于秀燕 李躍榮 徐會圃 趙冬冬 陳薇薇 郭紀偉 馬寶新

摘 要 目的：研究促紅細胞生成素衍生物螺旋B表面肽（HBSP）對表柔比星誘發(fā)大鼠心肌損傷的改善作用及機制。方法：將SD大鼠隨機分為對照組、模型組、促紅細胞生成素（EPO）組和HBSP組，每組10只。除對照組外，其余各組大鼠均腹腔注射表柔比星2.5 mg/kg，每周1次，連續(xù)6周復制心肌損傷模型，EPO組和HBSP組大鼠分別腹腔注射重組人促紅細胞生成素（rhEPO）5 000 u/kg或HBSP 60 μg/kg，每周3次（分別于表柔比星給藥前1天、給藥后第1天以及給藥后第3天給藥），連續(xù)6周。以首次給藥開始計時，第11周稱各組大鼠體質(zhì)量，超聲心動圖檢測其心功能[左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、射血分數(shù)（EF）、縮短分數(shù)（FS）及心輸出量（CO）]，酶聯(lián)免疫吸附法測定其血清中肌鈣蛋白I（cTnI）、氨基末端B型利鈉肽原（NT-proBNP）的含量，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)檢測其心肌組織中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（Akt）mRNA的表達，Western blot法檢測其心肌組織中p-PI3K和p-Akt蛋白的表達。結(jié)果：在研究期內(nèi)，模型組有2只大鼠死亡，EPO組有1只大鼠死亡，HBSP組無大鼠死亡。與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、EF、FS、CO均顯著降低，LVIDd和cTnI、NT-proBNP含量均顯著增加，PI3K、Akt mRNA表達水平及p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平均顯著降低，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，EPO組及HBSP組大鼠體質(zhì)量、EF、FS、CO均顯著增加，LVIDd和cTnI、NT-proBNP含量顯著降低，PI3K、Akt mRNA表達水平及p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平均顯著升高，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與EPO組比較，HBSP組大鼠cTnI、NT-proBNP含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：HBSP對大鼠心肌損傷具有與EPO相當?shù)母纳谱饔?，且毒性更小，二者改善心肌損傷的作用機制可能與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 螺旋B表面肽;表柔比星;心肌損傷;磷脂酰肌醇-3-激酶;蛋白激酶B;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects and its mechanism of erythropoietin derivative helix B surface peptide （HBSP） on epirubicin-induced myocardial injury in rats. METHODS： SD rats were randomly divided into control group， model group， erythropoietin （EPO） group and HBSP group， with 10 rats in each group. Except for control group， other groups were given epirubicin 2.5 mg/kg intraperitoneally， once a week， for consecutive 6 weeks to induce myocardial injury model. EPO group and HBSP groups were given rhEPO 5 000 u/kg or HBSP 60 μg/kg intraperitoneally， 3 times a week （one day before medication， first day and third day after medication of epirubicin）， for consecutive 6 weeks. At the beginning of the first administration， the rats were weighed at the 11th week. The cardiac function was measured by echocardiography [left ventricular end-diastolic diameter （LVIDd）， ejection fraction （EF）， fractional shortening （FS） and cardiac output（CO）]. The serum levels of troponin I （cTnI） and amino-terminal B-type natriuretic peptide （NT-proBNP） were determined by ELISA. mRNA expression of PI3K and Akt in myocardial tissue was detected by RT-PCR. The protein expression of p-PI3K and p-Akt in rat myocardium were detected by Western blot. RESULTS： During research period， two rats died in model group， one in EPO group and none in HBSP group. Compared with control group， body weight， the levels of EF， FS and CO were decreased significantly in model group， while the contents of LVIDd and cTnI， NT-proBNP were increased significantly; mRNA expression of PI3K and Akt as well as protein expression of p-PI3K and p-Akt were decreased significantly， above differences were statistical significant （P<0.05）. Compared with model group， body weight， the levels of EF， FS and CO were increased significantly in EPO group and HBSP group， while the contents of LVIDd and cTnI， NT-proBNP were decreased significantly; mRNA expression of PI3K and Akt as well as protein expression of p-PI3K and p-Akt were increased significantly， above differences were statistical significant （P<0.05）. Compared with EPO group， the contents of cTnI and NT-proBNP were decreased significantly in HBSP group， with statistical significance （P<0.05）. CONCLUSIONS： HBSP can improve myocardial injury in rats as much as EPO， and has less toxity. Their mechanism may be related to the activation of PI3K/Akt signaling pathway.

KEYWORDS? ?Helix B surface peptide; Epirubicin; Myocardial injury; PI3K; Akt; Rat

表柔比星，又名表阿霉素，是蒽環(huán)類藥物新的衍生物，在臨床上已成為多柔比星有效、實用的替代物。在過去30年，蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的使用明顯提高了腫瘤患者的生存率及預(yù)后[1]。然而，其心血管副作用限制了在臨床實踐中的應(yīng)用。長期使用蒽環(huán)類藥物會使心肌纖維化和重塑，導致心功能障礙[2]。促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）對心、腎、肝、腦及視網(wǎng)膜等受損組織可發(fā)揮重要的保護作用[3]。然而，EPO的紅細胞生成作用可導致血栓形成、中風和高血壓等副作用，明顯限制了EPO的臨床應(yīng)用[4]。螺旋B表面肽（Helix B surface peptide，HBSP）是衍生自EPO的螺旋B結(jié)構(gòu)域的小肽，具有與EPO相同的藥動學特性，發(fā)揮相似的組織保護作用，但其對骨髓造血系統(tǒng)無明顯影響，無促紅細胞生成活性，避免了EPO可引起的相關(guān)副作用，但其心肌保護的具體作用機制仍不明確[5]。本實驗通過建立表柔比星致心肌損傷模型大鼠，并給予表柔比星致心肌損傷模型大鼠EPO及HBSP進行治療，進一步驗證EPO及HBSP對表柔比星誘發(fā)的心肌損傷的保護作用，并初步探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

-80 ℃低溫冰箱（美國 Thermo Fisher Scientific公司）;SW-CJ-2FD型超凈工作臺（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）;VividE9型彩色多普勒超聲診斷儀（ 北京市瑞強興達醫(yī)療設(shè)備公司）;5417R型超速離心機（德國Eppendorf公司）;T-100型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀和Jeldoc2000型凝膠影像分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸表柔比星（以下簡稱表柔比星，海正輝瑞制藥有限公司，批號：20180810，規(guī)格：10 mg）;注射用重組人促紅細胞生成素（rhEPO，昂德生物藥業(yè)有限公司，批號：20180802，規(guī)格：5 000 u）;HBSP（上?？齐纳锟萍加邢薰荆枺?0180804，純度：>98%）;大鼠心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、血清氨基末端 B 型利鈉肽原（NT-proBNP）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：ML1003202、ML1003039）;總RNA提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司，批號：20180617）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，批號：RR047A）;甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔單克隆抗體（上海生工生物工程有限公司，批號：20180907）;磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphorylation-phosphatidylinositol-3-kinase，p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylation-protein kinase B，p-Akt）兔單克隆抗體（美國Cell signaling公司，批號：4292、9611S）;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（美國Bioworld公司）;增強化學發(fā)光（ECL）液試劑盒（美國Sigma公司）;其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動物

SPF級Wistar大鼠40只，♂，6～8周齡，體質(zhì)量（280±20） g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20140007。本實驗方案已通過濱州醫(yī)學院動物實驗倫理審查。

2 方法

2.1 大鼠分組及處理

將大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、EPO組和HBSP組，每組10只。除對照組外，其余各組大鼠均腹腔注射表柔比星2.5 mg/kg，每周1次，連續(xù)6周復制心肌損傷模型[6]。EPO組和HBSP組大鼠分別腹腔注射rhEPO 5 000 u/kg或HBSP 60 μg/kg，每周3次，給藥時間分別為表柔比星給藥前1天、給藥后第1天以及給藥后第3天，連續(xù)6周;對照組和模型組大鼠均以等量生理鹽水腹腔注射6周。rhEPO和HBSP的給藥劑量依據(jù)文獻[7-8]以及預(yù)實驗結(jié)果確定。

2.2 一般情況

觀察記錄各組大鼠存活情況、體質(zhì)量變化、飲水量、毛色及活動情況，于第11周處死大鼠。

2.3 超聲心動圖檢測心功能

在大鼠處死前，腹腔注射水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，仰臥位固定于固定臺上，使用動物剃毛器剔除大鼠胸毛，充分暴露胸部。采用VividE 9型彩色多普勒超聲診斷儀，高頻探頭（12 MHz），設(shè)置深度2 cm，取大鼠胸骨旁左室短軸切面測量左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、射血分數(shù)（EF）、縮短分數(shù)（FS）及心輸出量（CO）。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中cTnI、NT-proBNP含量

在大鼠處死前，內(nèi)眥靜脈采血2 mL，靜置30 min，? 3 000 r/min（離心半徑為3 cm）離心5 min，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定各組大鼠血清中cTnI、NT-proBNP含量，具體檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）檢測心肌組織中PI3K和Akt mRNA表達

大鼠處死后，分離心肌組織，稱取60 mg左右的心肌組織加入1 mL Trizol，嚴格按照總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取心肌總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。以GAPDH為內(nèi)參，分別對 PI3K和Akt 基因進行擴增。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72℃ 15 s，35 個循環(huán);72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)Image Lab進行條帶圖像采集，使用Image J軟件分析條帶吸光度。引物序列與產(chǎn)物長度見表1。

2.6 Western blot法檢測心肌組織中p-PI3K和p-Akt蛋白表達

稱取60 mg左右大鼠心肌組織，充分剪碎研磨，加入100 μL的細胞裂解液，以12 000 r/min（離心半徑為8 cm）離心20 min，取上清液即為蛋白樣本。按5×上樣緩沖液的比例加入蛋白樣品及緩沖液充分混勻，99 ℃加熱變性10 min，再以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，滴加抗磷酸化p-PI3K單克隆抗體和p-Akt單克隆抗體（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜，再滴加辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（稀釋比例為1 ∶ 20 000），常溫孵育1 h，經(jīng)ECL發(fā)光試劑曝光后觀察結(jié)果。采用Image J軟件分析條帶的光密度值，以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參的光密度比值表示相應(yīng)蛋白的表達水平。

2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料采用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般情況

與對照組比較，模型組大鼠飲水和鼠糧攝入量減少，并且出現(xiàn)精神差、活動減少、毛發(fā)臟亂、脫毛、消瘦等表現(xiàn)，部分大鼠后期處于瀕死狀態(tài)，于實驗第9周死亡2只，解剖后發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)胸腔、腹腔積液，心臟肥大，肝腎暗紅腫脹。EPO組和HBSP組大鼠一般情況較模型組好轉(zhuǎn)，其中EPO組大鼠于實驗第10周死亡1只，其解剖后臟器情況較模型組嚴重程度減輕;HBSP組大鼠未出現(xiàn)死亡情況。比較各組大鼠解剖前體質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，EPO組和HBSP組大鼠體質(zhì)量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;EPO組與HBSP組大鼠間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠解剖前的體質(zhì)量結(jié)果見表2。

3.2 大鼠的心功能指標變化

與對照組比較，模型組大鼠的LVIDd顯著延長，EF、FS及CO顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，EPO組和HBSP組大鼠的LVIDd顯著縮短，EF、FS及CO顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。EPO組與HBSP組大鼠間心功能指標比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠的心功能指標結(jié)果見表3。

3.3 大鼠血清中cTnI、NT-proBNP含量變化

與對照組比較，模型組大鼠血清中cTnI和NT-proBNP含量均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，EPO和HBSP組大鼠血清中cTnI和NT-proBNP含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與EPO組比較，HBSP組大鼠血清中cTnI和NT-proBNP含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組大鼠血清中cTnI、NT-proBNP含量測定結(jié)果見表4。

3.4 大鼠心肌組織中PI3K、Akt mRNA表達變化

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中PI3K及Akt mRNA表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，EPO組和HBSP組大鼠心肌組織中PI3K、Akt mRNA表達水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。EPO組與HBSP組大鼠間PI3K、Akt mRNA表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠心肌組織中PI3K、Akt mRNA表達的電泳圖見圖1，表達水平測定結(jié)果見圖2。

3.5 大鼠心肌組織中p-PI3K、p-Akt蛋白表達變化

與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，EPO組和HBSP組大鼠心肌組織中p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。EPO組與HBSP組大鼠之間的p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠心肌組織中p-PI3K、p-Akt蛋白表達的電泳圖見圖3，表達水平測定結(jié)果見圖4。

4 討論

EPO是一種主要由成人腎臟產(chǎn)生的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，臨床上主要用于治療各種原因引起的貧血。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)EPO對心、腎、肝、腦等具有保護作用[3，9]。EPO的組織保護作用是通過與由EPO受體（EPOR）和β共同受體（βCR）亞基組成的異二聚體受體復合物結(jié)合來實現(xiàn)的[10]。有研究表明，對于表柔比星所致的心肌損傷，EPO干預(yù)后可降低心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA結(jié)合因子4（GATA-4）和主要組織相容性復合體（MHC）、肌鈣蛋白Ⅰ和結(jié)合蛋白的表達水平，激活組蛋白去乙酰化酶（SIRT1）以增強線粒體功能，保護心臟免受蒽環(huán)類化療藥物誘導的心肌細胞萎縮和變性、心肌纖維化、炎性細胞浸潤，從而降低心肌損傷，改善心功能[11-12]。然而，EPO的組織保護作用需要高劑量來實現(xiàn)，而這種高劑量會導致紅細胞比容升高、血管內(nèi)血栓形成增加、血壓升高等一系列不良反應(yīng)。更重要的是，EPO作為一種增殖劑，可刺激現(xiàn)有腫瘤的生長，甚至導致新發(fā)腫瘤的發(fā)生[4，13]。

2008年，Brines M等[14]首次合成了一種EPO的衍生物HBSP，HBSP對骨髓造血系統(tǒng)無明顯影響，無促紅細胞生成活性，避免了紅細胞增多、血栓形成增加、血壓升高等不良反應(yīng)的發(fā)生，但具有與EPO相同的藥動學特性和相當?shù)慕M織保護作用。近年來，有研究通過建立心肌梗死、糖尿病心肌病及心肌缺血再灌注損傷模型證實了HBSP具有抗心肌細胞凋亡、縮小心肌梗死面積、減少氧化應(yīng)激等作用，且治療效果與EPO相當[15-16]，但至今尚無研究報道HBSP在蒽環(huán)類化療藥物引起心肌損傷中的影響。本研究通過建立表柔比星致心肌損傷大鼠模型，心臟超聲心動圖顯示，模型組大鼠LVIDd顯著延長，EF、FS、CO顯著降低，提示應(yīng)用表柔比星后大鼠心功能下降，心肌損傷模型復制成功。給予EPO及HBSP后，LVIDd顯著縮短，EF、FS、CO顯著增加，表明EPO及HBSP具有明顯改善心功能的作用。cTnI是反映心肌損傷程度高敏感、高特異的“金標準”，而NT-proBNP具有良好的敏感性及特異性，在臨床上被廣泛應(yīng)用于心衰的診斷和預(yù)后評估[17]。模型組大鼠血清中cTnI和NT-proBNP含量顯著增加，提示應(yīng)用表柔比星后大鼠存在明顯的持續(xù)性心肌損傷。給予EPO及HBSP干預(yù)后，cTnI和NT-proBNP含量顯著降低，表明EPO及HBSP可減少表柔比星所致的心肌損傷，對心肌具有保護作用。

PI3K/Akt信號通路是參與細胞增殖、存活、分化和凋亡的重要途徑之一[18]。近年來研究表明，EPO及其衍生物可通過增加PI3K/Akt信號傳導以抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，保護心肌免受心肌損傷并減少心肌細胞凋亡[16]。本研究應(yīng)用EPO及HBSP干預(yù)表柔比星所致心肌損傷模型大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心肌組織中PI3K、Akt mRNA表達水平及p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平顯著低于對照組，而EPO及HBSP的干預(yù)能顯著上調(diào)心肌組織中PI3K、Akt mRNA及p-PI3K、p-Akt蛋白的表達，表明表柔比星可能是通過抑制PI3K及Akt的磷酸化水平從而引起心肌損傷，而EPO和HBSP可上調(diào)被表柔比星抑制的PI3K及Akt的磷酸化水平，這可能是EPO和HBSP阻斷心肌細胞凋亡及改善心功能的一個重要環(huán)節(jié)。筆者下一步研究將使用PI3K/Akt特異性抑制劑預(yù)處理，以深入明確PI3K/Akt信號通路在HBSP減輕大鼠表柔比星所致心肌損傷的保護作用中的具體作用機制。

綜上所述，EPO衍生物HBSP可改善表柔比星所致心肌損傷模型大鼠的心功能、減輕心肌損傷，其作用機制可能是通過PI3K/Akt信號通路來實現(xiàn)的，然而是否還通過其他機制發(fā)揮心肌保護作用仍需進一步探究。本研究為HBSP應(yīng)用于臨床提供了可靠的實驗依據(jù)，同時為HBSP治療化療藥物導致的心肌損傷提供了可能的新策略。

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（收稿日期：2019-06-26 修回日期：2019-08-12）

（編輯：鄒麗娟）