吳新玉 李靖 張金娟 廖尚高 梅青 吳亞云 席曉嵐

中圖分類號 R361+.3 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）23-3210-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.08

摘 要 目的：考察原阿片堿對人肝星狀細胞HSC-LX2增殖的抑制作用，并對其機制進行初步探討。方法：采用MTT法測定25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片堿作用24 h對HSC-LX2細胞增殖的影響，計算細胞增殖抑制率。另取HSC-LX2細胞分為對照組（含5%胎牛血清的1640培養(yǎng)基）和原阿片堿低、中、高濃度組（100、200、400 μmol/L），作用24 h后，流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率;熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）法測定細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（Collagen Ⅲ）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、組織金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1） mRNA的相對表達量，Western blot法測定細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白的相對表達量。結(jié)果：25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片堿對HSC- LX2細胞的增殖抑制率分別為0、6.9%、18.7%、34.2%、48.9%、53.9%。與對照組比較，原阿片堿低、中、高濃度組細胞中Collagen Ⅰ、TIMP-1 mRNA相對表達量和α-SMA蛋白相對表達量均顯著降低，MMP-2蛋白相對表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）;原阿片堿中、高濃度組細胞的凋亡率和MMP-2 mRNA相對表達量顯著升高，α-SMA、Collagen Ⅲ mRNA相對表達量和Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 蛋白相對表達量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。 結(jié)論：原阿片堿可抑制HSC-LX2細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，可降低α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TIMP-1表達，升高MMP-2表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 原阿片堿;肝星狀細胞HSC-LX2;增殖;凋亡;機制

Inhibitory Effects of Protopine on the Proliferation of Human Hepatic Stellate Cells HSC-LX2 and Its Mechanism Study

WU Xinyu1，2，LI Jing1，2，ZHANG Jinjuan3，LIAO Shanggao1，2，MEI Qing1，2，WU Yayun4，XI Xiaolan1，2（1.School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guizhou Guian New Area 550025， China;2.National Engineering Research Center of Miaos Medicines & Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM， Ministry of Education， Guiyang 550004， China;3.School of Basic Medical Sciences， Guizhou Medical University， Guizhou Guian New Area 550025， China;4.Dept. of Infectious Diseases， the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate inhibitory effects of protopine on the proliferation of human hepatic stellate cells HSC-LX2 and to explore its mechanism preliminarily. METHODS： MTT assay was used to detect the effects of 25， 50， 100， 200， 400 and 500 μmol/L protopine on the proliferation of HSC-LX2 cells. The inhibitory effect of cell proliferation was calculated. HSC-LX2 cells were divided into control group （1640 medium containing 5% fetal bovine serum）， protopine low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups （100， 200， 400 μmol/L）. After treated for 24 h. The apoptotic rate of the cells was detected by flow cytometry. RT-PCR was used to determine the mRNA expression of α-SMA， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ， MMP-2 and TIMP-1 in cells. The protein expressions of α-SMA， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ and MMP-2 were detected by Western blot. RESULTS： The inhibitory rates of 25， 50， 100， 200， 400 and 500 μmol/L protopine on proliferation HSC-LX2 cells were 0， 6.9%， 18.7%， 34.2%， 48.9%， 53.9%， respectively. Compared with control group， mRNA expression of Collagen Ⅰ， TIMP-1 and protein expression of α-SMA were decreased significantly in protopine low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups， while protein expression of MMP- 2 was increased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. Apoptotic rate of HSC-LX2 cells and mRNA expression of MMP-2 were increased significantly in protopine medium-concentration and high-concentration groups， mRNA expression of α-SMA and Collagen Ⅲ， protein expression of Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ were decreased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Protopine can induce the apoptosis of HSC-LX2 cells and inhibit their cell proliferation， and reduce the expression of a-SMA， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ and TIMP-1， and increase the expression of MMP-2.

KEYWORDS ? Protopine; Hepatic stellate cells HSC-LX2; Proliferation; Apoptosis; Mechanism

肝纖維化（Hepatic fibrosis）是指肝實質(zhì)損傷后修復(fù)時通過形成瘢痕取代受損或破壞的肝組織，其實質(zhì)是細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的合成與降解失衡，致使肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)過度沉積。肝纖維化不是一個獨立的疾病，也不是一個獨立的診斷，而是許多慢性肝病發(fā)展的共同病理生理過程[1]。有研究表明，肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，HSCs）激活變成肌成纖維細胞是肝纖維化的主要來源[2]，是合成和分泌ECM并可產(chǎn)生膠原酶的一種肝間質(zhì)細胞[3]，在肝纖維化形成的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。在肝損傷時，各種因素刺激導(dǎo)致HSCs從靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)，其特征在于α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的過表達[5];通過自分泌或者旁分泌激活的HSCs增殖;以Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）、Collagen Ⅲ為主的ECM過多沉積，最終形成肝纖維化[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一種能降解ECM的酶，在靜止的HSCs中，MMPs和組織金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）處于一種動態(tài)平衡，發(fā)生肝纖維化時平衡會被打破，TIMP-1被激活，MMP-2的活性被抑制[7-9]，從而影響ECM的穩(wěn)態(tài)并導(dǎo)致肝纖維化。發(fā)生肝纖維化時，HSCs的數(shù)量顯著增多，主要原因固然是因為其激活及增殖所致，但其凋亡的相對不足也可能是一個重要因素。

苗藥“消疤草”（苗語稱Vob hxenk dliangd）是貴州省黔東南苗族民間用于治療瘢痕的單味藥，能使明顯凸出皮膚表面的瘢痕疙瘩明顯縮小、變平。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，“消疤草”對大鼠免疫性肝纖維化具有很好的預(yù)防作用，并表現(xiàn)出抑制ECM形成的作用[10-12]。但“消疤草”中發(fā)揮抗肝纖維化作用的活性成分尚不清楚，作用機制亦不明確。本課題組在前期的藥效研究基礎(chǔ)上，進一步明確了原阿片堿（Protopine）、Macleayin E、β?卡波林、2-（4-羥基-3-甲氧苯基）-3-[N-2-（4-羥基苯基）乙基]氨基甲酰-5-[N-2-（4-羥基苯基）乙基]氨基甲酰乙烯基-7-甲氧基苯并二氫呋喃等4個單體可能是“消疤草”抗肝纖維化的有效成分[13]。原阿片堿是一種異喹啉類生物堿[14-15]，分子式為C20H19NO5?，F(xiàn)代藥理學研究證明，原阿片堿具有鎮(zhèn)痛、抑制血小板聚集、松弛平滑肌、抗心律失常、抗腫瘤、抗肝損傷、抗膽堿酯酶等活性[16-17]，但其對HSCs和肝纖維化的影響目前尚不清楚。本研究擬通過考察原阿片堿對人肝星狀細胞HSC-LX2增殖的影響，初步探討其對肝纖維化的作用，并從分子機制上探討其可能的作用機制。原阿片堿的結(jié)構(gòu)式見圖1。

1 材料

1.1 儀器

2001HY-6003型CO2細胞培養(yǎng)箱、902型-80 ℃冰箱（美國 Thermo Fisher Scientific公司）;全波段多功能酶標儀、Universal HoodⅡ型成像分析儀（美國Bio-Tek公司）;PHS-25型數(shù)顯臺式pH計（上海越平科學儀器有限公司）;CP124C型電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司];Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機（美國Eppendorf公司）;BD FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）;TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;Promo Vert型倒置顯微鏡[成貫儀器（上海）有限公司];SW-CJ-2D型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;LDZX-50FBS型滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）;DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）;ZHWY-103D型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）;K30型干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）;Step One PlusTM型實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）;XH-B型旋渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）。

1.2 藥品與試劑

原阿片堿由廖尚高教授課題組提供，高效液相色譜法（HPLC）和核磁共振檢測純度均在95%以上;磷酸鹽緩沖液（PBS粉末，無錫傲銳東源生物科技有限公司，自配，pH 7.2～7.4，質(zhì)量濃度：11.74 μg/mL）;RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號：8117293、1967534）;胎牛血清（美國ScienCell公司，批號：23954）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、RIPA細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑、二甲基亞砜（DMSO，細胞培養(yǎng)級）、MTT試劑、二喹啉甲酸（BCA）法蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180913、20180328、20180327、1213C0342、804W054、20180619）;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（批號：Apr-23D）、一抗、二抗稀釋液（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：061218181026、091018181015）;磷脂結(jié)合蛋白（Annexin Ⅴ）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，批號：20180906）;Trizol試劑（美國Ambion Life Technologies公司，批號：101002）;RNA提取試劑盒（江蘇康為世紀生物科技有限公司，批號：50250）;PCR擴增試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號：7E220E8）;免疫印跡化學發(fā)光（ECL）試劑（美國Millipore公司，批號：1722101）;α-SMA兔單克隆抗體、Collagen Ⅲ兔單克隆抗體、MMP-2兔單克隆抗體（美國Abcam公司，批號：5368、17673、1184）;Collagen Ⅰ兔多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：10423R）;辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（美國Affinity公司，批號：S0001、AF7021）;甲醇、乙醇、DMSO（天津市風船化學試劑科技有限公司，分析純）;水為雙蒸水;α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 細胞

HSC-LX2細胞購自美國Millipore公司。

2 方法

2.1 原阿片堿溶液的制備

用DMSO溶解原阿片堿，制成濃度為 100 mmol/L 的母溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），0.22 μm的微孔濾膜濾過除菌。

2.2 細胞培養(yǎng)

HSC-LX2細胞使用含有10%胎牛血清及100 u/mL 青霉素和100 μg /mL鏈霉素的1640高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換一次液，待細胞融合至80%～90%時傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于試驗。

2.3 MTT法檢測HSC-LX2細胞的增殖抑制率

取對數(shù)生長期的HSC-LX2細胞，以0.2 %胰蛋白酶消化，以離心半徑4 cm（下同）、1 000 r/min離心5 min，收集細胞，用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液混懸細胞，以5×104 mL-1的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 ?μL，邊緣用200 μL 無菌的PBS填充以防干燥，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中放置貼壁。再將HSC-LX2細胞隨機分為對照組、DMSO組和不同濃度的原阿片堿組（25、50、100、200、400、500 μmol/L），每組6個復(fù)孔。輕輕吸棄原培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，對照組加入含5%胎牛血清1640培養(yǎng)基100 μL，DMSO組加入含5‰DMSO的1640培養(yǎng)基100 μL，原阿片堿組分別加入25、50、100、200、400、500 μmol/L原阿片堿的含5%胎牛血清1640培養(yǎng)基100 μL。藥物作用24 h后，每孔分別避光加入5%MTT溶液10 μL，輕微混勻后，于37 ℃下繼續(xù)孵育4 h，輕輕棄盡孔中溶液，每孔加入150 μL的DMSO，搖床振蕩10 min。在酶標儀上測定490 nm波長處的光密度（OD），計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）= [1-（給藥組平均OD值/對照組平均OD 值）]×100%。

2.4 流式細胞術(shù)檢測HSC-LX2細胞的凋亡率

取對數(shù)生長期的HSC-LX2細胞，以0.25%胰酶消化，以1 000 r/min離心5 min，收集細胞，用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液混懸細胞，以7×104 mL-1的密度接種于12孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中放置貼壁。再將HSC-LX2細胞隨機分為對照組和原阿片堿低、中、高濃度組，每組3個復(fù)孔。輕輕吸棄培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，對照組加入含5%胎牛血清的1640培養(yǎng)基1 mL，原阿片堿低、中、高濃度組加入100、200、400 μmol/L原阿片堿的含5%胎牛血清的1640培養(yǎng)基1 mL。藥物作用24 h后，收集細胞上清，用PBS洗1次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化為單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min收集細胞，用PBS洗2次（2 000 r/min離心5 min），加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞;按照Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書標記細胞，處理后待機上樣，利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。

2.5 RT-PCR法檢測HSC-LX2細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA表達的影響

取對數(shù)生長期的HSC-LX2細胞，按“2.4”項下方法培養(yǎng)、分組和加藥，每孔2 mL。藥物作用24 h后，用Trizol試劑提取細胞總RNA用于合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，分別對α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP- 2、TIMP-1進行擴增，測定RNA的量及純度。PCR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。擴增反應(yīng)結(jié)束后，建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線（65～95 ℃），采用2-ΔΔct相對定量法[18]計算α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

2.6 Western blot 法檢測HSC-LX2細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表達的影響

取對數(shù)生長期的HSC-LX2細胞，按“2.4”項下方法培養(yǎng)、分組和加藥，每孔8 mL。藥物作用24 h后，加預(yù)冷后的PBS洗滌1次，加RIPA 蛋白裂解液（含PMSF蛋白酶抑制劑）后于冰盒上搖晃裂解離心提取上清液，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取蛋白上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行定量[19]。加入5×蛋白上樣緩沖液，于100 ℃加熱5 min變性，然后進行SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉將膜封閉1.5 h，TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，分別加入一抗[GAPDH（1 ∶ 3 000）、α-SMA兔單克隆抗體（1 ∶ 10 000）、CollagenⅠ兔多克隆抗體（1 ∶ 1 000）、Collagen Ⅲ 兔單克隆抗體（1 ∶ 1 000）、MMP-2兔單克隆抗體（1 ∶ 1 000）]孵育，4 ℃冷藏過夜。第2天PVDF膜室溫孵育15 min后，用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，與相應(yīng)二抗[HRP標記的山羊抗兔IgG（1 ∶ 5 000）]室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，用ECL發(fā)光試劑盒顯影，以Image J 1.8.0 軟件分析條帶的灰度值，以目標蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值評價蛋白的相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)采用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析或Dunnetts t檢驗，兩組樣本均值之間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 細胞增殖抑制率

與對照組比較，DMSO組細胞的OD值無明顯變化（P>0.05），50、100、200、400、500 μmol/L原阿片堿組細胞的OD值均明顯減小，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。隨著原阿片堿濃度的增加，細胞的OD值逐漸減小。各組HSC-LX2細胞增殖抑制率的結(jié)果見表2。

3.2 細胞凋亡率

與對照組比較，中、高濃度原阿片堿組細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各組HSC- LX2細胞凋亡的散點圖見圖2，細胞凋亡率的結(jié)果見表3。

3.3 細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA的表達

與對照組比較，原阿片堿低、中、高濃度組細胞中Collagen Ⅰ、TIMP-1 mRNA相對表達量顯著降低;原阿片堿中、高濃度組細胞中α-SMA、Collagen Ⅲ mRNA相對表達量顯著降低，MMP-2 mRNA相對表達量顯著增強，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組HSC-LX2細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TIMP-1 mRNA相對表達量的結(jié)果見表4。

3.4 細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表達

與對照組比較，原阿片堿低、中、高濃度組細胞中α-SMA蛋白相對表達量顯著降低，MMP-2 蛋白相對表達量顯著增強;原阿片堿中、高濃度組細胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白相對表達量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組HSC-LX2細胞中α-SMA、Collagen Ⅰ、 Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表達的電泳圖見圖3，蛋白相對表達量的結(jié)果見表5。

4 討論

肝纖維化是一種慢性、進行性、彌漫性的肝病理生理現(xiàn)象，屬可逆病變。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，盡管不同病因?qū)е赂卫w維化的機制不同，但均具有一個共同點，即都有HSCs的參與，HSCs是纖維化反應(yīng)的重要效應(yīng)器和細胞因子的主要來源和靶點[20]。

本研究探討了原阿片堿對HSC-LX2細胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著原阿片堿作用濃度的增加，細胞增殖抑制率和凋亡率均逐漸增加。說明原阿片堿對HSC-LX2細胞有增殖抑制作用和促凋亡作用。HSCs在正常情況下處于靜息狀態(tài)，不表達α-SMA，因此，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中，α-SMA的表達被認為是HSCs激活的指標[21]。本研究結(jié)果顯示，原阿片堿處理后顯著降低了HSC-LX2細胞中α-SMA mRNA及蛋白的表達，表明原阿片堿對HSC-LX2細胞的活化具有抑制作用。HSCs活化后向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變，可分泌大量ECM成分，包括Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ等，同時大量合成、分泌TIMPs，抑制MMPs活性，從而抑制ECM的降解，造成ECM產(chǎn)生與降解失衡，最終導(dǎo)致肝纖維化形成[22-26]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)原阿片堿處理后，HSC-LX2細胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA及蛋白的表達降低，MMP-2 mRNA及蛋白的表達增強，TIMP-1 mRNA的表達降低，表明TIMP-1對MMPs的抑制得到改善，使得ECM的生成減少，降解增多。提示抑制HSCs的增殖和對HSCs中ECM的降解可能是通過MMP-2、 TIMP-1的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的。但本研究尚無確切的證據(jù)證明原阿片堿對TIMP-1蛋白表達有影響，對于這個問題后期將繼續(xù)探討。

原阿片堿是從“消疤草”里分出來的單體化合物，本研究發(fā)現(xiàn)其對HSC-LX2細胞有增殖抑制作用，提示“消疤草”發(fā)揮抗肝纖維化作用的藥用成分中可能有原阿片堿，此發(fā)現(xiàn)對臨床上治療肝纖維也有一定的參考意義。

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（收稿日期：2019-08-06 修回日期：2019-10-18）

（編輯：鄒麗娟）