李玉鳳 陳亮亮 李學(xué)軍

〔摘要〕 目的 觀察脾胃培源方對(duì)慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）大鼠血清胃蛋白酶原I（pepsinogenI， PGⅠ）、胃蛋白酶原Ⅱ（pepsinogenⅡ， PGⅡ）、胃泌素（gastrin-17， G-17）水平的影響，通過研究轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）和Smad3蛋白在CAG大鼠胃組織中的表達(dá)，探討TGF-β1/Smad3信號(hào)傳導(dǎo)通路在CAG發(fā)病過程中的作用以及脾胃培源方的治療機(jī)制。方法 選用SPF 級(jí)Wistar雄性大鼠100只，隨機(jī)分為：空白對(duì)照組、模型組、維酶素組、脾胃培源方（高、中、低劑量）組，采用幽門彈簧植入術(shù)配合高鹽熱淀粉糊灌胃法制備CAG大鼠模型。造模成功后，各組予以相關(guān)干預(yù)，連續(xù)灌胃4周，4周后處死大鼠取血清及胃組織。通過HE染色觀察大鼠胃組織病理學(xué)的改變，并采用Elisa法和Western blot法檢測(cè)血清PGⅠ、PGⅡ、G-17水平及TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型組血清PGⅠ、G-17水平及Smad3蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），TGF-β1蛋白表達(dá)明顯上升（P<0.05）;與模型組比較，脾胃培源方組和維酶素組血清PGⅠ、G-17水平及Smad3蛋白表達(dá)明顯上升（P<0.05），TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05），血清PGⅡ均未見明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;維酶素組和脾胃培源方（高、中、低劑量組）4組間采取兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 脾胃培源方能明顯改善CAG大鼠的胃組織損傷，下調(diào)胃組織TGF-β1蛋白表達(dá)及上調(diào)Smad3蛋白的表達(dá)，說明TGF-β1/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了CAG發(fā)病過程，脾胃培源方治療CAG可能通過干預(yù)該通路的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

〔關(guān)鍵詞〕 慢性萎縮性胃炎;胃蛋白酶原;轉(zhuǎn)化生長因子β1;Smad3;脾胃培源方

〔中圖分類號(hào)〕R285.5;R573.3+2? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.006

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是慢性胃炎的一種類型，呈局限性或廣泛性的胃黏膜固有腺體萎縮（數(shù)量減少、功能減低），常伴有腸上皮化生及異型增生[1]，屬臨床常見病、多發(fā)病、疑難病，尤以脾胃虛弱型為常見，主要癥狀表現(xiàn)有上腹部脹滿、疼痛，燒心及消化不良癥狀等[2]。慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生和異性增生與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切，尤其腸上皮化生被認(rèn)為是萎縮的典型標(biāo)志及胃癌的前兆[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于CAG缺乏有效的治療手段。脾胃培源方是首屆全國名老中醫(yī)馬駿教授治療CAG的有效經(jīng)驗(yàn)方。研究證實(shí)[4]，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）/Smad3信號(hào)通路與 CAG密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)此通路可以抑制異型增生細(xì)胞的增殖，促進(jìn)胃萎縮黏膜的修復(fù)，從而達(dá)到治療 CAG的目的。因此，本實(shí)驗(yàn)研究旨在探討TGF-β1/Smad3信號(hào)通路在CAG發(fā)病中的作用，以及分析探討脾胃培源方治療CAG的分子生物學(xué)機(jī)制，為脾胃培源方臨床治療CAG提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1? 動(dòng)物

選用SPF級(jí)Wistar雄性大鼠100只，體質(zhì)量（200±20）g，鼠齡5～7周，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0002，保持室溫、自然光照周期，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2? 藥品及主要儀器

脾胃培源方藥物組方中各味飲片購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中草藥房;維酶素片：廣西大海陽光藥業(yè)有限公司，0.2 g/片。352型酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems公司）;JW3021HR型離心機(jī)（安徽嘉文公司）;

LGJ-10 多歧管壓蓋型冷凍干燥機(jī)（北京松源有限公司）;DMI-6000B型倒置熒光顯微鏡（德國萊卡公司）;垂直電泳裝置（美國Bio-Rad公司）;ELISA 試劑盒（上海源葉生物技術(shù)有限公司）;兔抗鼠TGF-β1單克隆抗體（Bioworld公司）;山羊抗鼠磷酸化Smad2/3多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）;辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗（美國KPL公司）。

2 方法

2.1? 動(dòng)物分組與模型建立

健康雄性SPF級(jí)Wistar雄性大鼠100只，隨機(jī)分為：空白對(duì)照組、模型組、維酶素組、脾胃培源方（高、中、低劑量組：簡稱為高劑量組、中劑量組、低劑量組）組，每組15只，其中，選取空白對(duì)照、假手術(shù)組、模型組大鼠各3只，用來驗(yàn)證CAG脾胃虛弱證模型是否復(fù)制成功。采用幽門彈簧植入術(shù)配合高鹽熱淀粉糊灌胃法制備CAG大鼠模型[5]：（1）制備幽門彈簧：將金屬環(huán)型宮內(nèi)節(jié)育器中硅橡膠和銅絲去掉，拉直，并剪成小段彈簧，將兩邊斷端彎入彈簧內(nèi);（2）彈簧幽門植入術(shù)：腹腔麻醉后，在無菌條件下開腹，暴露胃，在胃前壁距幽門環(huán)0.2 cm處切一小口，金屬彈簧前 1/3 插過其幽門環(huán)進(jìn)入十二指腸，用縫線將彈簧兩端及中央固定，按手術(shù)常規(guī)縫合;（3）藥物造模方法：術(shù)后第2周開始藥物造模，給予高鹽熱淀粉糊（含15%氯化鈉，25%可溶性淀粉，60～70 ℃）灌胃，每只2 mL/d，每周2次（周二、周五），連續(xù)10周。

2.2? 藥物干預(yù)及標(biāo)本采集

造模成功后，空白對(duì)照組和模型組予3 mL生理鹽水灌胃;維酶素組予維酶素懸濁液3 mL/d灌胃;脾胃培源方（高、中、低劑量組）予3 mL/d灌胃，分別按相當(dāng)于人臨床等效劑量的2倍、4倍、8倍×人與大鼠藥物劑量換算系數(shù)6.71倍，以成人體質(zhì)量 60 kg計(jì)算，分別予20、10、5 g/kg ，連續(xù)灌胃4周。4周后禁食不禁水24 h經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，分離血清后，置于-20 ℃低溫冰箱待檢測(cè)。采血后，處死大鼠，取幽門與前胃及腺胃交界線連線的2/5部分，其一，取一部分組織標(biāo)本，浸入甲醛中固定，石蠟包埋、切片后行HE染色;其二，剩余一部分標(biāo)本放入液氮冰凍保存用于Western blot檢測(cè)。

2.3? 組織病理學(xué)檢測(cè)

取大鼠胃標(biāo)本置于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，觀察大鼠胃黏膜組織病理學(xué)改變。

2.4? ELISA法檢測(cè)大鼠血清胃蛋白酶原I（pepsinogenI， PGⅠ）、胃蛋白酶原Ⅱ（pepsinogenⅡ， PGⅡ）、胃泌素（gastrin-17， G-17）水平變化

冰箱取出經(jīng)腹主動(dòng)脈采血分離后的大鼠血清PGⅠ、PGⅡ、G-17試劑盒及大鼠血清，具體操作按試劑盒要求操作，放入酶標(biāo)儀在10 min內(nèi)中用雙波長即檢測(cè)波長450 nm和校正波長620 nm同時(shí)讀板，采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本實(shí)際濃度。

2.5? Western Blot法檢測(cè)胃組織標(biāo)本中TGF-β1、Smad3蛋白的表達(dá)

提取胃黏膜組織蛋白，蛋白濃度由BCA法檢測(cè)，在收集的蛋白樣品中加入蛋白上樣緩沖液，混勻，100 ℃加熱7 min使蛋白質(zhì)變性。按順序加入蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，室溫封閉2 h，TBST 洗滌3次，10 min/次，分別加入1∶500兔抗鼠TGF-β1、Smad3一抗，4 ℃搖床過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（1∶2 000），置室溫作用2 h，TBST 洗滌 3 次，每次10 min，滴入Super Signal West Femto高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物顯影1 min，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，將TGF-β1、Smad3蛋白條帶的吸光度與β-actin比值作為其蛋白的表達(dá)值。

2.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 胃組織病理學(xué)改變

空白對(duì)照組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，胃黏膜表面正常，細(xì)胞排列整齊，黏膜層未見炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞;模型組大鼠胃黏膜表面相對(duì)明顯缺損，黏膜層變薄，腺體數(shù)目明顯減少，排列較紊亂，黏膜下小血管清晰可見，細(xì)胞核固縮且深染，核漿比例失調(diào);脾胃培源方組和維酶素組胃黏膜結(jié)構(gòu)較完整，但4組間胃黏膜組織腺體萎縮不明顯，與模型組相比可見炎性細(xì)胞數(shù)目較少，無細(xì)胞核固縮。

3.2? 大鼠血清PGⅠ、G-17、PGⅡ水平變化

與空白組比較，模型組血清PGⅠ、G-17水平均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，脾胃培源方組和維酶素組PGⅠ、G-17水平顯著上升（P<0.05）;但維酶素組和脾胃培源方（高、中、低劑量組）4組間采取兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;其中PGⅡ均未見明顯變化（P>0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

3.3? 大鼠胃組織中TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，模型組胃組織TGF-β1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05），胃組織Smad3蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，脾胃培源方組和維酶素組TGF-β1蛋白顯著降低（P<0.05），胃組織Smad3蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05），但維酶素組和脾胃培源方（高、中、低劑量組）4組間采取兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

4 討論

CAG的發(fā)病機(jī)制與很多因素相關(guān)，其中幽門螺旋桿菌感染為主要因素[6]。臨床上主要將胃功能三項(xiàng)作為監(jiān)測(cè)、篩查與診斷的依據(jù)，其中包括PGⅠ、PGⅡ與G-17[7]。許多臨床研究證實(shí)，CAG發(fā)生與PGⅠ、PGⅡ和G-17關(guān)系密切。孫雪飛等[8]通過胃鏡及病理診斷篩選出CAG及慢性非萎縮性胃炎患者各100例，通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）來定量測(cè)定患者空腹血清PGⅠ、PGⅡ和G-17的水平，結(jié)果CAG患者血清PGⅠ、G-17數(shù)值明顯低于慢性非萎縮性胃炎患者，且還發(fā)現(xiàn)幽門螺旋桿菌感染與PG水平有關(guān)。姚文君等[9]通過臨床研究亦發(fā)現(xiàn)CAG患者血清PGⅠ、G-17水平較健康體檢者、胃潰瘍、十二指腸球部潰瘍患者均偏低。以上均表明胃蛋白酶原和胃泌素能夠明顯影響CAG的發(fā)生。

CAG發(fā)生是多因素、多環(huán)節(jié)的演變過程，TGF 是人體中的一種多功能生長調(diào)節(jié)因子，其中TGF-β在此過程中有著相當(dāng)重要的作用。TGF-β是一類細(xì)胞因子家族具有多種不同的生物學(xué)功能，其中以 TGF-β1含量最高，最具有代表性[10]。TGF-β1調(diào)節(jié)著細(xì)胞生長和分化，能使正常的成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，抑制癌變?cè)缙诩?xì)胞[11]。TGF-β1在細(xì)胞調(diào)亡中起傳導(dǎo)信號(hào)的作用，能調(diào)節(jié)正常免疫穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡，控制腸上皮化生，而Smad3蛋白屬受體調(diào)節(jié)型蛋白，與TGF-β1共同參與胃黏膜細(xì)胞的生長抑制調(diào)節(jié)，是CAG形成的重要指標(biāo)[12]。CAG發(fā)生的原因之一為隨著胃內(nèi)pH值的增加，TGF-β1因子含量增加[13]，TGF-β1成纖維細(xì)胞因子可促進(jìn)人體有絲分裂原以及趨化因子運(yùn)作，Smad3蛋白參與并加速TGF-β1成纖維細(xì)胞因子的作用，有效促進(jìn)胃部內(nèi)間質(zhì)纖維化生成[14]，從而人體纖維細(xì)胞被同時(shí)激活，進(jìn)而導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增生，最終導(dǎo)致CAG發(fā)生[15]。

中醫(yī)學(xué)將CAG歸屬于“胃脘痛”“痞滿”等范疇。本病的病機(jī)多為“脾胃虛弱，氣滯血瘀”。脾胃培源方是首屆全國名老中醫(yī)馬駿教授結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)制定的治療脾胃病的經(jīng)驗(yàn)方，主要由炙黃芪、石斛、桂枝、白術(shù)、香附、莪術(shù)等組成，有益氣和中、培補(bǔ)脾胃之功。炙黃芪與白術(shù)益氣補(bǔ)中、補(bǔ)脾益胃共為君藥，石斛與莪術(shù)合用厚腸胃、化滯消積、散結(jié)止痛為臣藥，桂枝解表和營、溫化水氣、補(bǔ)脾益氣為佐藥，香附具有和胃理氣、疏肝止痛為使藥。諸藥結(jié)合，相輔相成，共奏培源固本、培補(bǔ)脾胃之功效。

本次實(shí)驗(yàn)從信號(hào)傳導(dǎo)通路層面研究脾胃培源方對(duì)CAG大鼠的干預(yù)作用，結(jié)果顯示脾胃培源方是通過有效下調(diào)TGF-β1的表達(dá)和上調(diào)Smad3的表達(dá)，從而達(dá)到治療效果。總之，CAG的發(fā)病是多因素、多環(huán)節(jié)作用的結(jié)果，可以初步推斷脾胃培源方通過對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路及其下游的相關(guān)細(xì)胞因子的影響發(fā)揮其治療作用，抑制異型增生細(xì)胞的增殖、促進(jìn)胃黏膜損傷的修復(fù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 李軍祥，陳? 誩，呂? 賓，等.慢性萎縮性胃炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)意見（2017年）[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2018，26（2）：121-131.

[2] 張聲生，李乾構(gòu)，唐旭東，等.慢性萎縮性胃炎中醫(yī)診療共識(shí)意見[J].中醫(yī)雜志，2010，51（8）：749-753.

[3] 李仲啟，傅漢中.胃腸道癌前病變和癌前疾病研究現(xiàn)狀[J].臨床消化病雜志，2015，27（3）：183-185.

[4] 楊宗保，葛來安，何曉暉，等.雙蒲散對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜細(xì)胞TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響[J].江西中醫(yī)藥，2016，47（1）：34-37.

[5] 史? 瑞，李曉紅，方? 蕾，等.彈簧幽門植入術(shù)結(jié)合高鹽熱淀粉糊灌胃誘導(dǎo)大鼠萎縮性胃炎模型的方法及評(píng)價(jià)[J].世界華人消化雜志，2011，19（10）：1001-1008.

[6] 陳? 佳，李守英，徐? 紅，等.慢性萎縮性胃炎的研究進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志，2013，33（14）：3540-3542.

[7] 朱春平，趙建業(yè)，申曉軍，等.血清胃泌素-17聯(lián)合胃蛋白酶原檢測(cè)對(duì)胃癌診斷價(jià)值的多中心臨床研究[J].中華消化內(nèi)鏡雜志，2017，34（1）：19-23.

[8] 孫雪飛，何? 旭.血清胃蛋白酶原與胃泌素檢測(cè)對(duì)慢性萎縮性胃炎的診斷價(jià)值[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2016，13（5）：115-117.

[9] 姚文君，鄭學(xué)東，苗得露.血清胃蛋白酶原、胃泌素-17與胃癌及慢性萎縮性胃炎的相關(guān)性研究[J].臨床合理用藥雜志，2017，10（8）：108-109.

[10] 陳仁龍.健脾活血法治療慢性萎縮性胃炎的療效觀察及對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）、Smad3表達(dá)的影響[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2017：11-13.

[11] 蔡? 蔚，謝海平，龍? 蠡，等.馬歸液對(duì)腺性膀胱炎模型大鼠TGF-β1、EGF-β的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，38（8）：870-874.

[12] 劉? 镕，趙琴平，董惠芬，等.TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路及其生物學(xué)功能[J].中國病原生物學(xué)雜志，2014，9（1）：77-83.

[13] 謝晶日，孫健偉，梁國英.益氣養(yǎng)陰活血法對(duì)慢性萎縮性胃炎胃黏膜細(xì)胞凋亡和基因調(diào)控的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（9）：295-296.

[14] 劉海燕，陳軍賢.香砂養(yǎng)胃丸對(duì)慢性萎縮性胃炎患者胃黏膜TGF-β1、Smad3表達(dá)的影響[J].中藥材，2014，37（3）：540-542.

[15] 戴衛(wèi)波，梅全喜，曾聰彥，等.布渣葉不同提取部位對(duì)大鼠胃液分泌功能的影響研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015，21（3）：34-36.