龔佳夢 耿金鵬 曹天光 秦壘 丁蘭 展永

摘要 利用快中子、返回式衛(wèi)星搭載、重離子多種方式處理野生金蓮花種子，研究其對金蓮花生物性狀及遺傳物質(zhì)的影響。結(jié)果表明：快中子在花部性狀的作用更為顯著，花形變異較多；而返回式衛(wèi)星搭載的金蓮花植株在葉型的變異較為明顯；重離子輻照處理金蓮花的分子標記結(jié)果顯示，7Li250Gy（29.11%）多態(tài)性比率高于12C100Gy（21.95%）、7Li200Gy（21.87%）、12C150Gy（20.39%）；聚類分析表明，7Li 250Gy輻照產(chǎn)生的突變株與對照的遺傳距離相對較遠，其次是7Li200Gy、12C100Gy，最后是12C150Gy。本研究為金蓮花優(yōu)勢新品種的選育提供了材料和新種質(zhì)資源，也為誘變育種的應用和分子生物學水平上的研究提供了參考依據(jù)。

關 鍵 詞 輻射；金蓮花；航天；RAPD

中圖分類號 Q691 文獻標志碼 A

金蓮花（Trollius）為毛茛科金蓮花亞科金蓮花屬植物，金蓮花莖葉形態(tài)優(yōu)美，花大色艷，株型緊湊，極適宜盆栽觀賞；同時其莖、葉、花、籽均可入藥，對多種炎癥有良好的治療效果，是常用中藥材。其無毒副作用、抗菌、抗病毒的特性催生出巨大的經(jīng)濟價值[1]，因而金蓮花需求量日益增大，野生金蓮花不能滿足市場的巨大需求，同時野生金蓮花品質(zhì)不穩(wěn)定，種質(zhì)資源單一，需要對野生品種進行馴化和改良。

20世紀80年代，輻射誘變育種在我國興起，它是一種生物誘變新技術(shù)，具有變異幅度大、罕見變異多、良性變異多、頻率高、且穩(wěn)定快等優(yōu)勢，在國內(nèi)外廣泛使用。輻射誘變育種主要利用加速的離子轟擊植物種子、胚芽、花粉等生物材料，使之基因突變，從而選育出新的品種，為優(yōu)良品種的選育提供豐富的植物材料，并在植物新品種培育方面取得了良好的效果。輻射可以對小麥同一突變體造成多種變異[2]。陳肖英[3]等通過航天育種的手段選育出蝴蝶蘭航蝴2號新品種，該品種既繼承了原品種“內(nèi)山姑娘”速生粗壯、花大色艷、花多耐開、抗逆性強、適應性好等優(yōu)良特性，還形成了一系列超親變異性狀。通過使用碳離子束誘變技術(shù)，Satoru Ishikawa[4]成功地生產(chǎn)出了在Koshihikari這一最受歡迎的日本溫帶水稻品種中積累了非常低的Cd的非轉(zhuǎn)基因水稻變種。張穎聰[5]等通過碳離子和質(zhì)子輻射“穗中紅48”番木瓜品種獲得大量突變單株，有株高矮、果實長等優(yōu)良性狀，為之后的進一步研究提供大量素材。耿金鵬[6]通過7Li重離子輻射選育出早熟、株型、抗性等不同類型的玉米自交系210份，并組配出高產(chǎn)量的“福生”系列新品種。利用離子注入選育出的“京廣1號”、“京廣2號”蓮新品種改善了對重金屬和礦質(zhì)元素的吸收能力[7]。目前，國內(nèi)外對于金蓮花主要是其所包含的有效成分的研究，例如生物堿和黃酮類，對金蓮花物種保護和育種的研究報道較少[8]。選用輻射誘變方法選育金蓮花優(yōu)良品種的研究更是鮮有報道。采用輻射誘變育種的方法短期內(nèi)選育出可穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)、高品質(zhì)、觀賞價值和藥用價值更大的金蓮花新品種的幾率更高。李碩[9]等對當歸輻射選育品種藥材的結(jié)果證明無明顯毒性，臨床常用量安全可行，為輻射選育中藥材新品種臨床用藥的安全有效及推廣應用提供了科學依據(jù)。

返回式衛(wèi)星搭載作為輻射誘變的一種延伸，具有高真空、微重力、射線種類復雜等特殊條件，可以對進入其中的植物材料誘發(fā)顯著變異。航天育種具有部分品種變異幅度大，育種周期短，誘變后代群體間出現(xiàn)一些有利的特殊突變體的優(yōu)勢[10]。已經(jīng)有一些關于玫瑰[11]、鳳仙花[12-13]、月季[14]、菊苣[15]等花卉航天育種的研究。

本實驗利用快中子、返回式衛(wèi)星搭載、重離子的手段對野生金蓮花種子進行誘變處理，研究當代植株的生物學效應。通過統(tǒng)計分析金蓮花的表觀性狀和檢測分析分子水平的多態(tài)性，探討多種誘變方式對野生金蓮花的影響，為擴大金蓮花的種質(zhì)資源和選育出適合現(xiàn)階段生產(chǎn)需要的高品質(zhì)金蓮花品種提供一定的實驗支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

輻照材料為河北省承德市圍場縣性狀穩(wěn)定的野生金蓮花種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料輻射處理

對照組：未經(jīng)任何處理的野生金蓮花。

采用4種不同方式對金蓮花種子進行輻照處理，分別為：

1）在中國原子能科學研究院進行的快中子輻照處理，標記為N；

2）搭載2016年4月6日發(fā)射成功的“實踐十號”返回式衛(wèi)星，標記為SP10；

3）在中國科學院近代物理研究所利用蘭州重離子加速器國家實驗室生物輻射終端（HIRFL）的12C離子對金蓮花種子進行輻照處理，使用的劑量分別是100 Gy、150 Gy，標記為12C 100、12C 150；

4）在中國原子能科學研究院利用北京串列加速器核物理國家實驗室生物輻射終端（HI-13）的7Li離子對金蓮花種子進行輻照處理，使用的劑量分別是200 Gy、250 Gy，標記為7Li 200、7Li 250。

1.2.2 田間試驗

2014年在河北省承德市圍場縣田間種植對照（CK），快中子（N）處理及搭載“實踐十號”返回式衛(wèi)星（SP10）的金蓮花種子，種植期間對金蓮花表觀性狀進行定期觀察。2017年在河北省承德市圍場縣田間種植對照（CK）、12C離子（12C）、7Li離子（7Li）輻射處理的金蓮花種子，采集其葉片―80 ℃冰箱保存，用于RAPD實驗。

1.2.3 提取基因組DNA

采用植物基因組DNA提取試劑盒的方法提取金蓮花基因組總DNA：提取未經(jīng)輻照處理的金蓮花基因組總DNA作為對照（CK），提取輻照處理12C 100、12C 150、7Li 200、7Li 250的金蓮花基因組總DNA。提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測合格后使用。

1.2.4 篩選隨機引物

參考李勇等[16]30種10個堿基大小的隨機引物中篩選出20種用于金蓮花隨機多態(tài)性擴增的隨機引物。20條隨機引物的堿基序列如表1所示。

1.2.5 隨機多態(tài)性擴增（RAPD-PCR）

植物主要性狀的遺傳性較低，且遺傳具有復雜性，因此基于形態(tài)特征對植物品種進行選擇的方法并不可靠，最好的方法是利用分子標記來檢測金蓮花的遺傳多樣性[17]。Random Amplified Polymorphic DNA（RAPD）分子標記方法普遍用于生物DNA多態(tài)性研究，具有簡單、易操作、引物隨機、多態(tài)性高等優(yōu)勢。李勇等利用DNA隨機多態(tài)性擴增的方法從分子水平對不同產(chǎn)地的金蓮花進行了親緣關系分析，為優(yōu)良品種的選育提供了參考數(shù)據(jù)。

RAPD擴增參考李勇等的反應體系及擴增程序，并略有調(diào)整。PCR反應使用Golden Easy PCR System試劑盒，25 μl反應體系：DNA模板（200 ng/μl）2 μl，2X Reaction Mix（500 μM dNTP each，20 mM Tris-HCl（pH8.3），100 mM KCl，3 mM MgCl3，其他穩(wěn)定劑和增強劑）12.5 μl，Golden DNA Polymerase（2.5 U/μl）0.2 μl，隨機引物（10 μmol/L）2 μl，滅菌ddH2O 8.3 μl。PCR反應在EasyCycler Gradient 96型擴增儀上完成，擴增程序：94 ℃ 40 s，94 ℃ 20 s，35 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，45個循環(huán)，72 ℃ 延伸5 min。PCR擴增結(jié)果用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并成像觀察分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對電泳結(jié)果進行分析，按照有帶記為“1”，無帶記為“0”進行統(tǒng)計，獲得的結(jié)果用POPGENE32軟件計算多態(tài)性比率。參考李謹[18]等，定義計算公式：多態(tài)性比率（%）=（每個輻照處理組多態(tài)性條帶數(shù)/對照組總條帶數(shù)）。定義DNA多態(tài)性比率公式為M= nd /N×100%，式中，nd表示處理組相比對照組的差異條帶數(shù)目，N表示對照組總條帶數(shù)目。

利用POPGENE32軟件計算不同誘變處理植株間的遺傳距離。用NTSYS2.10軟件基于遺傳相似系數(shù)的OPGMA法對不同誘變處理植株進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 快中子輻射處理對金蓮花表觀性狀的影響

通過對金蓮花表觀性狀的觀察發(fā)現(xiàn)快中子輻射能夠引起M1代植株花形和葉片都發(fā)生明顯變異，花形變異豐富，葉片變異較少。

在圖1中，N-1花朵明顯大于對照（CK），花朵直徑可達到10 cm，極具觀賞價值，經(jīng)濟效益更高；此外，更是出現(xiàn)N-2的對生花朵，1根枝條上2朵金蓮花共生；N-3花瓣層數(shù)相比對照減少，；N-4花蕊增多且雜亂；N-5部分花瓣邊緣出現(xiàn)裂隙；N-6花瓣形狀由對照組扁長型變異為短圓；N-7花瓣向花蕊處彎曲聚集，較對照組緊密。由統(tǒng)計知，快中子輻照處理金蓮花在花形，花瓣、花蕊等多方面都發(fā)生明顯變異，如表2所示。

快中子輻射金蓮花植株葉片變異較少，變異株與對照相比，葉柄變長，葉片小葉缺裂程度增大，葉片變細長，如圖2所示。

2.2 返回式衛(wèi)星搭載對金蓮花表觀性狀的影響

通過對金蓮花表觀性狀的觀察發(fā)現(xiàn)返回式衛(wèi)星搭載金蓮花植株花形和葉片都發(fā)生明顯變異，花形變異少，葉片變異豐富繁多。

返回式衛(wèi)星搭載金蓮花花形變異少，只出現(xiàn)花瓣層數(shù)增多的變異株（圖3），而葉片變異種類繁多，每一株葉片都有少許不同，圖4給出了幾種典型變異葉片。由圖4，與對照相比，SP10-1葉片中心呈黃色，小葉缺裂程度變大，葉片變窄變長；SP10-2葉片小葉緊湊、較對照組圓潤，顏色較深；SP10-3多個葉片聚集叢生；SP10-4小葉間隔大、缺裂程度變??；SP10-5、SP10-6小葉變寬、去缺裂程度變小，且由羽形（CK）變異為掌形，SP10-6較SP10-5小葉短寬；SP10-7小葉無缺裂、變寬，鋸齒狀葉緣變平滑，葉片呈掌形。統(tǒng)計可知，返回式衛(wèi)星搭載的金蓮花植株葉片主要變異性狀為形狀、寬度及小葉缺裂程度，如表3所示。

2.3 誘變金蓮花的遺傳多樣性分析

RAPD分子標記被廣泛地應用于植物品種鑒定、群體結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性等，它是通過觀察基因組的擴增片段來反應不同品種之間遺傳物質(zhì)的差異情況。由于目前對金蓮花基因組結(jié)構(gòu)缺乏足夠的認識，采用RAPD的方法對輻照處理后的金蓮花進行遺傳多樣性分析是非常合適的。為從分子水平上進一步探索誘變金蓮花植株間的差異，該研究用篩選出的20條隨機引物對CK和12C100、12C 150、7Li200、7Li250誘變處理樣品DNA進行遺傳多樣性分析。

圖5是隨機引物OPB-9對對照和4個不同重離子輻照處理的金蓮花樣品的隨機多態(tài)性擴增電泳結(jié)果，箭頭所指為多態(tài)性條帶處，12C100分別在分子量為1 300 bp和1 500 bp處缺失1條帶，而在分子量為1 400 bp處多出1條帶；12C150在分子量為800 bp處缺失1條帶；7Li200在分子量1 300 bp處缺失1條帶；7Li250在分子量950 ～ 2 000 bp之間缺失6條帶。對20條隨機引物擴增結(jié)果進行統(tǒng)計分析得到，對照株得到185條清晰穩(wěn)定擴增條帶，分子量大小在200 ～ 3 000 bp之間，重離子輻照組多態(tài)性比率7Li250> 12C100>7Li200>12C150，分別為29.11%、21.95%、21.87%、20.39%（圖6）。重離子輻照處理中多態(tài)性比率最高的分別是OPH-3為引物的12C100處理達到71.43%，OPA-17＼OPA-19為引物的12C150處理達到50%，7Li200處理的OPB-4高達83.33%，7Li250處理的OPB-4同樣高達83.33%。

基于遺傳相似系數(shù)利用NTSYS2.10軟件UPGMA法對5種實驗材料處理進行UPGMA聚類分析，結(jié)果如圖7。由聚類分析圖可知，當截取遺傳相似系數(shù)水平為0.76時，對照和重離子處理材料聚為3類：對照CK和12C150在遺傳相似系數(shù)0.78處聚為一類、12C100為一類，7Li250、7Li200在遺傳相似系數(shù)0.83處聚為一類。用POPGENE32軟件得出對照和重離子處理材料間的遺傳距離，7Li250與對照組遺傳距離最遠為0.384 1，其次是12C150、7Li200與對照組遺傳距離為0.264 5，最后12C100與對照組遺傳距離最近為0.243 6。

3 結(jié)論與討論

快中子輻照處理金蓮花植株花形發(fā)生直徑、對生、花瓣、花蕊等豐富變化，葉型變異較少，說明快中子在金蓮花花部性狀的作用更為顯著，花形變異較多。李多芳[19]等在快中子輻射百日草的研究中發(fā)現(xiàn)，百日草葉片和花部性狀均發(fā)生明顯變異，其中葉片變異性狀在植株生長過程中逐漸恢復，而花形花色變異種類繁多且變異性狀基本穩(wěn)定，與該研究結(jié)果相似。返回式衛(wèi)星搭載的金蓮花植株葉片在葉型、葉寬、缺裂等方面都發(fā)生了明顯變異，說明返回式衛(wèi)星搭載在植株葉型的變異較為明顯。王曾珍[20]航天誘變普那菊苣，變異株其特征為植株高大、單株分枝數(shù)多、基莖粗大、生殖枝和小花數(shù)多。焦展[21]航天誘變油葵，得到了一系列如株高變化、葉片變化、花期延長、始花期提前、百粒質(zhì)量增高等變異，推測這些變異在后代繁育中能夠使油葵表現(xiàn)更廣泛的適應性和更強大的生活力，從而有望選育出優(yōu)異的品種類型。輻照后植株與對照株有明顯葉片性狀變化與該研究結(jié)果相似。重離子輻照金蓮花遺傳多態(tài)性分析顯示12C100、12C150、7Li200、7Li250多態(tài)位點百分率分別為21.95%、20.39%、21.87%、29.11%。余麗霞[22]等對碳離子輻射大麗花矮化突變體的RAPD分析，在所用的25條引物中，1.80×108 /cm2劑量輻照后有18 條引物擴增出現(xiàn)多態(tài)性片斷，擴增條帶多態(tài)率19.57%； 1.08×108 /cm2劑量輻照后僅有6條引物擴增出現(xiàn)多態(tài)性片斷，擴增條帶多態(tài)率5.76%。侯歲穩(wěn)[23]等在12C重離子輻照油菜誘變效應研究中，42個RAPD隨機引物中有13個引物擴增出差異條帶，30 Gy、90 Gy和180 Gy引起的RAPD變異率分別為22.1%、23.7%和36.2%。羅紅兵[24]等對7Li輻射玉米種子引起的基因組DNA變異分析，結(jié)果全都表明輻照后的植株DNA分子都發(fā)生了明顯變異且變異率差異較大。與該研究結(jié)果基本一致。輻射可有效引起金蓮花表型與DNA分子的變異。從微觀分子損傷到最終突變效應的出現(xiàn)是一個極其復雜的過程。輻射誘變金蓮花的過程將發(fā)生能量沉積、動量傳遞和電荷交換效應，直接或間接造成金蓮花的生物損傷，但由于金蓮花自身的防御與修復功能，以及一系列生化代謝網(wǎng)絡的調(diào)控，最終呈現(xiàn)出表觀性狀與基因多態(tài)性的變異[25]?？熘凶?、返回式衛(wèi)星搭載、重離子不同誘變方式均可以有效改變金蓮花的遺傳物質(zhì)，為培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的金蓮花新品種提供了技術(shù)支持，在輻照誘變育種中有廣闊的應用前景。

綜上所述，輻射后的金蓮花當代植株不僅表觀性狀發(fā)生變異，DNA分子水平也發(fā)生突變，豐富了遺傳多樣性，為選育高產(chǎn)量、高品質(zhì)、高觀賞性的金蓮花優(yōu)勢品種提供了材料和新種質(zhì)資源。同時也為金蓮花在分子生物學水平上的研究提供了參考依據(jù)。

致謝：感謝中國科學院近代物理研究所和中國原子能科學研究院對輻射實驗的幫助！

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[責任編輯 楊 屹]