方婉， 劉雅詩， 劉龍輝， 張子鑫， 劉小玲， 李燕霞， 楊愛成△

1湖南中醫(yī)藥大學研究生院(湖南長沙 410000)； 2暨南大學附屬江門市中醫(yī)院腎病科(廣東江門 529000)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)常見而且較嚴重的并發(fā)癥之一就是糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)。DN起病隱匿，早期常無明顯臨床癥狀，病情逐漸進展出現(xiàn)高血壓、尿蛋白陽性即DN蛋白尿期，最終發(fā)展至終末期腎功能衰竭，這是最重要的糖尿病導致死亡的原因之一[1]。腎康丸(Shenkangwan)是魏連波教授通過多年的臨床觀察有效治療DN的經(jīng)驗方劑，方藥中各單味藥均具有或兼具免疫調(diào)節(jié)作用。前期，筆者從臨床研究[2]發(fā)現(xiàn)，腎康丸通過減少DN患者炎癥因子的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生腎保護作用。依那西普(etanercept)是重組人Ⅱ型受體-抗體融合蛋白，是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)拮抗劑，故可以抑制TNF-α，從而有控制炎癥、阻斷病情進展的作用，它屬抗風濕藥物(DMARD)，是抗風濕病的生物制劑，對腎臟保護作用。我們于2014年6月至2018年6月開展本研究，通過腎康丸及依那西普作用于T2DM，觀察其對于T2DM大鼠腎臟腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TRAIL)系統(tǒng)表達的影響，為防治DN尋找新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選取2月齡，體重170～200 g的清潔級近交系Wistar雄性大鼠60只，購買于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2006-0015。

1.1.2 受試藥品 依那西普(注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白；英文名稱：Recombinant Human Tumor Necrosis Factor-Receptor)，12.5 mg/支。腎康丸(組成：黃芪、芡實、金櫻子、玉米須等)，6 g/包。

1.1.3 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)；檸檬酸緩沖液；10%水合氯醛；10%甲醛；血清尿微量清蛋白(UmAlb) ELISA及尿α1-微球蛋白(Uα1-MG)試劑盒；普通PCR試劑，重組鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)、Trizol，Q-RT-PCR試劑。

1.2 動物模型制備 根據(jù)文獻，制作T2DM大鼠模型。所有大鼠均自由進水，適應性喂養(yǎng)7 d后隨機將其分為兩組：正常對照組(C組) 12只，模型組(D組)48只，分別給予標準飼料及高脂高糖飼料(標準飼料∶蔗糖∶煉豬油∶奶粉∶雞蛋=63.5%∶20%∶10%∶4%∶2.5%)喂養(yǎng)。4周后，在大鼠空腹狀態(tài)下(所有大鼠禁食12 h)，C組注射檸檬酸緩沖液(30 mg/kg)，D組大鼠腹腔注射等量的STZ，注射72 h后尾靜脈采血測血糖，連續(xù)2次空腹血糖(FBG)≥13.5 mmol/L者即為T2DM大鼠模型成功。

1.3 動物分組 從造模成功的D組大鼠中選擇36只符合DM診斷標準的大鼠，隨機分配將其分為3組：DM模型組(DM組)12只,依那西普治療組(DE組)12只，腎康丸治療組(DS組)12只。DE組大鼠給予腹部皮下注射依那西普(劑量2 mg/kg，1周2次)；DS組大鼠予腎康丸(350 mg/d，相當于成人18 g/d)灌胃。C組和DM組大鼠灌服相應體積的生理鹽水。實驗期間C組大鼠、D組所有大鼠繼續(xù)分別予標準飼料喂養(yǎng)、高脂高糖飼料喂養(yǎng)。實驗室室溫保持在20～24℃，相對濕度維持在40%。

1.4 標本收集、處理 給予藥物第4周時，從每組大鼠中隨機選6只大鼠留取尿液；于處死前1 d對此6只大鼠禁食12 h后并稱體重，選取腹主動脈采血(10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉動物)，分離血清，-20℃保存。處死大鼠選取左側(cè)腎臟，稱得腎臟重量，沿正中矢狀面剖開，用PBS沖洗干凈，去包膜，10%甲醛中性緩沖液固定以做HE染色，取右腎放入液氮保存，用于Q-RT-PCR檢測。給予藥物第8周時，每組另外6只大鼠按上述方法處理。

1.5 檢測指標

1.5.1 血清生化指標 全自動生化分析儀檢測大鼠血肌酐(Scr)、尿素(BUN)、FBG。

1.5.2 尿液標本 ELISA試劑檢測Uα1-MG和24 h UmAlb。

1.5.3 Q-RT-PCR檢測TNF-α、TRAILT、DR4、DcR2在各大鼠腎組織的表達 采用Sybrgreen染料法，以β-actin為內(nèi)參基因，對于觀察指標在腎組織的表達量進行檢測。首先設計并合成Q-RT-PCR引物，序列如下：β-actin(EF-156276)：β-actin-F 5′-CCAAC-CGTGAAAAGATGACCC-3′，長度21 bp，擴增長度113 bp；β-actin-R 5′-AATGCCAGTGGTACGACCAGAG-3′，長度22 bp。DcR2(NM-003840)：DcR2-F 5′-ATCTGCTCAGGTGGTGGA-3′，長度18 bp，擴增長度118 bp ；DcR2-R 5′-TACTCAGGGTCTCGTTGC-3′，長度18 bp。DR4(NM-0038 44)：DR4-F 5′-TGTTGCATCGG-CTCAGGTTG-3′，長度20 bp，擴增長度132 bp；DR4-R 5′-CGAGTCTGCGTTGCTCAGAA-3′，長度20 bp。TRAIL(NM-14 5681)：TRAIL-F 5′-GAAGAGTGCCAGA AATAGC-3′，長度19 bp，擴增長度140 bp；TRAIL-R 5′-GGTCCAGGTCCATCAAAT-3′，長度18 bp。然后行總RNA抽提，再經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應、普通PCR反應后，進行實時熒光定量PCR檢測。制作標準曲線，用PCR儀檢測，根據(jù)標準曲線公式計算樣本拷貝數(shù)。

1.5.4 大鼠腎臟病理學 HE染色法在顯微鏡下觀察拍照(取甲醛中性緩沖液中保存的左腎石蠟包埋，經(jīng)脫水、浸蠟包埋、組織切片、染色)。

2 結(jié)果

2.1 治療后各組大鼠血生化變化 給藥第4周，D組大鼠BUN均升高，與C組比較其差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；DM組BUN與DS組、DE組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而DS組與DE組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給藥第8周后，D組與C組對比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DM組與其他各組比較差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)；DS組BUN較DE組降低，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

給藥后第4周，D組大鼠Scr均升高，C組與DM組、DS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；DE組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與DM組、DS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；DS組與DM組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。給藥后第8周，DM組Scr進一步升高，與其他3組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；DS組與C組、DE組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

給藥后第4周、第8周，相比于C組，D組大鼠FBG明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；第4周相比于DM組，DS組、DE組大鼠FBG降低，第8周時更明顯，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 治療后各組大鼠BUN、Scr、FBG變化

表1 治療后各組大鼠BUN、Scr、FBG變化

組別nBUN(mmol/L)Scr(μmol/L)FBG(mmol/L)4周8周4周8周4周8周C組65.53±1.155.20±0.7349.18±4.7450.35±5.165.23±0.525.18±0.41DM組612.38±1.68??15.76±2.45?75.43±11.07??▲81.57±10.01??22.65±3.35??22.99±2.15??DS組610.25±1.36??△7.74±1.58?△△69.27±8.60??▲55.68±9.97△△20.02±1.63??18.92±2.53??DE組610.07±2.37??△9.88±1.81?△△50.67±6.0651.50±3.39△△20.78±5.85??16.68±6.77??

與C組比較*P<0.05,**P<0.01；與DM組比較△P<0.05,△△P<0.01；▲與DE組比較P<0.01

2.2 治療后各組大鼠Uα1-MG、UmAlb變化 治療后第4、8周，D組大鼠Uα1-MG明顯升高，與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；DM組與DS組、DE組對比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.01)。DS組與DE組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

治療后第4、8周，D組大鼠UmAlb升高，DM組升高最顯著，與各組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；C組與DS組、DE組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；DS組與DE組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 治療后各組大鼠Uα1-MG、UmAlb比較

表2 治療后各組大鼠Uα1-MG、UmAlb比較

組別nUα1-MGUmAlb4周8周4周8周C組60.38±0.030.41±0.049.13±2.45△9.81±2.94△DM組61.51±0.15?2.38±0.23?17.85±2.6323.26±3.65DS組60.82±0.08?△1.09±0.18?△9.74±2.10△11.68±3.19△DE組60.81±0.09?△1.06±0.14?△9.78±2.41△11.73±2.62△

*與C組比較P<0.01；△與DM組比較P<0.01

2.3 治療后各組大鼠腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體變化 治療后第4、8周，DM組TNF-α mRNA表達明顯升高，與其余3組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；C組與DS組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與DE比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

第4、8周時，實驗中的C組TRAIL mRNA表達明顯較其他組別高，與DM組、DS組、DE組比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；DM組與DS組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與DE組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；DE組與DS組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表4。

表3 各組大鼠治療后TNF-α mRNA變化比較

表3 各組大鼠治療后TNF-α mRNA變化比較

組別n4周8周C組60.59±0.12△0.63±0.25△DM組61.48±0.161.54±0.30DS組60.92±0.33△▲1.02±0.25△▲DE組60.73±0.35△0.72±0.23△

△與DM組比較P<0.01；▲與C組比較P<0.05

第4、8周時，實驗中C組DR4 mRNA表達明顯升高，與DM組、DS組、DE組比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；DM組與DS組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與DE組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；DE組與DS組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

第4、8周時，實驗中C組DcR2 mRNA呈低表達，與DM組、DS組、DE組比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；DM組呈高表達，與DS組、DE組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；相對比DS組，DE組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 TRAIL mRNA、DR4 mRNA、DcR2 mRNA在各組大鼠腎組織的表達

表4 TRAIL mRNA、DR4 mRNA、DcR2 mRNA在各組大鼠腎組織的表達

組別nTRAILmRNADR4mRNADcR2mRNA4周8周4周8周4周8周C組62.33±0.272.35±0.331.96±0.201.99±0.410.69±0.080.71±0.11DM組60.56±0.13?0.71±0.18?0.53±0.07?0.71±0.26?1.77±0.28?1.95±0.29?DS組61.16±0.23?△1.25±0.23?△1.06±0.40?△1.16±0.29?△1.18±0.24?△0.96±0.20?△DE組60.67±0.14??0.74±0.15?▲0.64±0.38?▲▲0.67±0.27?▲▲1.19±0.34?△1.35±0.19?△

*與C組比較P<0.01；△與DM組比較P<0.01；與DS組比較▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.4 各組大鼠腎臟光鏡下病理表現(xiàn) 光鏡下見正常對照C組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，未見增生及萎縮，球囊壁光滑，細胞外基質(zhì)與系膜細胞分布正常，毛細血管腔清晰。第4周時光鏡下見DM組大鼠腎小球明顯增大，腎小球腫脹、空泡變性，部分腎小球GBM增厚、腎小球系膜增寬；第8周時，上述改變更加明顯。經(jīng)藥物治療后大鼠腎臟病變較DM組減輕，其中DS組最明顯，DE組次之，表現(xiàn)為腎小球肥大減輕，腎小球GBM增厚、腎小球系膜增寬有所改善。見圖1。

3 討論

糖尿病患者中有25%～40%最終出現(xiàn)DN[3]。DN是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一,是引起終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因,是1型糖尿病的主要死因，是嚴重威脅患者生命健康的首要原因[4-5]。DN在古代祖國醫(yī)學尚未統(tǒng)一名字，中醫(yī)的“腎消”、“水腫”、“腎勞”、“關(guān)格”等病的癥狀與DN相似，《素問奇病論》首次出現(xiàn)消渴之名，漢代張仲景《金匱要略》首見消渴腎?。骸澳凶酉?，小便反多，以飲一斗，小便一斗，腎氣丸主之”。現(xiàn)代醫(yī)家呂仁及任繼學、南征等研究了大量文獻，結(jié)合臨床實際和現(xiàn)代醫(yī)學的有關(guān)知識，提出將本病定名為：“消渴腎病”[6]。

DN本虛標實，腎康丸方含有黃芪益氣健脾，芡實、金櫻子滋陰補腎兼固澀，滋而不膩，以益氣養(yǎng)陰固腎；蟬蛻、玉米須利尿瀉熱以祛濕熱毒；水蛭、益母草、山楂活血通絡祛瘀，全方標本同治，在固護腎陰虛同時解血瘀熱毒之標。其中黃芪、金櫻子等已經(jīng)被證實具有降血糖的功效，對糖尿病患者有腎保護作用。

目前大多數(shù)人認為[7-8]UmAlb增加是腎臟損傷的重要標志，是反映腎小球受損的敏感指標，腎小管損害的程度可通過Uα1-MG即DN早期診斷的敏感指標來準確地判斷, 故本實驗以Uα1-MG及UmAlb作為早期DN的檢測指標。本研究結(jié)果顯示,DM組大鼠尿mAlb和尿α1-MG呈持續(xù)升高趨勢，DS組第4周即顯示其可以減少DM大鼠尿mAlb和α1-MG的作用，在第8周更加明顯，DE組與之有相近的作用。腎康丸及依那西普能改善T2DM2大鼠早期一般狀況，降低大鼠血糖，減少尿微量蛋白、尿α1-MG的排泄，改善大鼠腎功能，具有腎臟保護作用。通過治療，可減輕腎臟病理損害(圖1)，表現(xiàn)為腎小球肥大減輕，腎小球GBM增厚、腎小球系膜增寬有所改善，系膜細胞增生減輕；腎小管肥大、腎間質(zhì)水腫減輕。

DM的發(fā)生、發(fā)展與TRAIL系統(tǒng)密切相關(guān)，TRAIL系統(tǒng)是TNF超家族新成員，通過介導受體表達參與細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導調(diào)控。TRAIL誘導細胞的凋亡是通過與細胞表面的死亡受體(Death Recepter, DR)中的DR4、DR5與TRAIL與高度特異性結(jié)合，通過受體的胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域啟動細胞凋亡途徑，但其抑制細胞凋亡是通過與誘騙受體(decoy receptor, DcR)中的DcR1、DcR2結(jié)合。有實驗研究提示[9]，DM大鼠腎臟細胞凋亡明顯增加，主要發(fā)生在腎小管細胞，且TRAIL、DR4、DR5可能參與DM大鼠腎臟細胞凋亡的發(fā)生。在正常腎組織中DcR1沒有表達[10]，DR4和DR5在功能上非常相近，且DR4與TRAIL在腎組織表達情況相似，故本研究通過檢測DR4 mRNA、DcR2 mRNA、TRAIL mRNA以了解TRAIL系統(tǒng)對細胞凋亡的調(diào)控。本研究中，各治療組大鼠TNF-α mRNA在腎組織表達均減少，而依那西普在第4周即出現(xiàn)對TNF-α表達的明顯抑制作用，并且持續(xù)到第8周。干預治療后，DS組TRAIL和DR4在第4周、第8周均較治療前及DM組明顯增加；同時，DcR2的表達也發(fā)生了下調(diào)。DE組TRAIL和DR4的表達增加不明顯，與DM組大鼠比較無統(tǒng)計學差異，其表達量顯著低于DS組；DcR2的表達有類似的現(xiàn)象。由此可證明，腎康丸與依那西普對腎臟保護的作用機制并不一致，腎康丸可減少TNF-α在早期DN腎臟的表達，上調(diào)TRAIL及其受體DR4的表達，抑制DcR2的表達，對腎臟有保護性作用。有研究稱[11]，高糖環(huán)境下，腎小球內(nèi)皮細胞極易受損，炎癥因子激活，可誘導TNF-α等表達增加，直接破壞腎小球濾過屏障，導致直接的腎損害，在DM的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。依那西普是一種TNF-α拮抗劑[12]，可減少TNF-α mRNA的表達，阻斷關(guān)鍵性炎癥因子TNF-α與其受體結(jié)合，減少多轉(zhuǎn)導途徑引起炎癥因子(IL-6、CRP等)升高，從而減輕炎癥反應，血管平滑肌細胞增殖得到抑制，腎臟血管病變減輕，本研究證實了其對腎組織TNF-α特異性的阻斷作用，從而對腎臟的保護作用。

圖1 各組大鼠腎臟(HE，×200)

綜上所述，腎康丸與依那西普對T2DM大鼠腎臟組織均有保護作用，其作用機制并不一致。同時TRAIL在糖尿病大鼠腎臟中的表達也說明腎臟局部的免疫系統(tǒng)參與了DN的發(fā)生、發(fā)展，但其在DN中作用不清楚，其受體在DN的發(fā)病機制也需進一步探索。