李文杰，陳楠

(鄭州人民醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450003)

手術(shù)后認(rèn)知功能障礙(post operative cognitive dysfunction ，POCD)是手術(shù)后易出現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥之一，常見于老年患者，可導(dǎo)致手術(shù)后恢復(fù)慢、住院時(shí)間延長、住院費(fèi)用增加等，并嚴(yán)重影響患者手術(shù)后生活質(zhì)量[1]。POCD機(jī)制尚不清楚，手術(shù)創(chuàng)傷所致腦組織氧化應(yīng)激損傷在其發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，因此拮抗氧化應(yīng)激損傷是預(yù)防、減輕POCD的重要措施。橄欖苦苷(oleuropein)是來源于橄欖及橄欖油的酚類化合物成分之一。近年來，橄欖苦苷的藥理作用得到廣泛的研究，其具有抗腫瘤、保肝護(hù)腎、保護(hù)心腦血管、降低血糖、降血壓、抗炎、治療阿爾茨海默病等作用[2]。橄欖苦苷抗氧化作用顯著[3]，能夠有效緩解心肌氧化應(yīng)激損傷[4]，但其是否對POCD有預(yù)防或減輕作用尚不清楚。因此，筆者擬建立大鼠脾切除手術(shù)后POCD模型，評價(jià)橄欖苦苷對手術(shù)后大鼠認(rèn)知功能的作用，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)主要試劑、設(shè)備及動物 橄欖苦苷(上海純優(yōu)生物，批號170612-2，含量>98%)，溶于二甲亞砜(DMSO)中配制為10 mmol·L-1的原液，保存?zhèn)溆?。二喹啉甲酸蛋白定量試劑?北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20141216)；Rabbit Anti-β-Actin(Santa Cruz 公司，批號：sc-47778)；Nrf2 Rabbit mAb (CST公司，批號：D1Z9C)；Rabbit Anti-ERK1/2(p44/42 MAPK)(CST公司，批號：BY-04637)；核蛋白提取試劑盒(Phygene生物技術(shù)有限公司，批號：PH0324)；NBS超低溫冰箱(北京五洲東方科技有限公司術(shù)有限公司，型號：U410-86)；全波長酶標(biāo)儀(美國DYNEX 公司，型號：Spectra Mr)；高速冷凍離心機(jī)(德國HERMLE 公司，型號：Z-323)。Morris水迷宮裝置[基爾頓生物科技(上海)有限公司](水池直徑150 cm，高50 cm，站臺直徑9.5 cm)。無特定病原體(SPF)級SD大鼠，雄性，18個(gè)月齡，體質(zhì)量350～400 g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2014-0003。動物房按照SPF級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)保持恒溫、恒濕，晝夜交替時(shí)間12 h。動物不限飲食、飲水。

1.2動物分組和處理 大鼠分組應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法，分為假手術(shù)組、手術(shù)組和橄欖苦苷組(小、大劑量)，根據(jù)時(shí)間點(diǎn)細(xì)分為手術(shù)后1 d組、手術(shù)后3 d組、手術(shù)后5 d組，每組10只大鼠。小、大劑量橄欖苦苷組大鼠于手術(shù)后1，3 和 5 d分別灌胃給予橄欖苦苷20，50 mg· kg-1，假手術(shù)組、手術(shù)組大鼠手術(shù)后1，3和 5 d分別灌胃給予等量的溶媒。橄欖苦苷濃度選擇參照文獻(xiàn)[5]。

1.3模型建立 模型建立參照文獻(xiàn)[6]。手術(shù)組大鼠給予10%水合氯醛(劑量3.0 mL·kg-1)腹腔注射，達(dá)到理想麻醉效果(翻正反射消失)后，仰臥位于大鼠板上固定，術(shù)區(qū)備皮消毒，切口沿肋緣下橫切長2～3 cm，打開腹腔，探查到脾臟，離斷脾蒂，分離結(jié)扎脾血管，完整摘除脾臟，充分止血，用聚維酮碘消毒傷口，逐層關(guān)腹并縫合切口，切口處噴灑青霉素粉預(yù)防感染，用無菌敷料貼覆蓋，膠布固定。假手術(shù)組大鼠同樣方法麻醉，切皮后縫合，切口處噴灑青霉素粉。

1.4認(rèn)知功能測試 采用經(jīng)典Morris水迷宮，在術(shù)前5 d開始進(jìn)行大鼠認(rèn)知功能訓(xùn)練，實(shí)驗(yàn)方法如下：平臺放于水面下1 cm，放置于第Ⅰ象限。將大鼠隨機(jī)(頭朝池壁)從4個(gè)象限置入水中，記錄老年大鼠找到水下放置的平臺的時(shí)間，標(biāo)記為潛伏期(s)，找到平臺后讓其在平臺上停留10 s。尋臺時(shí)間超過60 s者，則輕托大鼠到平臺，并在平臺上停留10 s，記錄潛伏期為60 s。接著撤去平臺，將大鼠由第Ⅰ象限對側(cè)輕放入水中，自由游泳60 s。記錄大鼠在目標(biāo)象限(第Ⅰ象限)游泳的時(shí)間和進(jìn)入此象限的次數(shù)。每只動物每天訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練之間間隔30 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。每次訓(xùn)練結(jié)束后將大鼠擦干，放回籠內(nèi)。訓(xùn)練最后一天的4次訓(xùn)練成績?yōu)樾g(shù)前平均成績。手術(shù)后第1，3，5 天按照上述訓(xùn)練方法測試并記錄大鼠的潛伏期、穿臺次數(shù)及游泳時(shí)間。

1.5海馬組織胞漿蛋白和胞核蛋白的提取 每組大鼠測試結(jié)束后，立即處死，液氮上快速分離大鼠雙側(cè)腦區(qū)海馬組織，稱質(zhì)量，剪碎，置于冰浴的研磨器皿中，根據(jù)比例加入適量4 ℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)充分勻漿至無肉眼可見組織，4 ℃、500 r·min-1(r=8 cm)離心5 min，收集細(xì)胞。加入漿蛋白抽提試劑(含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑)，高速渦旋15 s確保細(xì)胞沉淀分散完全，冰浴中靜置10 min，劇烈高速渦旋10 s，4 ℃、12 000 r·min-1(r=8 cm)離心10 min，取上清液，立即轉(zhuǎn)移入預(yù)冷的樣品管中置-20 ℃保存?zhèn)溆茫藶榘麧{蛋白。在離心沉淀物(細(xì)胞核)中加入核蛋白抽提試劑，高速渦旋15 s確保細(xì)胞沉淀分散完全，提取過程同漿蛋白。4 ℃、12 000 r·min-1(r=8 cm)離心10 min后取上清液即得核蛋白，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)取出樣品，采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。

1.6酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠海馬組織內(nèi)MDA含量和SOD水平 取胞漿蛋白檢測SOD及MDA水平。SOD活性應(yīng)用氮藍(lán)四唑(NBT)法檢測，取MDA檢測工作液，加入組織樣品中，混勻，100 ℃水浴20 min，立即放置水浴中15 min，1000 r·min-1(r=8 cm)離心10 min，取上清液備用。取試劑盒中配備的96孔板中，加入上清液200 μL，利用酶標(biāo)儀在波長532 nm處測定A值，根據(jù)說明書計(jì)算組織中SOD活性(U·mg-1)。

1.7Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測大鼠海馬組織內(nèi)蛋白表達(dá)水平 取“1.5”項(xiàng)中樣品，加入等量的loading buffer混合，置于100 ℃沸水加熱變性后上樣，制備10% SDS-PAGE凝膠，電泳法分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，室溫條件封閉2 h，TBST洗滌3次，每次10 min。加入封閉液稀釋的一抗(p-ERK1/2 、Nrf2)4 ℃孵育24 h。TBST洗滌3次，每次10 min，二抗[1：1000，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記]37 ℃孵育2 h，TBST漂洗3次，電化學(xué)發(fā)光法顯色，然后利用Image Pro Plus 6.0版軟件分析條帶的積分吸光度(A)。

2 結(jié)果

2.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 手術(shù)前各組大鼠潛伏期、穿臺次數(shù)和游泳時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。手術(shù)后1 d，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠潛伏期延長(F=6.27，P<0.05)，穿臺次數(shù)及游泳時(shí)間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與手術(shù)組比較，橄欖苦苷組大鼠潛伏期、穿臺次數(shù)和游泳時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。手術(shù)后3，5 d，手術(shù)組大鼠較假手術(shù)組潛伏期延長、穿臺次數(shù)及游泳時(shí)間減少；橄欖苦苷組大鼠較手術(shù)組潛伏期縮短(F=7.51，P<0.05；F=13.50，P<0.01)，穿臺次數(shù)增加(F=23.95，P<0.01；F=34.58，P<0.01)，游泳時(shí)間增加(F=19.82，P<0.01；F=13.78，P<0.01)。結(jié)果見圖1～3。

與假手術(shù)組比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與手術(shù)組比較，*3P<0.05，*4P<0.01。圖1 4組大鼠手術(shù)前后的潛伏期比較Compared with sham operation group,*1P<0.05，*2P<0.01;compared with surgery group，*3P<0.05，*4P<0.01.Fig.1 Comparison of incubation period among four groups of rats before and after

與假手術(shù)組比較，*1P<0.01；與手術(shù)組比較，*2P<0.05，*3P<0.01。圖2 4組大鼠手術(shù)前后的穿臺次數(shù)比較Compared with sham operation group,*1P<0.01;Compared with surgery group，*2P<0.05，*3P<0.01.Fig.2 Comparison of the number of platform-site crossovers among four groups of rats before and after

與假手術(shù)組比較，*1P<0.01；與手術(shù)組比較，*2P<0.05，*3P<0.01。圖3 4組大鼠手術(shù)前后的游泳時(shí)間比較Compared with sham operation group,*1P<0.01;compared with surgery group，*2P<0.05，*3P<0.01.Fig.3 Comparison of swimming duration among four groups of rats before and after

2.2大鼠手術(shù)后SOD活性及MDA含量 結(jié)果見表1。

表1 4組大鼠手術(shù)后SOD活性及MDA含量比較Tab.1 Comparison of SOD activity and MDA content among four groups of rats after operation

與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，*1P<0.01，*2P<0.05；與手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，*3P<0.05，*4P<0.01。
Compared with sham operation group at same time point，*1P<0.01，*2P<0.01；Compared with surgery group at same time point，*3P<0.05，*4P<0.01.

與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠海馬組織內(nèi)MDA含量增加，SOD含量減少，表明手術(shù)后老年大鼠腦組織內(nèi)產(chǎn)生了氧化應(yīng)激損傷。與手術(shù)組比較，橄欖苦苷組大鼠海馬組織內(nèi)MDA含量減少(F=22.66，P<0.01；F=35.26，P<0.01；F=26.32，P<0.01)，SOD增加(F=10.52，P<0.05；F=8.35，P<0.05；F=23.64，P<0.01)，提示橄欖苦苷可能發(fā)揮抗氧化作用，減少應(yīng)激損傷。

2.3大鼠海馬組織內(nèi)蛋白表達(dá)的比較 與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠海馬組織內(nèi)p-ERK1/2、n-Nrf2、總Nrf2表達(dá)降低。與手術(shù)組比較，手術(shù)后橄欖苦苷組大鼠海馬組織p-ERK1/2表達(dá)增加(F=5.83，P<0.05；F=30.96，P<0.01；F=26.32，P<0.01)，n-Nrf2表達(dá)增加(F=25.62，P<0.01；F=39.20，P<0.01；F=23.44，P<0.01)，總Nrf2表達(dá)增加(F=14.75，P<0.01；F=41.26，P<0.01；F=16.95，P<0.01)。結(jié)果見圖4。

3 討論

POCD的風(fēng)險(xiǎn)因素較多，脾切除手術(shù)后會導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)短暫的認(rèn)知功能障礙[7]，故筆者選擇脾切除手術(shù)建立手術(shù)后POCD模型，并采用Morris水迷宮方法測試?yán)淆g大鼠手術(shù)后的認(rèn)知功能。為排除麻醉方式/藥物對POCD的影響，本研究采用統(tǒng)一的麻醉方案。

脾切除手術(shù)后機(jī)體應(yīng)激導(dǎo)致腦組織內(nèi)皮細(xì)胞受損，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的合成，釋放氧自由基并在神經(jīng)元聚集，損傷腦組織，導(dǎo)致認(rèn)知功能缺陷[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，脾切除手術(shù)前各組大鼠潛伏期、穿臺次數(shù)和游泳時(shí)間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即術(shù)前實(shí)驗(yàn)大鼠認(rèn)知功能沒有差異。手術(shù)后大鼠潛伏期延長，穿臺次數(shù)、游泳時(shí)間顯著減少，提示手術(shù)后大鼠的認(rèn)知功能受到損傷。給予橄欖苦苷腹腔注射后，手術(shù)后大鼠潛伏期縮短，穿臺次數(shù)及游泳時(shí)間增加，提示橄欖苦苷在一定程度上改善了脾切除手術(shù)后老年大鼠的認(rèn)知功能障礙。

A.假手術(shù)組；B.手術(shù)組；C.橄欖苦苷小劑量組；D.橄欖苦苷大劑量組；與手術(shù)組比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與假手術(shù)組比較，*3P<0.01。圖4 4組大鼠手術(shù)后海馬組織p-ERK1/2、n-Nrf2、總Nrf2的表達(dá)A.sham operation group；B.surgery group；C.low-dose oleuropein group；D.high-dose oleuropein group；Compared with surgery group，*1P<0.05，*2P<0.01;compared with sham operation group,*3P<0.01.Fig.4 Comparison of the expression of p-ERK1/2,n-Nrf2 and total Nrf2 in hippocampus among four groups of rats after

在正常生理情況下，機(jī)體自由基的生成和清除之間保持動態(tài)平衡，在手術(shù)創(chuàng)傷、炎癥反應(yīng)等過程中，尤其對于高齡、合并基礎(chǔ)疾病、大手術(shù)患者，由于機(jī)體清除自由基能力減弱，過多的自由基會導(dǎo)致富含脂質(zhì)的腦組織損傷。自由基可使腦組織脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA，其在體內(nèi)含量的多少反映機(jī)體過氧化程度的高低。SOD 是一種具有抗氧化作用的酶，其水平的高低反映了機(jī)體的抗氧化能力。本研究觀察到在脾切除手術(shù)后大鼠海馬組織內(nèi)MDA含量顯著增加，SOD含量顯著減少，此時(shí)大鼠潛伏期延長，穿臺次數(shù)及游泳時(shí)間減少，表明手術(shù)后由于老年大鼠腦組織內(nèi)產(chǎn)生了氧化應(yīng)激損傷，從而影響了大鼠的認(rèn)知功能。橄欖苦苷組大鼠海馬組織內(nèi)MDA含量減少，SOD增加，潛伏期縮短，穿臺次數(shù)及游泳時(shí)間增加，表明橄欖苦苷發(fā)揮了抗氧化作用，改善了大鼠的認(rèn)知功能。

Nrf2是抗氧化系統(tǒng)重要的調(diào)控因子，生理狀態(tài)下，結(jié)合狀態(tài)的Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)中。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2激活并解離，進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)位點(diǎn)相結(jié)合，調(diào)控多種抗氧化應(yīng)激蛋白酶的合成。Nrf2-ARE通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡[10-11]，屬于機(jī)體自身內(nèi)源性抗氧化酶防御體系。文獻(xiàn)表明三七總皂苷可能通過上調(diào)Nrf2/ARE 信號通路，激活內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)如血紅素氧合酶-1(HO-1)、SOD、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，從而抑制Aβ25 -35誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡[12]。多種信號通路參與對Nrf2轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，如作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族中的一個(gè)重要的亞族，ERK通過磷酸Nrf2的方式使其激活解離，發(fā)生核轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)下游抗氧化基因表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[13-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)后1 d，手術(shù)組的大鼠海馬組織內(nèi)p-ERK1/2、n-Nrf2及總Nrf2水平無變化，手術(shù)后3，5 d其表達(dá)均顯著降低。這可能因?yàn)槔夏甏笫竺庖呦到y(tǒng)調(diào)節(jié)能力下降，早期適度的手術(shù)后應(yīng)激可促進(jìn)Nrf2的表達(dá)，發(fā)揮內(nèi)源性抗氧化作用，而過度的氧化應(yīng)激會導(dǎo)致腦組織產(chǎn)生大量的氧自由基，超過了脆弱的海馬組織的代償能力，造成Nrf2表達(dá)的下降和核移位減少[15]。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察到手術(shù)后第1天，大鼠的穿臺次數(shù)及游泳時(shí)間與假手術(shù)組比較沒有變化，也推測可能是手術(shù)后大鼠體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮了一定的抗氧化作用。有研究顯示在創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織內(nèi)Nrf2-ARE參與了內(nèi)源性的防御機(jī)制，其表達(dá)水平在創(chuàng)傷24 h到達(dá)高峰，其后逐漸下降[16]。手術(shù)后橄欖苦苷組大鼠海馬組織p-ERK1/2表達(dá)增加，細(xì)胞核內(nèi) Nrf2及總的Nrf2表達(dá)增加，提示橄欖苦苷能夠顯著上調(diào)大鼠海馬組織中p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)Nrf2的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成，拮抗手術(shù)造成的氧化應(yīng)激損傷，改善老年大鼠手術(shù)后認(rèn)知功能。

總之，本研究初步表明，橄欖苦苷能夠明顯改善脾切除手術(shù)后老年大鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與其抑制激活Nrf2/ERK通路有關(guān)。