李佳 曹先梅 謝賽 劉立云

x摘要：【目的】克隆檳榔氨基酸通透酶（AAP3）基因（AcAAP3），分析其生物學信息，并檢測其組織表達特性，為探究AAP3在氨基酸轉(zhuǎn)運及氮素利用機制提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷梅崔D(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）從檳榔品種熱研1號中擴增AcAAP3基因cDNA序列，利用生物信息學方法對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、亞細胞定位、功能域及二、三級結構等進行預測分析，并利用實時熒光定量PCR檢測AcAAP3基因在檳榔根、葉、莖、雄花和雌花中的表達特異性?！窘Y果】克隆獲得AcAAP3基因cDNA序列全長為1440 bp，編碼479個氨基酸，蛋白理論分子量為52.834 kD，等電點（pI）為8.76，具有9個跨膜結構域，定位在細胞質(zhì)膜上，為疏水性非分泌蛋白，具有1個保守的PF01490結構域（氨基酸轉(zhuǎn)運結構域Aa_trans），屬于氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白家族和APC超家族成員，其二級結構主要由α螺旋（45.72%）和不規(guī)則卷曲（34.66%）構成。AcAAP3蛋白氨基酸序列與椰棗（XP008799058.1）、油棕（XP010912574.1）、香蕉（XP009404321.1）和菠蘿（XP020107563.1）AAPs蛋白的氨基酸序列相似性分別為91%、90%、84%和83%，說明不同植物的AAPs蛋白具有高度保守性。植物AAPs蛋白家族可分成兩個亞類，即單子葉亞類和雙子葉亞類，其中，AcAAP3蛋白與單子葉亞類的椰棗（XP008799058.1）和油棕（XP010912574.1）AAPs的親緣關系較近。AcAAP3基因在檳榔各組織均有表達，表達量依次為根>葉>莖>雄花>雌花?！窘Y論】AcAAP3基因具有明顯的組織特異性，其編碼蛋白可能在檳榔從外界吸收氨基酸及其體內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞： 檳榔;氨基酸通透酶（AAP3）;基因克隆;生物信息學;組織表達

中圖分類號： S792.91? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）02-0215-07

Abstract：【Objective】Amino acid permeases（AAP3） gene（AcAAP3） was cloned from Areca catechu L.， its basic biological information and expression characteristics was analyzed to provide theoretical basis for further study on explo-ring the mechanism of amino acids transportation and nitrogen utilization of AAP3. 【Method】cDNA sequence of AcAAP3 gene was amplified from A. catechu variety Reyan 1 using reverse transcription PCR（RT-PCR） method. Through bioinformatics analysis，the protein encoded by the gene was initially analyzed for physicochemical properties，hydrophilic/hydrophobic， subcellular localization， conserved domain， secondary and tertiary structures.Expression specificity of AcAAP3 in root， leaf， stem， male flower and female flower were studied by real-time fluorescent quantitative PCR（qPCR）. 【Result】The results showed that the cDNA sequence of AcAAP3 gene was 1440 bp in length and encoded 479 amino acids. The theoretical molecular weight of AcAAP3 protein was about 52.834 kD，with a isoelectric point（pI） of 8.76. The encoded protein belonged to the amino acid transporter family and APC super-family with a conserved PF01490 domain（amino acid transporter domain， Aa_trans），which had nine transmembrane domain. AcAAP3 was located in plasma membrane and was a hydrophobic non-secretory protein. Its secondary structure was mainly composed of α helix（45.72%） and random coil（34.66%）. The similarity of protein AcAAP3 amino acid sequences with Phoenix dactylifera（XP008799058.1），Elaeis guineensis（XP010912574.1）， Musa acuminate（XP009404321.1） and Ananas comosus（XP020107563.1） were 91%， 90%， 84% and 83%，respectively，indicating that the AAPs protein amino acid sequence was highly conserved. Plant AAPs protein family could be divided into two sub-categories， namely monocotyledonous subclass and dicotyledonous subclass. The relationship between AcAAP3 protein and monocotyledonous subclass plants P. dactylifera（XP008799058.1） and E. guineensis（XP010912574.1） was close. AcAAP3 expressed in different tissues of A. catechu，and presented root>leaf>stem>male flower>female flower. 【Conclusion】 AcAAP3 gene has obvious tissue specificity expression. Its encoded protein may play a key role in the absorption of external amino acids and transportation of it in A. catechu.

Key words： Areca catechu L.; amino acid permeases（AAP3）; gene cloning; bioinformatics analysis; tissue expre-ssion

0 引言

【研究意義】檳榔（Areca catechu L.）為檳榔科檳榔屬多年生植物，是海南省重要的經(jīng)濟作物，因其具有助消化、抗氧化和抗菌等重要的藥用價值而被稱為“四大南藥”之首（Peng et al.，2015）。氮作為植物最主要的營養(yǎng)元素，在光合作用、呼吸作用及抗氧化系統(tǒng)等生理代謝過程中發(fā)揮關鍵作用（Amtmann and Armengaud，2009）。氨基酸是氮素同化物長距離運輸?shù)闹饕问剑╖hang et al.，2010），而氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白主要介導植物吸收外界氨基酸及其體內(nèi)氨基酸的轉(zhuǎn)運（Tegeder and Rentsch，2010），其中氨基酸通透性酶（Amino acid permeases，AAPs）在植物不同器官的氨基酸轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮著重要作用。因此，克隆檳榔AAPs基因并對其進行生物信息學分析，對深入研究AAPs在檳榔氨基酸吸收、轉(zhuǎn)運和氮素利用中的作用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，已對不同植物AAPs的轉(zhuǎn)運機制開展了大量研究，結果表明AAPs與氨基酸轉(zhuǎn)運和氮素利用相關，如擬南芥AAPs基因家族包括8個氨基酸轉(zhuǎn)運載體基因，其中AtAAP1基因主要在子葉和胚乳中表達，負責根系谷氨酸鹽和中性氨基酸的運輸，影響種子數(shù)量和重量（Lee et al.，2010;Sanders et al.，2010）;AtAAP2和AtAAP3基因主要在根和莖的韌皮部中表達，介導韌皮部氨基酸的裝載（Okumoto et al.，2004;Zhang et al.，2010）;AtAAP5基因主要在根皮層中表達，負責賴氨酸和精氨酸運輸，且該基因的T-DNA插入突變體aap5-1地上部分生物量顯著增加（Svennerstam et al.，2008）;AtAAP6基因主要在根中表達，調(diào)控擬南芥篩管分子中氨基酸的成分及含量（Hunt et al.，2010）;AtAAP8基因通過介導胚胎發(fā)育初期氨基酸向胚乳的轉(zhuǎn)運進而影響種子的發(fā)育（Santiago and Tegeder，2016）。在水稻中，AAPs基因家族有19個成員，其中OsAAP3基因參與調(diào)控堿性的賴氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）轉(zhuǎn)運，降低該基因表達可增加水稻的分蘗數(shù)和單株有效穗，從而提高水稻產(chǎn)量和氮素利用效率（Lu et al.，2018）;OsAAP6基因則在調(diào)控蛋白質(zhì)含量和營養(yǎng)品質(zhì)等方面發(fā)揮作用（Peng et al.，2014）。玉米AAPs基因家族有24個成員，在不同的組織和發(fā)育期表達模式不同，其中ZmAAP1基因表達可加快游離氨基酸的吸收和轉(zhuǎn)運，進而提高植株對氮素的利用效率（李慧杰等，2017）。菜豆種子中過表達PvAAP1基因會引起儲藏蛋白含量增加（Rolletschek et al.，2005），且該基因編碼蛋白主要負責木質(zhì)部和韌皮部之間的氨基酸轉(zhuǎn)運，在韌皮部裝載氨基酸運輸至儲藏部位，同時將氨基氮運輸至子葉用于種子發(fā)育和儲藏物質(zhì)積累（Tan et al.，2008）?！颈狙芯壳腥朦c】至今，已從植物中克隆獲得多個AAPs基因，其作用機理研究方面也取得了突破性進展（馬清等，2015），但有關檳榔AAPs基因的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】基于本研究課題組的檳榔轉(zhuǎn)錄組測序結果，克隆檳榔AAP3（AcAAP3）基因cDNA序列全長，利用生物信息學方法對其編碼蛋白質(zhì)的結構等進行預測分析，對不同物種AAPs基因序列進行同源性比對，并檢測AcAAP3基因的組織表達模式，為深入研究檳榔AAPs在氨基酸轉(zhuǎn)運過程中的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試檳榔品種為熱研1號，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所檳榔種質(zhì)資源圃。主要試劑：EZ-10總RNA小量提取試劑盒、RNase-Free DNase I和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司，高保真Taq聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司，Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。主要設備儀器：NanoDrop 2000超微量核酸蛋白分析儀（Thermo，美國）、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）和QuantStudio 6 Real-time PCR Detection System（ABI，美國）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品采集 于2018年5月17日采集檳榔的根、莖、葉、雌花和雄花，置于液氮中速凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 參照EZ-10總RNA小量提取試劑盒說明提取檳榔根、莖、葉、雌花和雄花的總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。以提取的總RNA為模板，參照PrimeScriptTM 1st Stand cDNA Synthesis Kit說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 基因克隆 以油棕EgAAP3基因（GenBank登錄號XP_010912574.1）的核苷酸序列作為參考序列，在檳榔轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中進行BLAST比對，獲得1個屬于AAPs基因家族的cDNA序列全長。根據(jù)該序列最大開放閱讀框（ORF）用Oligo 7.0進行引物設計，引物序列（AcAAP3-F和AcAAP3-R）如表1所示。以cDNA為模板，利用高保真Taq聚合酶進行PCR擴增。反應體系50.0 μL：2×Phanta Master Mix 25.0 μL，10 μmol/L正、反向引物各2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，去離子水補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性2 min;95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，進行32個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收其PCR產(chǎn)物，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。通過菌液PCR鑒定出陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 2. 4 生物信息學分析 利用在線ORF Finder對AcAAP3基因序列進行ORF分析;采用Bioedit對其編碼蛋白進行同源性比對;利用ProtParam對蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)預測;利用ProtScale對蛋白疏水性進行預測;利用TMHMM Server v. 2.0對蛋白進行跨膜結構域預測;利用PSORT對蛋白進行亞細胞定位預測;利用SignalP 4.1 Server預測蛋白信號肽;利用SMART預測蛋白的保守結構域;應用SOMPA預測蛋白質(zhì)二級結構;利用SWISS-MODEL對蛋白進行3D結構建模;以MEGA 6.0采用Neighbor-Joining（N-J）法（重復1000次）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 2. 5 實時熒光定量PCR檢測 根據(jù)克隆獲得的檳榔AcAAP3基因cDNA序列全長，遵照定量PCR引物設計的原則設計其熒光定量特異引物（A3-F和A3-R），見表1。同時，從檳榔轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出1個Actin基因，并以此為內(nèi)參基因，其引物（Actin-F和Actin-R）見表1。利用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒檢測AcAAP3基因在檳榔根、莖、葉、雌花和雄花中的表達情況。反應體系20.0 μL：2×SYBR Green I混合液10.0 μL，cDNA模板（反轉(zhuǎn)錄稀釋液）1.0 μL，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL，去離子水補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性15 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)。每個反應設3次重復，利用2-ΔΔCt法計算AcAAP3基因的相對表達量。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行整理作圖，使用SPSS 19.0對基因在不同組織中的表達差異進行顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 AcAAP3基因cDNA序列克隆結果

以檳榔的cDNA為模板，AcAAP3-F和AcAAP3-R為引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示，目的條帶清晰，約1500 bp，與預期結果相符。測序結果顯示，該片段大小為1440 bp。將其與檳榔轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中目的序列進行比對，結果發(fā)現(xiàn)，二者序列相似度為100%。

2. 2 同源性比對結果

將AcAAP3基因編碼的氨基酸序列與GenBank其他植物AAP蛋白的氨基酸序列進行比對，結果（圖2）顯示，該序列與多種植物AAP蛋白的氨基酸序列具有較高的相似性，其中，與椰棗（Phoenix dactylifera，XP008799058.1）、油棕（Elaeis guineensis，XP010912574.1）、香蕉（Musa acuminata subsp. malaccensis，XP009404321.1）和菠蘿（Ananas comosus，XP020107563.1）AAPs蛋白的氨基酸序列相似性分別為91%、90%、84%和83%。

2. 3 AcAAP3蛋白功能域預測結果

Pfam和SMART預測結果顯示，AcAAP3蛋白具有1個保守的PF01490結構域，其是氨基酸轉(zhuǎn)運結構域Aa_trans，位于第32～467個氨基酸。借助SMART進一步分析，發(fā)現(xiàn)AcAAP3屬于氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白家族和APC超家族成員，且具有高度保守區(qū)域GYAAFG，此位點為蘇氨酸磷酸化位點（圖2）?？梢?，克隆獲得的序列為檳榔AcAAP3基因全長cDNA序列（GenBank登錄號為MK353353）。

2. 4 AcAAP3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預測結果

利用ProtParam預測蛋白的理化性質(zhì)，結果顯示，AcAAP3蛋白由479個氨基酸組成，理論分子量為52.834 kD，等電點（pI）為8.76;該蛋白中以丙氨酸（Ala）含量最高，為10.0%，其次是亮氨酸（Leu）和異亮氨酸（Ile），均為9.4%，以組氨酸（His）含量最低，為1.3%;脂肪族指數(shù)（AI）為103.88，不穩(wěn)定系數(shù)為40.06，說明AcAAP3蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

利用ProtScale預測蛋白的親/疏水性，結果表明，AcAAP3蛋白疏水性最大的氨基酸為Ile，分值為4.5，親水性最大的氨基酸為精氨酸（Arg），分值為 -4.5。從整體來看，AcAAP3蛋白疏水性氨基酸明顯多于親水性氨基酸（圖3），其總體平均疏水性（GRAVY）為0.51，說明AcAAP3蛋白為疏水性蛋白。

2. 5 AcAAP3蛋白質(zhì)跨膜區(qū)、信號肽和亞細胞定位預測結果

分別利用SignalP、TMHMM和PSORT對檳榔AcAAP3蛋白的跨膜區(qū)、信號肽和亞細胞定位進行預測分析，結果顯示，AcAAP3蛋白具有9個跨膜結構域（圖4），但不存在信號肽，為非分泌蛋白（圖5），主要定位在細胞質(zhì)膜上。

2. 6 AcAAP3蛋白質(zhì)結構預測結果

利用SOMPA預測AcAAP3蛋白的二級結構，結果顯示，該蛋白含α螺旋結構（45.72%）、延伸鏈結構（16.70%）、不規(guī)則卷曲（34.66%）和β轉(zhuǎn)角（2.92%）（圖6）。利用SWISS-MODEL構建AcAAP3蛋白三級結構模型，如圖7所示，α螺旋和不規(guī)則卷曲占據(jù)該蛋白高級結構的大部分空間，與檳榔AcAAP3蛋白的二級結構預測結果相吻合。

2. 7 系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建結果

為進一步揭示AcAAP3蛋白與其他植物AAPs蛋白的親緣關系，將其氨基酸序列在NCBI中進行BLAST比對，選取其他17種植物同源蛋白的氨基酸序列，并運用MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果顯示，植物AAPs蛋白家族可分成兩個亞類，即單子葉亞類和雙子葉亞類，其中，AcAAP3蛋白與單子葉亞類的椰棗（XP008799058.1）和油棕（XP010912574.1）AAPs蛋白的親緣關系較近，與木薯（Manihot esculenta，XP021600477.1）和橡膠（Hevea brasiliensis，XP021664117.1）AAPs的親緣關系較遠（圖8）。

2. 8 檳榔AcAAP3基因在不同組織的表達分析結果

采用實時熒光定量PCR檢測AcAAP3基因在檳榔不同組織的表達情況，結果如圖9所示。AcAAP3基因在不同組織均有表達，表達量依次為根>葉>莖>雄花>雌花，其中，在根中的表達量顯著高于葉、莖、雄花和雌花（P<0.05），分別是葉、莖、雄花和雌花的5.71、22.62、39.16和80.11倍?？梢姡珹cAAP3基因參與檳榔中氨基酸轉(zhuǎn)運過程，具有明顯的組織特異性，可能在根系吸收氨基酸的過程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

土壤是植物賴以生存的主要營養(yǎng)庫，其中養(yǎng)分形態(tài)分為以礦質(zhì)元素為主的無機態(tài)和以氨基酸、氨基糖、多肽及核酸等為主的有機態(tài)（宋奇超等，2012）。研究表明，許多植物都能直接吸收利用生長介質(zhì)中的氨基酸，但吸收能力因植物種類而異，且不同氨基酸對植物的生物學效應存在差異（王瑩等，2008）。AAPs參與植物各種生命活動途徑，如氨基酸的吸收，細胞間氨基酸的裝載和卸載等（宋奇超等，2012）。本研究成功克隆獲得AcAAP3基因cDNA序列全長，其編碼蛋白氨基酸序列分析結果表明，AcAAP3具有1個保守的PF01490結構域，其是氨基酸轉(zhuǎn)運結構域Aa_trans，說明該蛋白屬于氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白家族，參與氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運（Zhao et al.，2011）。系統(tǒng)發(fā)育進化樹結果表明，植物AAPs蛋白家族可分成兩個亞類，即單子葉亞類和雙子葉亞類，AcAAP3與單子葉亞類中椰棗和油棕AAPs的親緣關系最近，推測AcAAP3基因可應用于椰棗和油棕等棕櫚科植物的遺傳改良。

本研究發(fā)現(xiàn)，AcAAP3蛋白具有9個跨膜結構域，亞細胞定位在細胞質(zhì)膜上，可能與AcAAP3基因調(diào)控氨基酸吸收和轉(zhuǎn)運密切相關。此外，蛋白質(zhì)的生物學功能不僅取決于蛋白質(zhì)分子的一級結構，還與其特定的空間結構密切相關，對蛋白質(zhì)的結構進行預測分析，對探究蛋白質(zhì)結構與功能的關系，以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)（或其他分子）的相互作用具有重要意義（彭波等，2018）。本研究通過生物信息學方法對AcAAP3蛋白結構進行預測分析，結果發(fā)現(xiàn)其二級結構主要由α螺旋（45.72%）和不規(guī)則卷曲（34.66%）構成，推測AcAAP3蛋白的生物學功能與其α螺旋結構密切相關。

同一基因在不同物種或同一物種不同組織中的表達模式均存在差異，尤其是不同組織器官中呈特異性表達，則代表該基因具有組織特異性功能（Li et al.，2015）。本研究的實時熒光定量PCR檢測結果顯示，AcAAP3基因的表達量在根中最高，其次是葉和莖，在花中最低。這與擬南芥AtAAP3基因主要在根中表達的結論（Okumoto et al.，2004）一致。但AcAAP3基因與水稻OsAAP3基因的表達模式不同，OsAAP3基因在葉鞘中表達最高，其次為莖、葉和根（Lu et al.，2018）。上述結論存在差異的原因是根和葉分別為最主要的營養(yǎng)吸收和光合作用的器官，AAP3基因可能在根吸收氨基酸及葉片轉(zhuǎn)運氨基酸中發(fā)揮重要作用，因此，這兩個組織器官中表達量均較高，但不同物種存在差異。在今后的研究中，應構建AcAAP3-pCAMBIA1306植物超表達載體，并通過轉(zhuǎn)基因技術分析AcAAP3基因在氨基酸吸收及體內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運過程中的分子調(diào)控機制。

4 結論

AcAAP3基因具有明顯的組織特異性，其編碼蛋白可能在檳榔從外界吸收氨基酸及其體內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用。

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（責任編輯 陳 燕）