陳曉颙，辜明

(1.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，武漢 430075；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022)

腦立清片由薄荷腦、冰片、磁石、赭石、珍珠母、牛膝等十余味中藥材組成，具有平肝潛陽、醒腦安神之功效，用于頭暈?zāi)垦！⒍Q口苦、心煩難寐及高血壓，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》(第十九冊)[1]。腦立清片為國家醫(yī)保目錄品種，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅收載了處方、制法、性狀、顯微鑒別及薄層鑒別等項(xiàng)目，難以有效控制藥品質(zhì)量及用藥安全性。近年來，隨著中藥制劑研究的不斷深入以及藥物分析技術(shù)的快速發(fā)展，對中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂也提出更高的要求。

腦立清片全國共有3家生產(chǎn)企業(yè)，3個批準(zhǔn)文號，筆者對其中2家生產(chǎn)企業(yè)的6批腦立清樣品進(jìn)行研究，增加了牛膝的顯微鑒別、磁石、赭石的理化鑒別，增加了牛膝、豬膽汁的薄層鑒別，采用氣相色譜法對薄荷腦、冰片的含量進(jìn)行了測定，并采用原子吸收分光光度法測定了制劑中鐵的含量，修訂后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可對腦立清片進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量測定，能夠有效評價與控制其質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 奧林巴斯BX53顯微照相系統(tǒng)；Agilent 7890A氣相色譜儀及FID檢測器；TAS-986原子吸收分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；XP205電子天平[梅特勒-托尼多儀器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]；Agilent HP-INNOWax(30.0 mm×250 mm，0.25 mm)彈性石英毛細(xì)管柱。

1.2試藥 齊墩果酸對照品(批號：110709-200304)、豬去氧膽酸對照品(批號：0087-9708)、薄荷腦對照品(批號：0728-200006)、龍腦對照品(批號：110881-200706，含量：99.2%)均來自中國食品藥品檢定研究院；鐵元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 mg·mL-1，中國計量科學(xué)院國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)；其余所有試劑均為分析純或優(yōu)級純；6批腦立清片樣品分別來源于A(批號：091104，101104，100803)及B(批號：10515，100506，100803)兩家生產(chǎn)企業(yè)。

2 方法與結(jié)果

2.1顯微特征鑒別 取腦立清樣品研細(xì)，置顯微鏡下觀察(圖1)，草酸鈣砂晶充塞于薄壁細(xì)胞中(牛膝)。不規(guī)則碎塊，表面多不整齊，呈明顯的顆粒性(珍珠母)。草酸鈣針晶束存在于橢圓形黏液細(xì)胞中或隨處散在(清半夏)。

2.2理化鑒別 取腦立清樣品適量，研細(xì)，取約1 g，用水淘洗，可得少量棕褐色沉淀。取沉淀，加鹽酸2 mL，振搖，濾過，取濾液，加硫氰酸銨試液2滴，即顯血紅色。取缺赭石、磁石的陰性樣品，同法處理，結(jié)果不顯血紅色。

2.3薄層色譜鑒別

2.3.1牛膝的鑒別

①溶液制備。取腦立清樣品適量，研細(xì)，取約5 g，加乙醇30 mL，加熱回流40 min，放冷，濾過，取濾液15 mL，加鹽酸1 mL，加熱回流1 h，放泠，加水20 mL，用石油醚(60～90 ℃)15 mL振搖提取4次，提取液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。按處方中比例制備缺牛膝的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。取齊墩果酸對照品，加乙醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

②色譜條件。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502[5])實(shí)驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL，對照品溶液3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層預(yù)制板上，以三氯甲烷-甲醇(40：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[2-4]。

③鑒別結(jié)果。供試品溶液、陰性對照溶液及對照品溶液在上述色譜條件下進(jìn)行薄層色譜鑒別，結(jié)果見圖2?？梢?，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，供試品色譜中顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。

2.3.2豬膽汁的鑒別

①溶液制備。取腦立清樣品適量，研細(xì)，取約5 g，加甲醇40 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0%氫氧化鈉溶液10 mL，在120 ℃加熱4 h，放冷，加水30 mL充分溶解，濾過，濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，搖勻，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次15 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。按處方中比例制備缺豬膽汁的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。另取豬去氧膽酸對照品，加乙醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

②色譜條件。按照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502[5])實(shí)驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以異辛烷-乙醚-正丁醇-冰醋酸-水(10：5：3：5：1)的上層溶液為展開劑(臨用新配)，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[6]。

③鑒別結(jié)果。供試品溶液、陰性對照溶液及對照品溶液在上述色譜條件下進(jìn)行薄層色譜鑒別，結(jié)果見圖3?？梢姡谂c對照品色譜相應(yīng)位置上，供試品色譜中顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。

圖1 腦立清片顯微圖(15×20)Fig.1 Microscopic characteristics of Naoliqing tablets(15×20)

1.齊墩果酸對照品；2～4.供試品溶液；5.缺牛膝的陰性對照樣品。圖2 牛膝的薄層色譜圖1.oleanolic acid reference；2-4.test samples；5.negative reference without Achyranthis Bidentatae Radix.Fig.2 TLC of Achyranthis Bidentatae Radix

1.豬去氧膽酸對照品；2～4.供試品溶液；5.缺豬膽汁的陰性對照樣品。圖3 豬膽汁的薄層色譜圖 1.hyodeoxycholic acid reference；2-4.test samples；5.negative reference without Fel Suillus.Fig.3 TLC of Fel Suillus

2.4含量測定

2.4.1薄荷腦和龍腦的含量測定

①色譜條件。Agilent HP-INNOWax(30.0 mm×250 mm，0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，氮?dú)?N2)為載氣，流速：1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量：2 μL，柱溫160 ℃；理論板數(shù)以龍腦和薄荷腦峰計算均不低于10 000。與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的分離度>1.5[7-15]。

②溶液的制備。對照品溶液：取水楊酸甲酯適量，精密稱定，加無水乙醇制成每毫升含約10 mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液；另取龍腦對照品約10 mg、薄荷腦對照品約10 mg置10 mL量瓶中，加無水乙醇溶解后稀釋至刻度；再精密吸取2 mL，置10 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得龍腦和薄荷腦對照品溶液。

供試品溶液：取本品20片，精密稱定，研細(xì)，混勻，取約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入無水乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，取出放冷，再稱定質(zhì)量，用無水乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

陰性對照溶液：按照腦立清片的處方比例分別制備缺冰片和薄荷腦的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法，制成陰性對照溶液。

③專屬性實(shí)驗(yàn)。精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，注入氣相色譜儀分析(圖4)，結(jié)果表明陰性樣品無干擾，樣品與內(nèi)標(biāo)之間無干擾。

④線性關(guān)系考察。精密稱取水楊酸甲酯0.531 4 g，置于50 mL量瓶中加適量無水乙醇溶解后，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另精密稱取龍腦對照品51.81 mg、薄荷腦對照品49.85 mg，置25 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密吸取此對照品溶液0.3，1.0，2.0，3.0，5.0 mL，置10 mL量瓶中，再精密吸取上述內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，分別加入量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別吸取上述5種系列對照品溶液各2 μL，注入氣相色譜儀，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，以對照品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)水楊酸甲酯的峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，回歸方程為：薄荷腦：Y=1.537X+0.000 7，r=0.999 9和龍腦：Y=1.574 5X+0.010 8，r=0.999 9。結(jié)果表明，龍腦對照品在0.061 6～1.028 0 mg·mL-1；薄荷腦對照品在0.059 8～0.997 0 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

⑤重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。精密稱取樣品6份(批號：100515)，按“2.4.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果樣品中龍腦和薄荷腦的含量分別為每片2.06和1.06 mg，RSD分別為1.88%和2.35%。

A.對照品+內(nèi)標(biāo)；B.供試品+內(nèi)標(biāo)；C.缺冰片的陰性對照+內(nèi)標(biāo)；D.缺薄荷腦的陰性對照+內(nèi)標(biāo)；1.薄荷腦；2.龍腦；3.內(nèi)標(biāo)(水楊酸甲酯)。圖4 腦立清片氣相色譜圖A.reference and internal standard；B.sample and internal standard；C.negative control without borneol and internal standard；D.negative control without menthol and internal standard；1.menthol；2.borneol；3.internal standard(methyl acetylsalicylate).Fig.4 GC choromatograms of Naoliqing tablets

⑥回收率實(shí)驗(yàn)。精密稱取6份已測定含量的樣品各1 g(批號：100515；含量：龍腦4.10 mg·g-1，薄荷腦2.10 mg·g-1)，精密加入混合對照溶液(龍腦：2.086 mg·mL-1、薄荷腦：1.052 mg·mL-1)2 mL，按“2.4.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定含量，計算加樣回收率，結(jié)果見表1，2。龍腦和薄荷腦的平均回收率分別為101.40%和102.70%，RSD分別為0.92%和1.26%。

⑦穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。精密吸取供試品溶液(批號：100515)2 μL，于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算龍腦、薄荷腦與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比，其RSD分別為1.59%和0.41%，說明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 腦立清片中龍腦和薄荷腦回收率測定結(jié)果Tab.1 Recovery results of borneol and menthol in Naoliqing tablets

表2 樣品的含量測定結(jié)果Tab.2 Content detection of borneol and menthol in samples

⑧樣品的測定。取6批樣品，按“2.4.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取2 μL注入氣相色譜儀，記錄峰面積，計算含量，結(jié)果見表2。

2.4.2磁石、赭石中鐵含量的測定

①測定條件。波長：248.3 nm；狹縫：0.2 nm；燈電流：3.0 mA；光源為鐵空心陰極燈。采用空氣-乙炔火焰；空氣流量：7.0 L·min-1；乙炔流量：1.7 L·min-1[16-20]。

②溶液的制備。對照品溶液的制備：精密量取鐵元素標(biāo)準(zhǔn)液(中國計量科學(xué)院國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，含量：1000 μg·mL-1)，配制成0.5，1.0，2.0，5.0及10.0 g·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

供試品溶液的制備：取本品20片，研細(xì)，混勻，取約0.1 g，精密稱定，置凱氏燒瓶中，加硝酸-高氯酸(4：1)15 mL，混勻，瓶口加以小漏斗，浸泡過夜。置電熱板上加熱消解，保持微沸，若變棕黑色，再加硝酸-高氯酸(4：1)混合溶液適量，持續(xù)加熱至溶液澄明后升高溫度，繼續(xù)加熱至冒濃煙，直至白煙散盡，消解液呈無色透明或略帶黃色，放冷，轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中，用2%硝酸溶液洗滌容器，洗液合并于量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。同法同時制備試劑空白溶液。

③標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。取“2.4.2②”項(xiàng)下的鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，采用火焰法測定，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，計算回歸方程：A=0.009 7C-0.038 6，r=0.999 48。結(jié)果表明，鐵檢測濃度在0.5～10.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

④重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。精密稱取樣品6份(批號：100521)，按“2.4.2②”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測定，結(jié)果樣品總鐵含量為每片11.42 mg，RSD為3.41%，表明本方法重復(fù)性良好。

⑤回收率實(shí)驗(yàn)。精密稱取稱取6份已測定含量的樣品各0.05 g(含量：23.45 mg·g-1)，分別精密加入鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 mg·mL-1)1 mL，按“2.4.2②”項(xiàng)下方法制備樣品并測定，計算加樣回收率，結(jié)果表明，平均加樣回收率為100.83%，RSD為1.46%(表3)。

表3 鐵回收率測定結(jié)果Tab.3 Recovery results of Fe

⑥樣品的測定。取6批樣品，按“2.4.2②”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定，計算含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品的含量測定結(jié)果Tab.4 Content detection of samples

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對腦立清片的顯微鑒別、理化鑒別及薄層色譜鑒別方法均進(jìn)行了增修，增加了冰片和薄荷腦的氣相色譜定量測定方法，并采用原子吸收分光光度法對本制劑中總鐵含量進(jìn)行了測定，從而科學(xué)、有效地評價制劑的質(zhì)量。

3.1供試品的制備方法

3.1.1冰片和薄荷腦含量測定中供試品溶液的制備 實(shí)驗(yàn)過程中分別對提取溶劑及提取方法進(jìn)行考察，采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯3種提取溶劑，超聲和回流2種提取方法測定樣品中龍腦及薄荷腦的含量，結(jié)果表明，回流提取的樣品中這2種成分含量較高；在此對回流時間進(jìn)行了考察，最終選取回流提取30 min制備供試品溶液。

3.1.2鐵含量測定中供試品溶液的制備 分別比較了濕法消解及微波消解兩種方法，經(jīng)方法對比分析，因樣品中礦物藥比較多，濕法消解過程中為非密閉式消解，方便調(diào)整酸液的用量，故最終采用濕法消解進(jìn)行樣品前處理。同時在消解過程中比較了硝酸、硝酸-高氯酸(9：1)及硝酸-高氯酸(4：1)等消解液，最終采用硝酸-高氯酸(4：1)混合液進(jìn)行濕法消解。

3.2含量測定限度的制定

3.2.1冰片和薄荷腦含量測定限度值的制定 腦立清片中冰片及薄荷腦均為原料直接投料，理論轉(zhuǎn)移率應(yīng)接近90%，但按處方量計算樣品中龍腦和樟腦的平均轉(zhuǎn)移率僅為52.8%和21.0%，分析原因可能是因?yàn)楸捅『赡X均有揮發(fā)性，如貯藏保管不當(dāng)易造成損失。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮到生產(chǎn)實(shí)際、冰片和薄荷腦藥材的質(zhì)量差異、貯存條件等的影響，并結(jié)合腦立清膠囊標(biāo)準(zhǔn)中的含量限度值，暫定本品每片含冰片(以龍腦計)為不得少于1.45 mg，含薄荷腦不得少于1.05 mg。

3.2.2冰片和薄荷腦含量測定限度值的制定 本法制劑中所用的磁石及赭石含有鐵，《中華人民共和國藥典》2015年版一部中規(guī)定磁石的含量以鐵計算不得少于50.0%，赭石的含量以鐵計算不得少于45.0%。本實(shí)驗(yàn)同樣采用原子吸收分光光度法對原藥材中的鐵含量進(jìn)行了測定，根據(jù)藥材中鐵含量的測定結(jié)果計算制劑中的平均轉(zhuǎn)移率為52.21%。根據(jù)平均轉(zhuǎn)移率，以合格藥材投料，按處方量計算制劑中的鐵含量理論值為每片16.81 mg，故最終將其限度值規(guī)定為每片16.8 mg。

3.3制劑質(zhì)量評價結(jié)果 按擬定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對收集的樣品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示A廠家的3批樣品鐵含量均不合格，即磁石、赭石含量不合格，提示部分生產(chǎn)企業(yè)樣品原料質(zhì)量較差；B廠家的3批樣品中1批龍腦含量不合格，1批在限度邊緣，因?yàn)辇埬X為原料藥直接投料，提示該企業(yè)的樣品在生產(chǎn)和貯存過程中龍腦揮發(fā)而導(dǎo)致含量偏低，可能需要改進(jìn)生產(chǎn)工藝及包裝材料，減少揮發(fā)性成分在生產(chǎn)和貯存過程的損耗。