邵樂 夏相宜 王宇紅 蔡光先 佘顏

〔摘要〕 目的 觀察補陽還五湯精簡方對氧化應(yīng)激損傷后血管內(nèi)皮細胞的保護作用，并從核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子/抗氧化反應(yīng)元件（NF-E2-related factor 2/ antioxidant response element，Nrf2/ARE）途徑探討其作用機制。方法 采用H2O2作用大鼠血管內(nèi)皮細胞4 h建立體外血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激模型，根據(jù)不同處理分成正常組，模型組，補陽還五湯含藥血清組（補陽組），補陽還五湯精簡方含藥血清組（5%精簡組、10%精簡組、20%精簡組）6組。采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài);流式細胞術(shù)檢測血管內(nèi)皮細胞調(diào)亡;測定細胞SOD活力、MDA含量;采用Western blot法檢測細胞Nrf2、血紅素加氧酶-1（HO-1）蛋白的表達。結(jié)果 與模型組比較，含藥血清組均能不同程度改善細胞形態(tài)，升高細胞存活率，其中10%精簡組較5%精簡組、20%精簡組細胞損傷程度低;與模型組比較，補陽組和10%精簡組可有效抑制細胞凋亡 （P<0.05）;與模型組比較，補陽組及10%精簡組可顯著提升SOD活力（P<0.01）;補陽組、10%精簡組及20%精簡組可降低MDA含量（P<0.05）;補陽組及10%精簡組可明顯上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白表達 （P<0.05）。結(jié)論 10%補陽還五湯精簡方可以顯著減輕氧化應(yīng)激造成血管內(nèi)皮細胞的損傷，抑制細胞調(diào)亡，這一作用可能與上調(diào)Nrf2/ARE抗氧化信號通路途徑表達有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 補陽還五湯精簡方;氧化應(yīng)激;血管內(nèi)皮細胞;核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2;血紅素加氧酶-1

〔中圖分類號〕R285.5;R393? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.004

有研究表明，氧化應(yīng)激造成的內(nèi)皮細胞損傷在缺血性腦損害中起關(guān)鍵作用，是造成腦缺血/再灌注不可逆損傷的主要因素[1-2]。轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子/抗氧化反應(yīng)元件（NF-E2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE）抗氧化信號通路是機體重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，在內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要調(diào)控作用[3]。因此，研究氧化應(yīng)激對血管內(nèi)皮細胞的損傷機制，并以此為靶點尋找保護血管內(nèi)皮細胞的有效藥物，對缺血性腦血管疾病的防治具有重要意義。

補陽還五湯精簡方是課題組在多年臨床經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，遵循補陽還五湯之方義，基于益氣祛瘀生新法精簡方藥，并且配合醇提、超臨界CO2提取工藝制備而成。前期動物實驗研究表明補陽還五湯精簡方通過調(diào)控Nrf2/ARE信號通路發(fā)揮抗腦缺血的作用[4]。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步觀察該方對氧化應(yīng)激損傷后血管內(nèi)皮細胞保護作用及可能機制。

1 材料

1.1? 細胞和動物

大鼠血管內(nèi)皮細胞株（bEnd.3細胞株）由長沙唯爾生物技術(shù)有限公司提供。SPF級SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，雄性，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2? 藥材

補陽還五湯處方（生黃芪120 g，當歸尾6 g，川芎3 g，紅花3 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，地龍3 g）和補陽還五湯精簡方處方（黃芪30 g，川芎9 g，地龍6 g），補陽還五湯按傳統(tǒng)水煎后濃縮干燥制備成干浸膏（每1 g干浸膏相當于原生藥4.5 g），補陽還五湯精簡方采用醇提、超臨界CO2提取工藝制備干浸膏（每1 g干浸膏相當于原生藥4.7 g），以上干浸膏均由湖南中醫(yī)藥研究院中藥所提供。

1.3? 主要試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone公司）;胎牛血清（Gibco公司）;MTT（Sigma公司）;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物有限公司）;SOD試劑盒、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所）;兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體、兔抗大鼠血紅素加氧酶-1（HO-1）多克隆抗體（Abcam公司）;兔抗大鼠GAPDH 多克隆抗體（上海拜力生物科技有限公司）。YT-CJ-2NB型超凈工作臺（北京亞泰科隆公司）;DSZ2000X型倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司）;MB-530型酶聯(lián)免疫檢測儀（深圳匯松有限公司）;FACSAriaII型流式細胞儀（美國BD公司）;Bx51光學(xué)顯微鏡及IPP6.0圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）;MK3酶標儀（芬蘭雷勃公司）;mini protean 3 cell電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1? 含藥血清制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機分為補陽組、精簡方組和對照組，每組5只。根據(jù)相關(guān)文獻研究[5]，藥物組予以相當于人臨床用量的6倍劑量給藥，補陽組大鼠劑量換算后約為18 g/（kg·d），精簡組大鼠劑量換算后約12 g/（kg·d），正常組用等容量生理鹽水。均為每天2次，連續(xù)灌胃7 d。于末次灌胃2 h后，無菌條件下，腹主動脈取血，3 500 r/min，離心20 min，取上清，56 ℃滅活30 min，0.22 μm微膜濾過除菌后，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2? 細胞培養(yǎng)

大鼠血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)于10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，單層融合達80%左右，胰酶消化細胞，一分為二進行細胞傳代。待狀態(tài)穩(wěn)定后移至96孔培養(yǎng)板上，分組實驗。

2.3? 細胞分組和處理

取生長良好的細胞制成細胞懸液，細胞生長至密度90%左右，接種于96孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5%C02培養(yǎng)。將補陽還五湯含藥血清配制成10%濃度，而補陽還五湯精簡方含藥血清配制成5%、10%、20% 3個濃度。采用300 μmol/L的H2O2作用血管內(nèi)皮細胞4 h建立細胞氧化應(yīng)激模型。細胞設(shè)6組：（1）正常組;（2）H2O2模型組;（3）補陽組（H2O2模型+10%補陽含藥血清）;（4）5%精簡組（H2O2模型+5%補陽還五湯精簡方含藥血清）;（5）10%精簡組（H2O2模型+10%補陽還五湯精簡方含藥血清）;（6）20%精簡組（H2O2模型+20%補陽還五湯精簡方含藥血清）。將細胞與藥物共同作用2 h后，3 000 r/min離心后，收集各組細胞上清液進行檢測。

2.4? 形態(tài)學(xué)觀察

將各組細胞置于倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化，并拍片記錄。

2.5? 細胞凋亡檢測

將收集的各組細胞置于PBS中洗滌2次，2 000 r/min下離心5 min，收集1×105～5×105細胞;加入 500 μL的Binding Buffer懸浮細胞;加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻;室溫、避光、反應(yīng)5～15 min;在1 h內(nèi)，采用流式細胞儀進行觀察和檢測。

2.6? 細胞 SOD 活力和MDA 含量的檢測

按“2.3”中的分組進行相應(yīng)處理后，收集細胞，離心收集上清液。采用專用試劑盒檢測SOD活力和MDA含量，按試劑盒檢測說明書嚴格操作。

2.7? 細胞Nrf2、HO-1的蛋白表達的檢測

將裂解液融化、分裝，離心得到蛋白抽提物，并用BCA法定量。備膠、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入一抗4 °C孵育過夜，一抗包括兔抗大鼠Nrf2（1∶600），兔抗大鼠HO-1（1∶600），洗膜后加入HRP標記的二抗（1∶4 000）孵育，用ECL系統(tǒng)進行發(fā)光和觀察。采用美國BioRad公司生產(chǎn)Quantity one 4.5.0.軟件系統(tǒng)分析各條帶的灰度值，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值與相應(yīng)的內(nèi)對照GAPDH灰度值的比值， 進行定量分析。

2.8? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有實驗數(shù)據(jù)均經(jīng)過方差齊性檢驗和正態(tài)性檢驗，計量資料用“x±s”表示，相同時間點的比較采用獨立樣本t檢驗或方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 形態(tài)學(xué)觀察

正常組血管內(nèi)皮細胞飽滿，大小均勻，胞核比較清晰，細胞呈鋪路石樣緊密排列。H2O2模型組細胞呈多角形，輪廓不清晰，核周圍可見深色顆粒，同時可見一些細胞碎片，細胞存活率較正常組明顯降低，含藥血清處理組細胞存活率不同程度升高，其中10%精簡組含藥血清處理組較5%、20%精簡組細胞損傷程度低。

3.2? 不同含藥血清對H2O2處理血管內(nèi)皮細胞后細胞凋亡的影響

相較于正常組，模型組細胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象（P<0.01）。補陽組和10%精簡組抑制凋亡的效果明顯，凋亡率與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3.3? 不同含藥血清對H2O2處理血管內(nèi)皮細胞后細胞內(nèi)SOD 活力、MDA 含量的影響

與正常組比較，模型組SOD活力明顯降低（P<0.01），MDA含量顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，補陽組及10%精簡組能升高SOD活力（P<0.01），降低MDA含量（P<0.05）。見表2。

3.4? 不同含藥血清對H2O2處理血管內(nèi)皮細胞后細胞內(nèi)Nrf2、HO-1蛋白的影響

正常組中Nrf2、HO-1蛋白呈少量表達，模型組Nrf2蛋白表達與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。補陽組及10%精簡組明顯上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白表達，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。表3。

4 討論

正常血管內(nèi)皮細胞形態(tài)上緊密相連，在維持血管壁通透性完整、保持血管舒張收縮平衡、抗血栓形成及減輕血管炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。血管內(nèi)皮細胞損傷是缺血性腦血管疾病病理學(xué)基礎(chǔ)，在眾多損傷因素中，氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷的始動因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，干預(yù)血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷已成為治療心腦血管疾病的主要途經(jīng)[6-8]。

Nrf2/ARE抗氧化信號通路是機體重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，Nrf2屬于CNC（cap-n-collar）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，該因子在生理狀態(tài)下與Keap1 結(jié)合處于失活狀態(tài)，氧化應(yīng)激刺激Nrf2與 Keap1解偶聯(lián)并在多種蛋白激酶的磷酸化作用下，Nrf2 進入細胞核與抗氧化反應(yīng)元件（ARE） 結(jié)合，啟動 HO-1 基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮強大的抗氧化作用。有研究表明Nrf2/ARE抗氧化信號通路中的關(guān)鍵分子Nrf2、HO-1參與不同來源氧自由基誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用[9-11]。

體外氧化應(yīng)激細胞模型成功建立是從細胞分子基因水平研究缺血缺氧性損傷的前提，其能準確模擬體內(nèi)腦缺血時自由基增多這一環(huán)境，有助于研究腦缺血后氧化應(yīng)激機制以及抗氧化應(yīng)激藥物的作用靶點。本文采用H2O2作用血管內(nèi)皮細胞模擬氧化應(yīng)激條件下血管內(nèi)皮細胞的損傷[12-13]，實驗表明：在H2O2刺激下， 細胞明顯損傷，這種損傷變化可能與SOD 活力降低、MDA含量升高有關(guān)，提示氧化應(yīng)激加劇內(nèi)皮細胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的損傷。同時，氧化應(yīng)激刺激Nrf2/ARE抗氧化信號通路中關(guān)鍵分子Nrf2及HO-1表達增多，從而發(fā)揮抗氧化效應(yīng)。

補陽還五湯為已證實可有效抑制早期神經(jīng)功能惡化[14]，且P13K-Akt信號通路的調(diào)控可能是關(guān)鍵機制之一[15]。補陽還五湯精簡方由黃芪、川芎等組成，遵循補陽還五湯之方義，秉承“瘀血不去，新血不生”和“不破不立，瘀祛新生”的觀念而組方，并且配合醇提、超臨界CO2提取工藝制備，以組建一種物質(zhì)基礎(chǔ)明確、藥效相當甚至更優(yōu)于原方的新型復(fù)方。本實驗將不同濃度（5%、10%、20%）的補陽還五湯精簡方含藥血清與H2O2損傷的血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)，結(jié)果10%補陽還五湯精簡方含藥血清能明顯促進血管內(nèi)皮細胞增殖，抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡，且顯著提高SOD活性，降低MDA含量，提示補陽還五湯精簡方通過增強脂質(zhì)抗氧化酶活性而拮抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷，從而發(fā)揮對血管內(nèi)皮細胞保護作用。10%補陽還五湯精簡方含藥血清能上調(diào) Nrf2-ARE信號通路中Nrf2、HO-1蛋白的表達，推測補陽還五湯精簡方可激活內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，進而增強血管內(nèi)皮細胞抗氧化應(yīng)激損傷能力，進一步豐富了補陽還五湯抗氧化應(yīng)激的作用機制。

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