李昊　陳從波　姚啟盛　龔小芳

[摘要]目的：分析腎癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）對(duì)腎癌預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。方法：使用免疫熒光法檢測(cè)107例腎腫瘤患者外周血CTCs計(jì)數(shù)，比較不同TNM分期患者CTCs計(jì)數(shù)差異。對(duì)患者治療結(jié)果進(jìn)行隨訪，隨訪終點(diǎn)為患者出現(xiàn)死亡、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或隨訪時(shí)間達(dá)到12個(gè)月。并按照患者治療結(jié)局，將腫瘤穩(wěn)定（TS）、腫瘤反應(yīng)（TR）者納入TS/TR組，將腫瘤進(jìn)展（TP）者和死亡者納入TP組，對(duì)其治療前CTCs計(jì)數(shù)進(jìn)行對(duì)比，分析CTCs評(píng)估腎腫瘤患者預(yù)后的價(jià)值。結(jié)果：107例患者平均CTCs計(jì)數(shù)為（10.82+2.73）個(gè)，I期、II期患者CTCs計(jì)數(shù)低于II期患者，II期患者CTCs計(jì)數(shù)低于IV期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。107例患者中，TS34例，TR9例，TP64例。TS/TR患者治療前CTCs計(jì)數(shù)低于TP患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：隨著腎癌TNM分期的上升，患者CTCs計(jì)數(shù)逐漸增加，且治療前較高的CTCs計(jì)數(shù)意味著更差的治療反應(yīng)，故CTCs計(jì)數(shù)能夠?yàn)榛颊哳A(yù)后評(píng)估及治療策略的調(diào)整提供一定參考。

[關(guān)鍵詞]循環(huán)腫瘤細(xì)胞;腎腫瘤;預(yù)后;評(píng)估

中圖分類號(hào)：R737.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-5200（2019）02-037-04

DOI：10.11876/mimt201902010

腎癌約占成人惡性腫瘤的2%～3%，其發(fā)病率位居泌尿系腫瘤第二位，據(jù)報(bào)道，全球每年腎癌新發(fā)病例、死亡病例分別達(dá)到20萬、10萬，較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率是造成患者死亡率居高不下的主要原因”。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulatingtumourells，CTCs）是指由腫瘤原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶播散于血液當(dāng)中的腫瘤細(xì)胞，一方面，CTCs可播散于遠(yuǎn)處形成微轉(zhuǎn)移灶并引發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移，另一方面，CTCs也是腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶間信息傳遞的重要媒介。亦有研究對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者CTCs進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CTCs與腫瘤細(xì)胞耐藥及患者生存預(yù)后密切相關(guān)間。此次研究就CTCs對(duì)腎癌預(yù)后評(píng)估的價(jià)值進(jìn)行了分析，旨在為腎癌患者預(yù)后的評(píng)估提供新的思路，現(xiàn)將研究方法與結(jié)果予以總結(jié)報(bào)告。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

此次研究已獲取醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)許可，將2014年2月至2017年12月期間于我院確診的107例腎癌患者為納人此次研究，患者均經(jīng)影像學(xué)及病理學(xué)檢查明確腎癌診斷，既往無相關(guān)治療史，對(duì)此次研究知情同意且自愿參與，排除同時(shí)合并其他類型惡性腫瘤者。107例患者中，男73例，女34例，年齡24～76歲，平均（56.81土13.42）歲，病理分型：透明細(xì)胞癌92例，非透明細(xì)胞癌15例（乳頭狀細(xì)胞癌4例、嫌色細(xì)胞癌2例、囊性腎癌2例、混合細(xì)胞癌3例、未分化癌4例）;TNM分期（2010年AJCC腎癌分期標(biāo)準(zhǔn)）4：I期61例，II期19例，期16例，IV期11例。

1.2檢測(cè)方法

采用免疫磁珠法檢測(cè)，抽取患者晨起空腹外周靜脈血10mL，加入淋巴細(xì)胞分離液，以密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞以。按照每10mL血標(biāo)本加入300μL免疫磁珠比例，將單個(gè)核細(xì)胞與磁珠混勻，于4C環(huán)境下孵育30min，使用分離緩沖液將其制成1mL細(xì)胞懸液，備用。使用磁性分離柱處理標(biāo)記的細(xì)胞懸液，使用緩沖液清洗柱體，而后移出磁性分離柱，使用稀釋緩沖液洗脫柱內(nèi)細(xì)胞。將收集的細(xì)胞液離心處理后加入1mL緩沖液，于光鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以3個(gè)視野內(nèi)平均值作為CTCs計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.3療效判斷

患者均在我院接受治療，隨訪時(shí)間6～12個(gè)月，隨訪終點(diǎn)為患者出現(xiàn)死亡、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或隨訪時(shí)間達(dá)到12個(gè)月。療效判斷通過治療前、治療后CT檢查結(jié)果，取病灶最大橫徑、最大縱徑乘積計(jì)算腫瘤大小，治療后原發(fā)腫瘤縮小為腫瘤反應(yīng)（tumorresponsible，TR），原發(fā)腫瘤無變化為腫瘤穩(wěn)定（tumorstable，TS），原發(fā)腫瘤增大或出現(xiàn)復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為腫瘤進(jìn)展（tumorprogression，TP）死亡病例計(jì)人進(jìn)展組。

1.4分析方法

比較不同TNM分期患者CTCs計(jì)數(shù)差異，并按照患者治療結(jié)局，將腫瘤穩(wěn)定（TS）、腫瘤反應(yīng)（TR）患者納入TS/TR組，將腫瘤進(jìn)展（TP）患者納入TP組，對(duì)其治療前CTCs計(jì)數(shù)進(jìn)行對(duì)比，分析CTCs評(píng)估腎腫瘤患者預(yù)后的價(jià)值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)本臨床研究的所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CTCs計(jì)數(shù)以（x±s）表示，并采用t檢驗(yàn)或F檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果

2.1不同TNM分期患者CTCs計(jì)數(shù)結(jié)果

107例患者平均CTCs計(jì)數(shù)為（10.82±2.73）個(gè)，不同分期的CTCs計(jì)數(shù)分布見圖1和表1，I期、II期患者CTCs計(jì)數(shù)低于II期患者，II期患者CTCs計(jì)數(shù)低于IV期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2不同治療結(jié)局患者CTCs計(jì)數(shù)結(jié)果

107例患者中，TS34例，TR9例，TP64例。TS/TR患者治療前CTCs計(jì)數(shù)低于TP患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3討論

既往報(bào)道表明，近1/3的腎癌患者確診時(shí)已存在轉(zhuǎn)移灶，同時(shí)，約有40%的患者會(huì)在治療后1年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，其原因與腫瘤細(xì)胞的血行播散有關(guān)功。隨著腫瘤細(xì)胞不斷增殖，部分細(xì)胞相互附著的能力下降，自母體脫落后浸潤(rùn)并降解周圍組織，進(jìn)而進(jìn)人血液或淋巴系統(tǒng)內(nèi)，故腫瘤細(xì)胞可隨血液循環(huán)到達(dá)多個(gè)組織、器官。

CTCs即為進(jìn)人血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，有學(xué)者認(rèn)為，CTCs多在短期內(nèi)死亡，僅有少數(shù)具有高度活力、高度轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞可在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)存活，相互粘附、集成，形成微小血栓，并在某些因素作用下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[9。最新研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)人循環(huán)系統(tǒng)并存活的CTCs比例高達(dá)80%以上，且CTCs可于遠(yuǎn)隔部位穿出血管壁[10，故外周血CTCs的檢出意味著腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)上升，而對(duì)于CTCs的檢測(cè)則有望了解腫瘤轉(zhuǎn)移特征、評(píng)估患者預(yù)后質(zhì)量。

為驗(yàn)證上述假設(shè)，此次研究選取107例腎癌患者，采用納米免疫磁珠結(jié)合免疫熒光法，就其外周血CTCs計(jì)數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，患者平均CTCs計(jì)數(shù)高達(dá)（10.82+2.73）個(gè)，與此同時(shí)，隨著患者TNM分期的升高，其CTCs計(jì)數(shù)呈上升趨勢(shì)，說明CTCs在腎癌轉(zhuǎn)移過程中扮演了重要角色。多數(shù)研究認(rèn)為，CTCs擁有侵襲基底膜能力，且可侵人間質(zhì)組織，隨著腫瘤的不斷增長(zhǎng)，腫瘤內(nèi)部組織缺氧狀態(tài)逐漸加劇，而組織缺氧狀態(tài)可誘發(fā)新血管與淋巴管生成，為CTCs進(jìn)入血液循環(huán)創(chuàng)造了更為便利的條件川。與此同時(shí)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展也伴隨著上皮細(xì)胞一間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，這一過程使得上皮細(xì)胞極性喪失、與基底膜連接中斷，進(jìn)而造成細(xì)胞遷移、侵襲、抗凋亡、降解細(xì)胞外基質(zhì)能力持續(xù)上升，而CTCs具有類上皮細(xì)胞特性，在上述病理改變的影響下，CTCs更易自瘤體脫離、侵人血管，并經(jīng)歷上皮細(xì)胞一間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，使腫瘤細(xì)胞對(duì)遠(yuǎn)處組織的侵襲能力大幅增強(qiáng)。除此之外，原發(fā)瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)主要來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞，而CTCs在進(jìn)人和離開血液循環(huán)的過程中均可與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，且這一作用最常發(fā)生于血流速度緩慢的毛細(xì)f血管部位;血管內(nèi)皮細(xì)胞受CTCs破壞后可釋放大量蛋白酶并加劇基底膜降解，為腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散提供了更為理想的條件[14。因此，CTCs不僅意味著腫瘤細(xì)胞較強(qiáng)的增殖、轉(zhuǎn)移能力，還與較快的腫瘤血管生成速度有關(guān)，故CTCs計(jì)數(shù)亦有望指導(dǎo)腎癌預(yù)后的評(píng)估。

本研究就不同治療結(jié)局患者治療前CTCs計(jì)數(shù)進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示，治療前較高的外周血CTCs計(jì)數(shù)與較差的預(yù)后有關(guān)，其原因考慮與治療前實(shí)體癌細(xì)胞已出現(xiàn)大范圍脫落、微轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。此外，腎癌的播散轉(zhuǎn)移方式主要包括三類，一是向外穿過腎臟被膜的直接擴(kuò)散，二是淋巴轉(zhuǎn)移，三是血行轉(zhuǎn)移[16，而CTCs的存在與增多可同時(shí)增強(qiáng)上述三種轉(zhuǎn)移途徑，加劇腎癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)階段對(duì)腎癌的療效評(píng)價(jià)主要參考影像學(xué)檢查結(jié)果，但對(duì)于病灶已完整切除的腫瘤患者的后續(xù)治療如放療、化療、靶向治療等，影像學(xué)檢查并不能為腫瘤的治療反應(yīng)做出可靠評(píng)價(jià)。有研究發(fā)現(xiàn)，CTCs計(jì)數(shù)與多種惡性腫瘤患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[7，因而通過治療期間CTCs計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)有望為治療反應(yīng)評(píng)估與生存時(shí)間預(yù)測(cè)提供一定參考。此外，亦有學(xué)者指出，鉑類藥物能夠結(jié)合癌細(xì)胞DNA，形成鏈內(nèi)、鏈間連結(jié)，發(fā)揮干擾DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等作用[18），而這一作用能夠從源頭上抑制CTCs生成，故含鉑化療方案可能能夠進(jìn)一步改善腎癌患者預(yù)后質(zhì)量。

此外，基于CTCs計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)結(jié)果，對(duì)于指導(dǎo)腎癌患者個(gè)體化治療也有著積極意義。目前對(duì)于惡性腫瘤患者而言，其治療藥物與劑量多根據(jù)TNM分期并結(jié)合臨床指南制定，但在實(shí)際臨床實(shí)踐中，不同患者對(duì)同一治療方案的治療反應(yīng)、不良反應(yīng)存在較大差別，而根據(jù)CTCs計(jì)數(shù)變化制定并調(diào)整治療方案，有望實(shí)現(xiàn)腎癌的精確化、個(gè)體化治療，從而使更多的患者獲益。同時(shí)，當(dāng)前關(guān)于腎癌發(fā)病機(jī)制的探索尚處于起步階段，在今后的研究中，進(jìn)一步明確CTCs與成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血小板等細(xì)胞在病灶轉(zhuǎn)移過程中的相互作用，能夠更深層次的了解腎癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，進(jìn)而尋求更為精確的治療靶點(diǎn)，豐富腎癌的靶向治療策略。

需要注意的是，雖然免疫磁珠等細(xì)胞富集方法檢測(cè)CTCs的檢出率及靈敏度值得肯定，但其高昂的檢測(cè)成本限制了這一技術(shù)的廣泛推廣，進(jìn)一步改進(jìn)并探索更為簡(jiǎn)便、低成本的檢測(cè)方法，將為腎癌預(yù)后評(píng)估提供更為全面、可靠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，值得重視。

總體而言，腎癌患者外周血中普遍可檢出CTCs，隨著腎癌TNM分期的上升，其外周血CTCs計(jì)數(shù)逐漸升高，且CTCs計(jì)數(shù)較高者預(yù)后質(zhì)量往往更差，在重視CTCs檢測(cè)的基礎(chǔ)上，針對(duì)患者CTCs計(jì)數(shù)設(shè)定個(gè)體化治療方案并探索靶向治療策略，有望提高腎癌患者預(yù)后質(zhì)量和生存時(shí)間。

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