徐煲鏵　劉瑞彬　余紹東　張應(yīng)中

摘要通過EST序列電子克隆技術(shù)，獲得參與茶樹光合作用的SBPase基因的eDNA拼接序列，對序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。本研究結(jié)果可為今后開展山茶屬植物光合基因的功能研究奠定重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 茶樹;SBPase基因;生物信息學(xué)

中圖分類號 S571.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）07-0017-03

茶樹（Camellia?sinensis）屬山茶科山茶屬，為多年生常綠木本植物。葉子呈橢圓形，邊緣有鋸齒，葉間開五瓣白花;果實扁圓，呈三角形，果實開裂后露出種子。春、秋2季可采摘茶樹嫩葉制茶。

目前對主要經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物的光合作用研究較多，對茶樹光合作用的研究相對較少，且研究主要集中在影響茶樹光合作用的生理生態(tài)因素及茶樹品種、樹齡.葉位及冠層間光合特性比較等方面"，與光合作用相關(guān)的分子生物學(xué)研究，例如酶的基因序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等分子水平上的研究就更少。

光合生物固定CO2的限速步主要集中在暗反應(yīng)，而其中的Calvin循環(huán)（也稱C3循環(huán)）是所有光合生物碳素光合流動過程的中心環(huán)節(jié)。SBPase基因的表達(dá)產(chǎn)物為景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶（sedoheptulose-bisphosphatase，SBPase）。該酶是卡爾文循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，不可逆地催化景天庚酮糖-1，7-二磷酸去磷酸化，生成景天庚酮糖-7-磷酸。景天庚酮糖-7-磷酸經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2的受體核酮糖-1，5-二磷酸。因此，SBPase是植物光合作用途徑的主要限速酶之一（231。

電子克?。╥n?silico?cloning）是近幾年伴隨著基因組計劃和表達(dá)序列標(biāo)簽EST（expressed?sequence?tag）計劃發(fā)展起來的基因克隆新方法。但是數(shù)據(jù)庫中的EST數(shù)據(jù)最高精確度為97%1。許多植物物種的ESTs數(shù)據(jù)庫還沒有建立起來，實現(xiàn)全長cDNA的電子克隆還有一定的難度。

1材料與方法

1.1生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫

本研究使用的數(shù)據(jù)庫為美國生物技術(shù)信息中心（NCBI：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）。

1.2分析工具

基本BLAST檢索：ttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast;開放閱讀框分析：http：/www.ncbinm.ih.gvgorflorfig.gi;氨基酸序列翻譯：http：//web.expasyorg/translate/;

酶切圖譜分析：http：//ools.neb.com/NEBeutter2/;亞細(xì)胞定位分析：http：//www.genscript.com/wolf-psorthtml;蛋白質(zhì)序列理化性質(zhì)分析：http：//web.expasy.org/protparam/;

跨膜區(qū)域分析：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/;蛋白質(zhì)卷曲螺旋分析：http：//embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html;

信號肽分析工具：http：//www.cbs.dtu.dk/service/SignalP-3.0/;

蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測：Swiss-Model：http：/wissmodel.expasy.org/;

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測：http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html。

1.3生物信息學(xué)分析軟件

本研究使用的生物信息學(xué)分析軟件主要包括BIOEDIT、MEGACLUSTALX等。

1.4電子克隆

在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別以擬南芥光合作用酶SBPase的氨基酸序列作為探針序列，采用tBLASTn程序在茶樹EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，獲得與探針序列相似性較高的EST序列，然后進(jìn)行序列裝配，得到重疊群contig。再將裝配結(jié)果在NCBI的茶樹EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行反復(fù)檢索與裝配，直到?jīng)]有發(fā)現(xiàn)更多的EST序列出現(xiàn)后，停止裝配，通過結(jié)構(gòu)分析，最終得到完整的茶樹SBPase基因電子克隆eDNA序列。

1.5生物信息學(xué)分析

運(yùn)用BIOEDIT軟件分析基因序列的組成和特征。運(yùn)用NCBI在線ORF分析工具ORFFinder分析序列的開放閱讀框。運(yùn)用EXPASY網(wǎng)站translatetools工具將待查詢的基因序列的編碼區(qū)翻譯成氨基酸序列，然后對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測。運(yùn)用在線的NEBecutterV2.0工具對基因序列進(jìn)行酶切圖譜分析。

將待測的氨基酸序列提交至Expasy數(shù)據(jù)庫中的ProtParam工具中，得到序列的氨基酸分子式、半衰期、不穩(wěn)定性指數(shù)等值。利用BIOEDIT軟件，對編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成特點和分子量進(jìn)行分析和疏水性預(yù)測。運(yùn)用Expasy中的TMHMMServerV.2.0程序?qū)Φ鞍走M(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。數(shù)值≤0.5表示該區(qū)域為跨膜區(qū)域的可能性很小，數(shù)值>0.5表示該區(qū)域為跨膜區(qū)域的可能性較大。

本研究采用SOMPA算法對編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。將待測的氨基酸序列提交至在線的COILS?Server服務(wù)器中，分析蛋白質(zhì)卷曲螺旋。運(yùn)用在線的服務(wù)器SignalP?3.0?Server對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行信號肽分析。將序列提交到在線服務(wù)器SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。本研究使用NetPhos3.1軟件進(jìn)行serine、threonine和tyrosine磷酸化位點預(yù)測。運(yùn)用在線服務(wù)器WoLFPSORT，進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位分析。

運(yùn)用NCBI上的BLAST檢索工具搜索序列的同源性序列，將具有較高同源性的序列用ClustalX程序進(jìn)行序列比對。再將比對結(jié)果，使用Mega程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1茶樹SBPase基因cDNA序列及編碼氨基酸序列

通過數(shù)據(jù)庫檢索與裝配，得到茶樹SBPase基因的eDNA電子克隆序列（圖1）。序列分析結(jié)果顯示，SBPase基因全長為1621bp，132～1301為該基因的編碼區(qū)，編碼框長度為1170bp，共編碼389個氨基酸。ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子（圖2）。

2.2翻譯后修飾位點預(yù)測及信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)分析

翻譯，后修飾位點預(yù)測結(jié)果顯示，SBPase蛋白磷酸化位點共有48個，其中Ser磷酸化位點有32個、Thr磷酸化位點有12個，Tyr磷酸化位點有4個。Ser磷酸化位點分別位于19、24、272930、32、3436、37、3942、44、49、57、61、66、67、77、106、110、120、148、166、176、255、308、310、311.336、341、360、376.Thr磷酸化位點分別位于23、63、7086、186、197、216、217、281.307、354371。Tyr磷酸化位點分別位于268、280、334、372。

蛋白信號肽分析結(jié)果顯示，由神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分析得出的C（0.370）、Y（0.200）、S（0.636）值可知SBPase編碼蛋白的Y、C值不太高，信號肽曲線不典型，表明該蛋白質(zhì)沒有信號肽。同時，隱馬爾夫模型分析結(jié)果也進(jìn)一步證明了該結(jié)論?？缒そY(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，SBPase跨膜區(qū)域存在的可能性較小，預(yù)測SBPase蛋白不存在跨膜區(qū)域，屬于非跨膜蛋白。2.3蛋白質(zhì)二級與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

本研究運(yùn)用了SOMPA算法對蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果如表1所示。

將蛋白序列提交到SWISS-MODEL，得到蛋白質(zhì)的三維預(yù)測結(jié)構(gòu)模型（圖3）。其中，深紅色表示為a螺旋，黃色表示為β折疊，淡藍(lán)色表示為轉(zhuǎn)角，其他殘基為白色。得到的結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測基本吻合。蛋白質(zhì)卷曲螺旋分析顯示，沒有較明顯的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，45～70、100～110等處有不太明顯的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.4編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析與亞細(xì)胞定位

SBPase基因編碼的蛋白質(zhì)分子式為Cr121299N4g9OsS17，原子總數(shù)為5959，分子量為42227.40，不穩(wěn)定性指數(shù)為34.83，為穩(wěn)定性蛋白，主要氨基酸殘基數(shù)為Ser40、Leu38、Gly35，堿性氨基酸殘基數(shù)為43，酸性氨基酸殘基數(shù)為44;等電點為6.55，平均疏水性為-0.085。

利用BIOEDIT軟件對基因編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，根據(jù)負(fù)值越大表示蛋白親水性越強(qiáng)、正值越大表示蛋白疏水性越強(qiáng)、介于-0.5～0.5的主要為兩性氨基酸的規(guī)律問，預(yù)測結(jié)果（圖4）為SBPase酶的最高值為1.7，位于第322位，表示疏水性最強(qiáng);最低值-1.8出現(xiàn)在第358位，親水性最強(qiáng)。結(jié)合ProtPram預(yù)測結(jié)果，可推測茶樹SBPase酶為親水性蛋白。

根據(jù)亞細(xì)胞定位分析結(jié)果，預(yù)測SBPase蛋白分布在葉綠體內(nèi)。

2.5系統(tǒng)進(jìn)化分析

將SBPase氨基酸序列提交到數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），可以看到有多條氨基酸序列與SBPase氨基酸序列有較高的相似性，其中茶樹SBPase氨基酸序列與番茄（Solanum?lycopersicum）、毛果楊（Populus?trichocarpa）、可可（Theobroma?cacao）、長蒴黃麻（Corchorus?olitorius，'）、煙草（Nicotianatabacum）相似性較高，分別為82%、80%、82%、82%、81%。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，SBPase蛋白屬于FIG家族，具有1個典型的PLN02462保守結(jié)構(gòu)域。

3結(jié)論與討論

通過EST序列電子拼接技術(shù)，獲得茶樹SBPase基因cDNA序列，序列全長為1681bp，開放閱讀框長度為1170bp，可編碼389個氨基酸，理論分子量為42227.40，平均疏水性為-0.085，預(yù)測等電點為6.55，不穩(wěn)定性指數(shù)為34.83。SBPase為穩(wěn)定性蛋白，在細(xì)胞內(nèi)有較好的穩(wěn)定性，能參與植物的光合作用。從蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析上看，SBPase蛋白不含有明顯的跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白。SBPase蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由螺旋、折疊和線圈構(gòu)成，卷曲占少量比例，屬于mixed型。SWISS-MODEL預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)主要由螺旋、折疊和線圈構(gòu)成，卷曲占少量比例。由蛋白質(zhì)信號肽分析可知，SBPase蛋白信號肽曲線不典型，所以推測該蛋白沒有明顯的信號肽。該蛋白不是分泌蛋白，只在細(xì)胞內(nèi)參與反應(yīng)。結(jié)果顯示，茶樹SBPase酶在系統(tǒng)進(jìn)化上與煙草SBPase酶關(guān)系較近。

劉遜亮發(fā)現(xiàn)，SBPase蛋白的結(jié)構(gòu)變化可以抑制植物的光合碳同化效率，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育葉綠體生成和結(jié)實率。轉(zhuǎn)基因結(jié)果顯示，超表達(dá)楊樹SBPase基因，可以促進(jìn)擬南芥碳水化合物的積累，利于RuBP的形成和淀粉等多糖的合成，增強(qiáng)植物的光合作用8。開展茶樹SBPase基因的電子克隆與生物信息學(xué)分析，可以為山茶屬植物相關(guān)光合作用基因的克隆及結(jié)構(gòu)與功能研究提供支撐。

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