鄧星 羅莉婭 茍立平 溫倩雯 湯明海 萬麗

中圖分類號 R969.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）02-0170-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.06

摘 要 目的：建立測定肝微粒體孵育體系中辣薄荷基厚樸酚濃度的方法，并探討其在不同種屬肝微粒體中的代謝特征。方法：分別將辣薄荷基厚樸酚溶解于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）啟動的人、大鼠、小鼠、猴、犬肝微粒體孵育體系中，置于37 ℃水浴中進行孵育，分別于孵育的0、2、5、10、15、20、30、45、60 min時用甲醇終止反應，以厚樸酚為內標，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（UPLC-MS/MS）測定各孵育體系中辣薄荷基厚樸酚的質量濃度。色譜柱為Acquity UPLCTM CSH C18，流動相為0.1%甲酸溶液-甲醇（梯度洗脫），流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為2 μL；離子源為電噴霧離子源，以多反應監(jiān)測模式進行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 401.2→331.1（辣薄荷基厚樸酚）、m/z 265.1→247.0（內標）。以孵育0 min時辣薄荷基厚樸酚的質量濃度為參照，計算其在不同孵育體系中的藥物剩余百分比、體外代謝半衰期（t1/2）和固有清除率（CLint）。采用化學抑制劑法探討辣薄荷基厚樸酚的代謝途徑；在上述色譜條件下，采用一級全掃描以正離子方式檢測，初步分析其體外代謝產(chǎn)物。結果：辣薄荷基厚樸酚質量濃度檢測的線性范圍為3.91～500.00 ng/mL，定量下限為3.91 ng/mL；日內、日間RSD均小于10%，準確度為87.40%～103.75%，基質效應不影響待測物的測定。辣薄荷基厚樸酚在人、大鼠、小鼠、犬肝微粒體中代謝明顯，而在猴肝微粒體中代謝不明顯；孵育30 min后，其在各種屬肝微粒體的藥物剩余百分比趨于穩(wěn)定。辣薄荷基厚樸酚在人、大鼠、小鼠、猴、犬肝微粒體中的t1/2分別為12.07、17.68、17.59、216.56、61.88 min，CLint分別為0.115、0.078、0.079、0.006、0.022 mL/（min·mg）。細胞色素P450（CYP）2A6、CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9、CYP2E1、CYP1A2酶對該化合物代謝的抑制率分別為55.76%、93.94%、96.01%、93.69%、71.81%、23.25%、28.04%。辣薄荷基厚樸酚在人肝微粒體中兩個主要代謝產(chǎn)物的準分子離子峰分別為m/z 441.2（[M+Na]+）、m/z 337.2（[M+H]+）。結論：本研究建立的UPLC-MS/MS法簡便、快速、專屬性強，可用于肝微粒體孵育體系中辣薄荷基厚樸酚濃度的測定及藥動學的研究。該化合物在人、大鼠、小鼠、猴、犬等5種肝微粒體中的代謝特征有差異，且其代謝過程可能與CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9等酶有關。

關鍵詞 辣薄荷基厚樸酚；不同種屬；肝微粒體；體外代謝穩(wěn)定性；代謝酶；代謝產(chǎn)物

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of piperitylmagnolol in the incubation system of liver microsomes， and to investigate the metabolic characteristics of it in different species of liver microsomes. METHODS： The piperitylmagnolol were respectively dissolved in NADPH activated liver microsome incubation systems of human， rat， mouse， monkey and dog， and then incubated in water at 37 ℃. The reaction was terminated with methanol at 0， 2， 5， 10， 15， 20， 30， 45 and 60 minutes of incubation， respectively. Using magnolol as internal standard， UPLC-MS/MS method was used to determine the concentration of piperitylmagnolol in the incubation system. The determination was performed on Acquity UPLCTM CSH C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid-methanol （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and the sample size was 2 μL. The ion source was electrospray ion source， and the positive ion scanning was carried out in the multiple reaction monitoring mode. The ion pairs used for quantitative analysis were m/z 401.2→331.1 （piperitylmagnolol） and m/z 265.1→247.0 （internal standard）， respectively. Using the concentration of piperitylmagnolol at 0 min of incubation as a reference， the residual percentage， metabolism half-life in vitro （t1/2） and intrinsic clearance （CLint） were calculated for different incubation systems. The metabolic pathway of piperitylmagnolol was studied by chemical inhibitor method. Under the above chromatographic conditions， the metabolites in vitro were preliminarily analyzed by first-order full scanning and positive ion detection. RESULTS： The linear range of piperitylmagnolol was 3.91-500.00 ng/mL. The limit of quantitation was 3.91 ng/mL. RSDs of intra-day and inter-day were less than 10%. The accuracy ranged 87.40%-103.75%. Matrix effect didn’t affect the determination of the substance to be measured. The piperitylmagnolol was metabolized significantly in human， rat， mouse and dog liver microsomes， but not in monkey liver microsomes. After incubating for 30 min， residual percentage of piperitylmagnolol kept stable in different species of liver microsomes. The t1/2 of piperitylmagnolol were 12.07， 17.68， 17.59， 216.56 and 61.88 min in human， rat， mouse， monkey and dog liver microsomes； CLint were 0.115， 0.078， 0.079， 0.006， 0.022 mL/（min·mg）， respectively. Inhibitory rates of CYP2A6， CYP2D6， CYP2C19， CYP3A4， CYP2C9， CYP2E1 and CYP1A2 to compound metabolism were 55.76%， 93.94%， 96.01%， 93.69%， 71.81%， 23.25%， 28.04%， respectively. Quasi-molecular ion peaks of the two main metabolites of piperitylmagnolol in human liver microsomes were m/z 441.2（[M+Na]+） and m/z 337.2（[M+H]+）， respectively. CONCLUSIONS： Established UPLC-MS/MS method is simple， rapid and specific， and can be used for the determination of piperitylmagnolol concentration in the incubation system of liver microsomes and pharmacokinetic study. The metabolic characteristics of the compound are different among liver microsomes of human， rat， mouse， monkey and dog. Its metabolism process may be associated with CYP2D6， CYP2C19， CYP3A4， CYP2C9， etc.

KEYWORDS Piperitylmagnolol； Different species； Liver microsomes； Metabolic stability in vitro； Metabolic enzyme； Metabolites

木脂素類（Lignans）化合物由于其多樣的結構和生物活性一直是目前研究的熱點領域之一[1]。相關研究指出，該類化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝及抑制血小板活化因子等藥理作用[2]。辣薄荷基厚樸酚（Piperitylmagnolol，化學結構式見圖1）最早被發(fā)現(xiàn)于木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）的干燥干皮、枝皮及根皮中[3]，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化等活性[4]，屬于木脂素中的新木脂素類化合物。Youn UJ等[5]研究發(fā)現(xiàn)，辣薄荷基厚樸酚對宮頸癌細胞HeLa、慢性髓系白血病細胞K562、非小細胞肺癌細胞A549和結腸癌細胞HCT116等多種人腫瘤細胞具有一定的體外抑制活性，其半數(shù)抑制濃度（IC50）為7.7～9.5 μg/mL；Syu WJ等[6]研究表明，辣薄荷基厚樸酚和厚樸酚對耐萬古霉素腸球菌（VRE）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等耐藥菌株均有一定的體外抑制作用，其最低抑制濃度（MIC）為6.25～25 μg/mL，且辣薄荷基厚樸酚的抑菌效果更好。由此可見，該化合物具有一定的開發(fā)價值。

與體內代謝研究相比，體外代謝研究具有操作簡單方便、經(jīng)濟高效、檢測多樣化的特點，更適用于新藥代謝特征的早期評價[7]。目前，國內外對于辣薄荷基厚樸酚的相關研究尚少，為進一步明確其開發(fā)價值，本研究以超高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術（UPLC-MS/MS）為檢測手段，初步考察了該化合物在5個不同種屬（人、大鼠、小鼠、猴、犬）肝微粒體中的體外代謝穩(wěn)定性，并預測了參與其代謝的主要同工酶和主要代謝產(chǎn)物，旨在獲取辣薄荷基厚樸酚的體外代謝特征，為其后續(xù)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UPLC系統(tǒng)，含SIL-30AC型自動進樣器、LC-30AD型色譜儀、CBM-20A型系統(tǒng)控制器、CTO-20AC型柱溫箱（日本Shimadzu公司）；SCIEX QTRAP 5500型三重四級桿MS儀（美國AB公司）；AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Heraeus Fresco 17型高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；S0200-230型渦旋混合儀（上海迪奧生物科技有限公司）；Milli Q型超純水系統(tǒng)（美國Merck Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

辣薄荷基厚樸酚對照品（批號：20170323，純度：>99%）、厚樸酚對照品（內標，批號：20161103，純度：>99%）均由四川大學生物治療國家重點實驗室提供；人肝微粒體（批號：M10001-2017002，質量濃度：20 mg/mL）、大鼠肝微粒體（批號：M10011-2017002，質量濃度：20 mg/mL）、小鼠肝微粒體（批號：M10017-2017002，質量濃度：20 mg/mL）、猴肝微粒體（批號：M10005-2017002，質量濃度：20 mg/mL）、犬肝微粒體（批號：M10007- 2017002，質量濃度：20 mg/mL）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）孵育系統(tǒng){含A液[β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鈉鹽、葡萄糖-6-磷酸、氯化鎂水溶液，批號：NRS（A）2017001]、B液[葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、檸檬酸鈉溶液，批號：NRS（B）2017001]}均購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術有限公司；硝酸毛果蕓香堿對照品（批號：100157-200201，純度：供含量測定用）、鹽酸噻氯匹定對照品（批號：100542-201002，純度：>99.7%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；奎尼丁對照品[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：KVZTE-LQ，純度：>98%]；酮康唑對照品（德國Dr Ehrenstorfer公司，批號：11208，純度：>99%）；磺胺苯吡唑對照品（批號：SLBC7923V，純度：>99%）、二乙基二硫代氨基甲酸鈉對照品（批號：MKBJ4989V，純度：99%）均購自美國Sigma公司；α-萘黃酮對照品（東京化成工業(yè)株式會社，批號：UEESA-JQ，純度：>98.0%）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Acquity UPLCTM CSH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～2 min，80%B→90%B；2～5 min，90%B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL。

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；離子噴霧電壓：5.5 kV；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：20 psi。采用多反應監(jiān)測（MRM）模式掃描，正離子方式檢測。用于定量分析的離子對分別為m/z 401.2→331.1（辣薄荷基厚樸酚）和m/z 265.1→247.0（內標），碰撞能量（CE）分別為38、30 eV，去簇電壓（DP）均為130 V；離子束聚焦電壓（EP）：10 V；碰撞池出口電壓（CXP）：10 V；駐留時間：0.20 s。

2.2 溶液的配制

2.2.1 辣薄荷基厚樸酚貯備液及系列工作液 取辣薄荷基厚樸酚對照品10.00 mg，精密稱定，用甲醇定容至10 mL棕色量瓶中，混勻，即得質量濃度為1 mg/mL的辣薄荷基厚樸酚貯備液，于4 ℃冰箱中密封保存，備用。臨用前，用甲醇逐級稀釋至相應質量濃度，即得辣薄荷基厚樸酚系列工作液。

2.2.2 內標貯備液及內標溶液 取內標對照品10.00 mg，精密稱定，用甲醇定容至10 mL棕色量瓶中，混勻，即得質量濃度為1 mg/mL的內標貯備液，于4 ℃冰箱中密封保存，備用。臨用前，用甲醇稀釋至相應質量濃度，即得內標溶液。

2.2.3 特異性抑制劑溶液 分別取細胞色素P450（CYP）酶抑制劑硝酸毛果蕓香堿、奎尼丁、鹽酸噻氯匹定、酮康唑、磺胺苯吡唑、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、α-萘黃酮對照品各10.00 mg，精密稱定，用甲醇分別定容至10 mL棕色量瓶中，混勻，即得質量濃度均為1 mg/mL的特異性抑制劑貯備液，于4 ℃冰箱中密封保存，備用。臨用前，用甲醇稀釋至相應質量濃度，即得特異性抑制劑溶液。

2.3 樣品孵育與處理

2.3.1 樣品孵育 參照文獻[8]配制孵育體系。其總體積為200 μL，包含磷酸鹽緩沖液（PBS，100 mmol/L，pH 7.4）188 μL和NADPH孵育系統(tǒng)12 μL（含A液10 μL和B液2 μL），于冰浴上混合而得（現(xiàn)用現(xiàn)配），隨后加入質量濃度為100 μg/mL的辣薄荷基厚樸酚工作液（該孵育體系中甲醇的體積分數(shù)應低于1%），于37 ℃水浴中預孵育5 min后，加入肝微粒體5 μL啟動反應。

2.3.2 樣品處理 取孵育后的樣品200 μL，于不同時間點加入4 ℃甲醇（含內標10 ng/mL）400 μL終止反應，渦旋混勻3 min后，于4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，取上清液適量進行UPLC-MS/MS分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 取人肝微粒體適量，經(jīng)高溫滅活后，分別按“2.3”項下方法制備不含待測物和內標的空白對照樣品、含上述物質的樣品以及體外代謝穩(wěn)定性研究孵育樣品（人肝微粒體，孵育5 min時的樣品），再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示，辣薄荷基厚樸酚和內標的保留時間分別為4.68、2.33 min，分離度良好，且沒有受到空白基質的干擾，表明本法專屬性強，詳見圖2。

2.4.2 標準曲線的繪制與定量下限的考察 按“2.2.1”項下方法配制辣薄荷基厚樸酚系列工作液，分別量取上述工作液2 μL，加入PBS 200 μL，混勻，加至經(jīng)高溫滅活的人肝微粒體中，制得辣薄荷基厚樸酚質量濃度分別為3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 ng/mL的系列標準樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測物質量濃度為橫坐標（x）、待測物與內標的峰面積比值為縱坐標（y），采用加權法（加權系數(shù)為1/x）進行線性回歸，得回歸方程為y=0.409 6x+0.069 9（R2=0.999 6）。結果表明，辣薄荷基厚樸酚質量濃度檢測的線性范圍為3.91～500.00 ng/mL，定量下限為3.91 ng/mL。

2.4.3 精密度與準確度試驗 按“2.4.2”項下方法配制辣薄荷基厚樸酚低、中、高質量濃度（7.81、62.50、400.00 ng/mL）質控樣品，每個質量濃度平行操作5次，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，考察日內精密度；連續(xù)測定3 d，考察日間精密度；將實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，考察準確度。結果顯示，低、中、高質量濃度質控樣品的日內、日間RSD均小于10%，準確度分別為91.11%～100.37%、87.40%～103.75%、87.06%～98.67%，符合生物樣品定量分析的相關要求[9]，詳見表1。

2.4.4 基質效應 按“2.4.2”項下方法配制辣薄荷基厚樸酚低、中、高質量濃度（7.81、62.50、400.00 ng/mL）質控樣品，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，得相應峰面積（A）；另用流動相配制與上述質控樣品理論質量濃度對應的對照品溶液，進樣測定，得相應峰面積（B）。每個質量濃度平行操作5次?；|效應=A/B×100%。結果顯示，辣薄荷基厚樸酚的基質效應為85.40%～103.75%（RSD為3.72%～6.79%，n=5），內標基質效應為99.96%～100.37%（RSD為1.21%～2.03%，n=5），表明本法受基質效應的影響較小，詳見表1。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.4.2”項下方法配制辣薄荷基厚樸酚低、中、高質量濃度（7.81、62.50、400.00 ng/mL）質控樣品，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，每個質量濃度平行操作5次，考察各質控樣品于室溫及自動進樣室（4 ℃）內放置24 h的穩(wěn)定性。結果顯示，在上述條件下，辣薄荷基厚樸酚各質控樣品起止時間點峰面積的比值為86.98%～96.51%（RSD為0.79%～3.70%，n=5），表明其穩(wěn)定性良好，詳見表2。

2.5 辣薄荷基厚樸酚體外代謝特征研究

2.5.1 代謝穩(wěn)定性 取“2.2.1”項下辣薄荷基厚樸酚貯備液適量，用甲醇稀釋至40 μg/mL，取上述稀釋后的溶液2 μL，加至“2.3.1”項下孵育體系中，于37 ℃水浴中預孵育5 min后，加入肝微粒體5 μL啟動反應。分別于孵育0、2、5、10、15、20、30、45、60 min時加入4 ℃甲醇（含內標10 ng/mL）各400 μL終止反應，渦旋混勻3 min后，于4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，取上清液，按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，計算各體系中辣薄荷基厚樸酚的質量濃度。以孵育0 min時辣薄荷基厚樸酚的質量濃度為參照，其他時間點的質量濃度與之相比計算其藥物剩余百分比；以藥物剩余百分比為縱坐標、時間為橫坐標，采用Excel 2016軟件繪制辣薄荷基厚樸酚在5種肝微粒體孵育體系中的孵育曲線，詳見圖3。各種屬肝微粒體孵育體系均平行操作3次。

由圖3可見，辣薄荷基厚樸酚在人、大鼠、小鼠、犬等4種肝微粒體中的代謝明顯，而在猴肝微粒體中的代謝不明顯。孵育30 min后，其在各種屬肝微粒體中的藥物剩余百分比變化較小，代謝逐漸趨于穩(wěn)定。

2.5.2 體外半衰期（t1/2）與固有清除率（CLint）的計算 計算辣薄荷基厚樸酚人、大鼠、小鼠、猴、犬肝微粒體中的代謝相關參數(shù)：將各時間點的藥物剩余百分比的自然對數(shù)（y）與孵育時間（x）作線性回歸，得相應回歸方程；以上述線性回歸方程的斜率（k）根據(jù)公式t1/2=-0.693/k計算得其t1/2，并按公式CLint=0.693×孵育液體積（mL）/[t1/2×肝微粒體質量（mg）]計算得其CLint[10]，結果見表3。

2.6 辣薄荷基厚樸酚的代謝途徑分析

參照“2.5”項下確定的辣薄荷基厚樸酚在不同種屬肝微粒體中的代謝相關參數(shù)，采用化學抑制劑法[11]對其代謝途徑進行初步探討。在“2.3.1”項下孵育體系中分別加入“2.5.1”項下40 μg/mL辣薄荷基厚樸酚溶液1 μL和各特異性抑制劑（按“2.2.3”項下方法配制，并折算為摩爾濃度，即CYP2A6抑制劑硝酸毛果蕓香堿25 μmol/L、CYP2D6抑制劑奎尼丁10 μmol/L、CYP2C19抑制劑鹽酸噻氯匹定25 μmol/L、CYP3A4抑制劑酮康唑1 μmol/L、CYP2C9抑制劑磺胺苯吡唑20 μmol/L、CYP2E1抑制劑二乙基二硫代氨基甲酸鈉50 μmol/L以及CYP1A2抑制劑α-萘黃酮1 μmol/L[12-13]）1 μL，于37 ℃水浴中預孵育5 min后，加入人肝微粒體5 μL啟動反應，混勻后，于37 ℃水浴中繼續(xù)孵育30 min，加入4 ℃甲醇（含內標10 ng/mL）400 μL終止反應；同時設置未發(fā)生反應的陰性對照（即不加NADPH孵育系統(tǒng)和特異性抑制劑，用甲醇補足剩余體積）和完全反應的陽性對照（即不加特異性抑制劑，但加NADPH孵育系統(tǒng)，用甲醇補足剩余體積），同法孵育。按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣測定，計算辣薄荷基厚樸酚質量濃度和抑制率[抑制率=[1-（陰性對照樣品質量濃度-試驗組樣品質量濃度）/（陰性對照樣品質量濃度-陽性對照樣品質量濃度）]×100%][12-13]。各種屬肝微粒體孵育體系均平行操作3次。

采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)處理。結果顯示，辣薄荷基厚樸酚的代謝是由多種CYP酶介導的，其中CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9酶對辣薄荷基厚樸酚代謝的抑制率較高，分別為93.94%、96.01%、93.69%、71.81%，表明上述4種酶可能是參與該化合物代謝的主要同工酶；而CYP2A6、CYP2E1、CYP1A2酶的抑制率較低，分別為55.76%、23.25%、28.04%，提示上述3種酶可能與該化合物的代謝無關，詳見表4。

2.7 辣薄荷基厚樸酚體外代謝產(chǎn)物初探

按“2.3.1”項下方法，于冰浴上將質量濃度為2 mg/mL的辣薄荷基厚樸酚工作液2 μL（按“2.2.1”項下方法配制）加至孵育體系中，于37 ℃水浴中預孵育5 min后，加入人肝微粒體5 μL啟動反應，混勻后，分別于孵育0、60 min時加入4 ℃甲醇（含內標）各400 μL終止反應，渦旋混勻3 min后，于4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，取上清液，在“2.1.1”項下色譜條件下，采用一級全掃描（MS Scan）以正離子方式檢測，掃描范圍為m/z 100～1 000，比較上述兩個時間點的色譜圖差異，以初步判斷辣薄荷基厚樸酚的體外代謝產(chǎn)物。

結果顯示，與0 min時的色譜圖（圖4A）比較，60 min時的色譜圖（圖4B）新增2個色譜峰，其準分子離子峰分別為m/z 441.2（[M+Na]+）、m/z 337.2（[M+H]+）；根據(jù)該化合物的碎片離子峰初步判斷，4.347、6.903、10.653 min處的色譜峰則可能是由與肝微粒體有關的雜質所致，詳見圖4、圖5。

3 討論

在新藥研發(fā)的早期階段，學者可通過研究藥物在體外肝微粒體中的代謝特征來比較其在不同種屬中代謝的差異，可為后期動物模型的選擇和藥物在人體內的代謝特征研究提供一定的參考[14-15]。本研究建立了測定新木脂素類化合物辣薄荷基厚樸酚質量濃度的UPLC-MS/MS法。該方法專屬性強、靈敏度及準確度高、基質效應低、重復性好，可用于生物樣品中該化合物濃度的測定及藥動學的研究。

厚樸酚和辣薄荷基厚樸酚結構相近，且性質穩(wěn)定，能與生物基質基線分離，且保留時間、響應值和峰形均較好，故本研究將厚樸酚選為內標。在前期條件篩選中，本課題組首先以甲醇-水、乙腈-水體系作為流動相進行考察，結果發(fā)現(xiàn)待測物峰形拖尾嚴重；而在水相中加入0.1%甲酸后，能使待測物的峰形得以改善，并同時使其具有較高的響應值和合適的保留時間。因此，本研究最終選擇0.1%甲酸溶液-甲醇作為流動相。此外，在方法學考察中，肝微粒體是經(jīng)高溫滅活的，且含量極低，因此可忽略不同種屬肝微粒體間的差異，故本研究最終選擇了具有代表性的人肝微粒體作為生物樣品基質，進行后續(xù)方法學考察。

參考《化學藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》[16]，本研究選取5個種屬的肝微粒體進行體外代謝特征研究。結果顯示，辣薄荷基厚樸酚在犬和猴肝微粒體中的代謝時間較長（t1/2較大），在人和大鼠、小鼠肝微粒體中的代謝較為相似，提示在后續(xù)研究中可考慮以大鼠或小鼠作為臨床前藥動學和毒理學研究的模型動物。代謝途徑試驗結果表明，CYP2D6、CYP3A4、CYP2C19、CYP2C9酶可能參與了辣薄荷基厚樸酚的代謝過程，而CYP2A6、CYP2E1、CYP1A2酶可能與該化合物的代謝無關。這提示該化合物的體內代謝可能涉及多種同工酶，在聯(lián)合用藥時，應考慮上述同工酶共同作用所導致的藥效增強或中毒情況的發(fā)生[17]。體外代謝產(chǎn)物特征離子碎片峰可見準分子離子峰m/z 441.2，推斷其可能是原化合物被引入羥基（—OH），然后加Na+而得；此外，還可見準分子離子峰m/z 337.2，推測其可能是原化合物環(huán)己烯結構開環(huán)，脫去—C5H8，然后加H+而得。但其具體的代謝物結構及代謝過程仍有待后續(xù)研究進一步確證。

綜上所述，本研究建立的UPLC-MS/MS法簡便、快速、專屬性強，可用于生物樣品中辣薄荷基厚樸酚濃度的測定及藥動學的研究。該化合物在人、大鼠、小鼠、猴、犬等5種肝微粒體中的代謝特征有所差異，且其代謝過程可能與CYP2D6、CYP3A4、CYP2C19、CYP2C9等酶有關。但其具體種屬代謝差異、代謝產(chǎn)物結構等尚需后續(xù)研究進一步探討。

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（收稿日期：2018-06-06 修回日期：2018-11-10）

（編輯：張元媛）