進行消化代謝，所產生的DNA酶對DNA有強烈降解效果[64]。Pan等叫發(fā)現(xiàn)，miso（日本豆面醬）的制作過程中經過120d的發(fā)酵后，35S啟動子無法檢測到。發(fā)酵結束放置5～6個月的miso中，DNA片段降解到200bp以下67。通過普通PCR和巢式PCR，可以檢測到95bp大小的DNA片段。因此，巢式PCR技術對于降解成小片段的DNA有更好的擴增效果。

4.4機械力作用

在食品加工過程中，物理作用（如打磨、壓榨）也會使DNA原始片段出現(xiàn)斷裂。尤其在豆類加工制品、各種面粉的制作過程中，打磨是最基礎、最初的步驟，這些物理作用力將DNA降解成小片段，破壞DNA結構。

對預包裝食品往往進行輻照滅菌，以延長其貨架期。輻照射線也會對食品中的DNA產生強烈影響。Villavicencio等叫對豆粕制品施以1000Gy強度的輻照，DNA的破壞程度與輻照強度成正比。

5結論與展望

食品加工過程中的許多過程都會影響DNA的各級結構。其中高溫和酸度是破壞DNA結構的最主要因素。隨著PCR技術的不斷發(fā)展，利用各種變異型的PCR技術（如熒光定量PCR、巢式PCR技術等），使被降解為小分子的DNA片段檢測成為可能。但為了提高檢測的成功率和靈敏性，目標片段的選擇成為關鍵因素。

由于人們對食品安全的關注度越來越高，食品摻偽、溯源和GMO檢測成為食品安全檢測的重要發(fā)展方向，利用分子生物學手段進行原料檢測，使食品安全檢測更加快速、準確。但由于食品加工過程中的各種過程會對原材料DNA分子造成破壞。因此，了解各種加工過程對DNA的影響，尤其是常見的、重要的加工過程，對于不同食品原料的影響，在產品溯源和GMO檢測時顯得非常關鍵。

未來，在食品原材料的分子檢測中，最應關注的是小目標片段的篩選以及針對不同食品建立特異性強的目標片段及對應引物體系，檢測確定在加工過程中各食品原材料的更穩(wěn)定基因，同時結合近年來發(fā)展起來的蛋白組學轉錄組學和核酸適配體等技術，為食品安全檢測提供更加便捷、準確的方法革新。

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