王莉　王青　隨瑞枝　宋旭梅　馬菊梅　劉燕翔　張翠霞　芮淑賢

[摘要]目的：探討產(chǎn)前篩查濾紙干血片標(biāo)本保存時間和保存條件對AFP、Freeβ-HCG檢測結(jié)果的影響。方法：采集50例孕婦血樣，每例均制備兩份濾紙干血片標(biāo)本，每一份上面包括3個血斑。一組29C～8C冷藏;另一組室溫20°C～25°C保存。分別在保存第2d、7d、14d時，用TALENT-II半自動時間分辨熒光免疫分析儀檢測AFP、Freeβ-HCG。結(jié)果：室溫組和冷藏組在2d、7d、14dAFP和Freeβ-HCG檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，AFP和Freeβ-HCG冷藏組在2d、7d、14d的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。AFP和Freeβ-HCG室溫組在2d、7d、14d的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：濾紙干血片標(biāo)本在冷藏2°C～8C、室溫20°C～25°C均可穩(wěn)定保存至14d。開展篩查時應(yīng)注重標(biāo)本保存條件和運輸時間，確保標(biāo)本質(zhì)量和篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[關(guān)鍵詞]濾紙干血片法;產(chǎn)前篩查;時間;溫度

中圖分類號：R394

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-5200（2019）02-041-04

DOI：10.11876/mimt201902011

中孕期唐氏綜合征（DS）血清學(xué)產(chǎn)前篩查的常用標(biāo)志物包括甲胎蛋白（AFP）.游離β人類絨毛膜促性腺激素（Freeβ-HCG）、游離雌三醇（uE3）和抑制素A（InhA）。血清標(biāo)本應(yīng)在49C～8C保存，不超過7d"。AFP為相對穩(wěn)定的蛋白類物質(zhì)，HCG相對不穩(wěn)定，血清標(biāo)本靜置的時間和溫度（室溫、37C）對結(jié)果影響很大。分離后的血清在49C～8C條件下可穩(wěn)定保存1周，遠距離運輸時應(yīng)有冷鏈系統(tǒng)，保證保存環(huán)境B。產(chǎn)前篩查機構(gòu)和采血機構(gòu)不在同一醫(yī)療機構(gòu)時，需要先分離出血清再保存、運送，運輸距離和保存條件不達標(biāo)導(dǎo)致邊遠地區(qū)的孕婦不能進行產(chǎn)前篩查，影響了產(chǎn)前篩查的大規(guī)模開展。干血斑法最早于1963年首次用于代謝性疾病的大規(guī)模篩查，后應(yīng)用于新生兒疾病的篩查。其具有成本低廉、血樣采集方法簡單、減少溶血和樣本降解、不需要離心、在高溫情況下穩(wěn)定、減少了運輸和儲存費用等優(yōu)勢。濾紙干血片技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前篩查領(lǐng)域是一項比較新的技術(shù)。已有文獻報道顯示同一孕婦血清學(xué)法和干血片法兩種檢測方法有很好的相關(guān)性，檢測AFP、Freeβ-HCG結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示血清法和濾紙干血片兩種方法有很好一致性。

為確保檢驗前標(biāo)本質(zhì)量及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，就有必要對產(chǎn)前篩查濾紙干血片標(biāo)本的保存時間及保存條件對AFP和Freeβ-HCG含量影響進行探討。相比已有報道，本研究延長了保存時間、擴大了保存溫度范圍，進一步研究時間和溫度對標(biāo)本的影響。

1對象與方法

1.1研究對象

50例孕15+6～20*周中孕期孕婦，單胎，取得其產(chǎn)前篩查的知情同意后，進行血清學(xué)唐氏篩查時同時制備干血片標(biāo)本。

1.2濾紙干血片法儀器和試劑

TALENT-II半自動時間分辨熒光免疫分析儀;FWZ-I型微量振蕩器;DEM-3自動洗板機;打孔器;配套試劑AFP試劑盒（批號：20160706）;Freeβ-HCG試劑盒（批號：20160706）。

1.3標(biāo)本采集

每例孕婦采集1管靜脈血液標(biāo)本，采集標(biāo)本的容器為干燥真空采血管、不含任何添加劑，采樣量為3～5mL。采集后，每份靜脈血標(biāo)本再用移液器吸取制備兩份濾紙干血片標(biāo)本（注：每一份上面包括3個血斑。制備過程需快，以防血液凝集。每個血斑血量50uL，直徑8mm，兩面滲透，無重疊，室溫干燥2h后，將兩份分別放人兩個干燥避光密封袋內(nèi)。實驗濾紙片采用廣州豐華生物科技有限公司提供的產(chǎn)前篩查采血卡），剩余i血液3000r/min，離心10min，分離血清，2°C～8°C保存待檢測。

1.4分組檢測

按不同的保存條件分為冷藏組、室溫組。將濾紙干血片標(biāo)本放入干燥避光密封袋內(nèi)，一組2°～8C冷藏;另一組室溫20°C～25C保存。分別在保存第2d、7d、14d時，用TALENT-II半自動時間分辨熒光免疫分析儀采用DELFIA法檢測AFP、Freeβ-HCG。

1.5統(tǒng)計方法

分析軟件SPSS22.0軟件包，相同保存時間不同保存條件樣本檢測結(jié)果比較，采用t檢驗;相同保存條件不同保存時間樣本檢測結(jié)果比較，采用F檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同保存條件對干血片中AFP、Freeβ-HCG含量的影響

室溫組和冷藏組在2d、7d、14dAFP和Freeβ-HCG檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2保存天數(shù)對干血片中AFP、Freeβ-HCG含量的影響

如表2所示，AFP冷藏組在2d、7d、14d的結(jié)果進行F檢驗，F(xiàn)=1.894，P=0.155>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。AFP室溫組在2d、7d、14d的結(jié)果進行F檢驗，F(xiàn)=1.184，P=0.310>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。即室溫保存和29C～8C保存未發(fā)現(xiàn)干血片中AFP含量隨著時間的延長檢測值發(fā)生顯著變化。

如表3所示，F(xiàn)reeβ-HCG冷藏組在2d、7d、14d的結(jié)果進行F檢驗，F(xiàn)=0.516，P=0.598>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Freeβ-HCG室溫組在2d、7d、14d的結(jié)果進行F檢驗，F(xiàn)=0.683，P=0.507>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。即室溫保存和2°C～89C保存未發(fā)現(xiàn)干血片中Freeβ-HCG含量隨著時間的延長檢測值發(fā)生顯著變化。

3討論

出生缺陷指嬰兒出生時就存在的身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常，是嚴(yán)重影響兒童體格生長和智力發(fā)育的疾病。出生缺陷已成為世界上嬰兒死亡、兒童和成人殘疾的主要原因之一。在我國，出生缺陷已經(jīng)成為導(dǎo)致殘疾的重要原因，而最常見的出生缺陷疾病為唐氏綜合征（Downsyndrome，DS）、愛德華綜合征（Edwardssyndrome，ES）、開放性神經(jīng)管缺陷（openneuraltubedefect，ONTD）3種，這三種出生缺陷病均可在孕中期產(chǎn)檢時進行篩查和診斷。迄今為止，染色體異常還沒有有效的治療手段。提高產(chǎn)前篩查檢測質(zhì)量，擴大產(chǎn)前篩查覆蓋的區(qū)域，降低DS等疾病嬰兒出生率是所有地區(qū)衛(wèi)生機構(gòu)和檢測機構(gòu)最關(guān)注的問題。濾紙干血片標(biāo)本用于產(chǎn)前篩查生物安全性高，標(biāo)本易保存、易運送、方便快捷，更適合大規(guī)模開展篩查工作。

干血片有便于采集、便于轉(zhuǎn)運、經(jīng)濟適用、易于保存等優(yōu)點，在國外，廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)，流行病學(xué)及新生兒篩查等。國內(nèi)可以成功建立起新生兒疾病篩查方法和系統(tǒng)，也正是充分利用了干血片標(biāo)本的這些優(yōu)點。

文獻報道AFP、Freeβ-HCG干血片法檢測結(jié)果在（18C+1C）48h內(nèi)檢測結(jié)果無顯著差異[10。也有報道AFP濾紙干血片在-20C、4°C、25C下均可保存28d，但在35°C下最長可以保存12d;Freeβ-HCG濾紙干血片在-20C及49C下均可保存28d，室溫下可保存6d，35°C下最長可以保存3d179.161。還有文獻報道Freeβ-HCG及AFP在血片中置4C條件下保存至少可穩(wěn)定60d。AFP血片密封保存于4C時可以保存半年，室溫環(huán)境37°C下可穩(wěn)定保存1個月。Freeβ-HCG血片密封保存，常溫下保存35d其檢測水平變化在10%以內(nèi)，4°C可以保持。綜合以上文獻，F(xiàn)reeβ-HCG在高溫35C以上不穩(wěn)定，影響了檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

結(jié)合本地區(qū)特點，本研究選取了209C～25°C作為室溫保存條件，結(jié)果顯示：室溫組與冷藏組相同保存時間檢測結(jié)果比較，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。標(biāo)本中分析物在室溫（20°～25C）和冷藏（2C～8C）均穩(wěn)定保存。不同保存時間的檢測結(jié)果比較，分析物AFP和Freeβ-HCG含量隨著時間的延長檢測結(jié)果未發(fā)生顯著變化。濾紙干血片標(biāo)本AFP、Freeβ-HCG在2C～8C、室溫約20～25C均可穩(wěn)定保存至少14d，與文獻報道結(jié)果相符。本研究結(jié)果有一定局限性，主要是由于實驗室室溫相對恒定，因此產(chǎn)生局限性。

與血清相比，濾紙干血片法分析物在血片中更穩(wěn)定，不易受環(huán)境溫度和保存時間的影響。但在大規(guī)模產(chǎn)前篩查中可能會出現(xiàn)各種未知因素影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，標(biāo)本的運輸和保存仍是分析前質(zhì)量管理最關(guān)鍵的步驟，各基層采血機構(gòu)應(yīng)加強各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制。濾紙干血片用于產(chǎn)前篩查，低溫保存和運輸最為可靠，當(dāng)不能滿足低溫保存時，應(yīng)當(dāng)盡可能將運輸環(huán)境溫度維持在25C以下，盡快將采集好的干血片標(biāo)本送至檢測機構(gòu)，以確保檢驗結(jié)果質(zhì)量，減少因檢驗結(jié)果不準(zhǔn)確導(dǎo)致的漏診。對于高風(fēng)險孕婦，需充分告知其知情，進行胎兒羊水細胞核型分析，及時發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常，結(jié)合分子檢測、細胞遺傳學(xué)技術(shù)，降低出生缺陷，提高出生嬰兒的健康水平。

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