楊宏發(fā) 歐奇林 徐健強 曾高峰

[摘要]目的：研究Wnt替代蛋白（Wnt-S）對氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）凋亡的影響及其可能機制。方法：在HEK293F細胞中瞬時轉染pcDNA3.1（+）-Wnt-S質粒，表達純化Wnt-S蛋白;Topflash，qPCR以及Western B10±實驗確定最佳的Wnt-S激活Wnt信號通路濃度;MTT實驗檢測HUVEC存活率以及最佳的ox-LDL處理濃度;Hoechst染色檢測細胞凋亡，Western B10±分析Cleaved Caspase-3蛋白的表達情況。結果：實驗成功表達和純化Wnt-S蛋白;Wnt-S蛋白的最佳激活濃度是100ng/mL;ox-LDL最佳處理濃度是60mg/L;Wnt-S蛋白提高HUVEC的存活率，可通過減少Cleaved Caspase-3而有效拮抗ox-LDL誘導的HUVEC凋亡。結論：Wnt-S蛋白可通過激活Wnt細胞通路拮抗ox-LDL誘導的血管內皮細胞凋亡。

[關鍵詞]Wnt-替代蛋白，Wnt信號通路，氧化型低密度脂蛋白，細胞凋亡，動脈粥樣硬化

[中圖分類號]R363[文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2019）22-0001-03

動脈粥樣硬化是現今最常見的心血管疾病之一，其患病率、發(fā)病率及死亡率在我國持續(xù)增長，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制與內皮細胞損傷密切相關，其早期病理特征為血管內皮細胞功能的紊亂，由此引發(fā)血管結構和形態(tài)發(fā)生明顯改變。內皮細胞功能的損傷被認為是動脈粥樣硬化的關鍵環(huán)節(jié)，而其凋亡貫穿動脈粥樣硬化始末。氧化型低密度脂蛋白（oxidized 10w density lipoprotein，ox-LDu是動脈粥樣硬化中誘導內皮細胞凋亡的最常見因素之一，被認為是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素。

Wnt是一類分泌性糖蛋白，通過與其受體FZD和LRP5/6結合，誘導依賴于β-catenin的信號通路激活，進而調節(jié)多個生物過程。有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在血管發(fā)育，特別是維持內皮細胞穩(wěn)態(tài)上起著關鍵作用。天然的Wnt蛋白由于側鏈存在棕櫚油酸酯修飾，水溶性差，難以表達純化，極大地限制其生物和醫(yī)學應用。根據Wnt信號通路激活的特點，構造出一種新型Wnt替代蛋白（Wn±surrogate，Wnt-S），由FZD受體的中和抗體Vantictumab的單鏈可變區(qū)（scFv，single-chain variable fragment）和LRP5/6結合蛋白DKKl的C端區(qū)域通過一個鉸鏈區(qū)連接而成，形成一個新的融合蛋白scFv-DKKlc（圖1）。這種人工合成的Wnt-S蛋白能模擬天然的Wnt蛋白，激活下游的Wnt/β-catenin信號通路，且易溶于水、容易表達純化，在細胞和動物實驗都顯示出很好的生物功能。

本研究擬以人臍靜脈內皮細胞（human umbilical veinendothelial celIs，HUVEC）為研究對象，以ox-LDL誘導內皮細胞功能紊亂為模型，探討Wnt-S蛋白能否通過激活Wnt/β-catenin信號通路對ox-LDL誘導的HUVEC凋亡的影響及其可能的分子機制，為Wnt-S蛋白治療動脈粥樣硬化的臨床應用提供理論依據和實驗基礎。

1材料和方法

1.1主要材料 pcDNA3.1（+）-Wnt-S，Luciferase和Rellina質粒來自斯坦福大學。PEI（Polysciences），N±SepharoseTM6Fas±F10w（GE Heahhcare），BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisher），ECL發(fā)光液（Millipore），Dual-Luciferase ReporterAssay System，His-Tag（D3110）XPRabbi±m(xù)Ab和Anti-rabbitlgG，HRP-linked Antibody（中杉金橋）。DMEM高糖培養(yǎng)基和雙抗（HyC10neTM），澳洲胎牛血清，FreestyleTM 293ExpressionMedium（Invitrogen）。TRIzol Reagent（Life±echno10gies），Direct-z01RNA Miniprep（ZYMO RESEARCH），反轉錄試劑盒和SYBRqPCR Mix（諾唯贊）。

1.2HEK293F細胞轉染 轉染前對HEK293F細胞行計數，用40mLPBS稀釋質粒（800ug），混勻記為A液，用40mLPBS稀釋PEI（1600ul），混勻記為B液（質粒：PEI=1：2，W/V），室溫靜置5min。將B液緩慢加入到A液中，用渦旋振蕩器邊加邊振蕩，室溫靜置15min。將DNA-PEI混合液緩慢加入到720mL Freestyle 293Expression培養(yǎng)基中，輕輕混勻，使細胞密度在約1x 10 cells/mL，置于37℃，5%CO，125r/min細胞培養(yǎng)箱的水平搖床中培養(yǎng)。每天取少量培養(yǎng)基，檢測細胞活度，待細胞活度下降至70%左右時，停止培養(yǎng)，1000r/min離心收集上清，置于冰箱待用。

1.3Wnt-S蛋白表達純化 組裝好恒流泵，在純化柱中加人0.5mL N±SepharoseTM 6Fas±F10w，開啟恒流泵，用平衡液平衡純化柱20min。將進液管插入含Wnt-S蛋白的上清底層，出液管插入Wnt-S蛋白的上清上方，液體勻速流過柱子，4℃環(huán)境下，純化48h。用20mmol/mL，咪唑洗滌柱子后，再用500mmol/mL洗脫柱子，收集洗脫液，然后用10kDa離心過濾器進行超濾，4℃，8000r/min，15min條件下離心，濃縮后的液體即為Wnt-S蛋白溶液。

1.4±op-Flash實驗 用于檢測Wnt信號通路總體的激活情況。收集處理后的細胞，裂解液常溫裂解15分鐘后，取出裂解后的細胞懸液放人不透光的96孔板里。96孔板放人儀器，選取promega的雙熒光素實驗程序進行加樣和讀數（參照promega試劑盒說明書）。

1.5實時熒光定量PCR 用于檢測Wnt信號通路下游基因Axin2的表達。收集處理后的細胞，Trizol裂解，RNA提取試劑盒提取總RNA，Nano Drop測定RNA的濃度，逆轉錄得到cDNA，然后進行qPCR（參照Takara試劑盒說明書）。

1.6Western b10±檢測 蛋白BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品的濃度，計算上樣量。取一定量蛋白與5x蛋白上樣緩沖液混勻，置于100℃金屬浴中處理5min，配制10%分離膠和5%濃縮膠，進行電泳。電泳條件：80V，30min，120V至溴酚藍進入濃縮膠底部。轉膜條件：130mA，90-120min。5%BSA于TBST封閉2h，一抗4℃過夜孵育。TBST洗膜3次，5min/次，孵二抗，常溫1h，TBST洗膜3次，5min/次，顯影。

1.7HUVEC細胞培養(yǎng)及分組 HUVEC生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，細胞貼壁并長至70%～80%時，用0.05%胰蛋白酶消化傳代。HUVEC生長至傳代融合度后，分別用lng/mL，3ng/mL，10ng/mL，30ng/mL，100ng/mLWnt-S蛋白刺激HUVEC24 h，以確定最佳的Wnt-S蛋白激活Wnt信號通路濃度。分別用20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L以及100mg/L的ox-LDL刺激HUVEC 24 h，以確定最佳ox-LDL處理濃度。Wnt-S蛋白抗凋亡實驗實驗分為空白對照組（Control）、OX-LDL組、ox-LDL+Wnt-S蛋白組。

1.8ox-LDL制備及鑒定 利用硫酸銅（CuSO4）修飾低密度脂蛋白制備ox-LDL，采用硫代巴比妥酸法鑒定。

1.9MTT法檢測細胞存活率HUVEC細胞以5x 10/mL的密度接種于96孔板，每孔200ul。不同濃度的ox-LDL處理20小時后，每孔加入MTT（5mg/mL）20gl，37℃CO孵箱繼續(xù)孵育4小時。采用翻板法將96孔板中培養(yǎng)基棄去，并注意要吸凈板底殘留培養(yǎng)基，每孔中加入溶解液DMSO 150ul，37℃振蕩15min使結晶充分溶解，在酶標儀上以波長570nm檢測每孔的OD值，每組5個復孔，實驗重復3次。

1.10Hoeches±33342熒光染色法檢測凋亡 HUVEC細胞以5x 10/mL的密度接種于96孔板，除空白對照組外，實驗組處理24小時后，棄培養(yǎng)基，每孔加入4%多聚甲醛500gl，室溫固定30分鐘。PBS漂洗兩遍后加入Hoechs±33342，使細胞中終濃度為10ug/mL，37度孵育30分鐘后熒光顯微鏡下觀察，最大激發(fā)波長361nm，最大發(fā)射波長460nm。正常細胞呈均勻的藍色熒光，而凋亡細胞可見細胞核呈濃縮的半月形、分葉狀或碎塊狀熒光。隨機選取3個視野統(tǒng)計陽性細胞數，求平均值，每組2個復孔，重復5次，計算細胞凋亡發(fā)生率。

2結果

2.1Wnt-S蛋白表達載體的鑒定以及wnt-s蛋白的純化和檢測核酸電泳鑒定的結果顯示Wnt-S i.pcDNA3.1（+）質粒成功構建。Wnt-S蛋白的細胞轉染和表達Western Not結果表明在轉染后的細胞上清中檢測到了Wnt-S蛋白，其表達純化的最佳條件為轉染后5d收集上清，50mmol/mL咪唑洗滌柱子后，500mmol/mL咪唑洗脫（見圖2）。

2.2Wnt-S蛋白對HUVEC細胞中Wnt/B-catenln信號通路的激活作用

首先，TOP flash結果顯示Wnt信號通路的活性隨著Wnt-S蛋白濃度的增加而顯著升高，且存在劑量依賴性。其次，實時熒光定量PCR的結果顯示加Wnt-S蛋白和Wnt3a蛋白處理后，HUVEC細胞中Axin2表達顯著性上調，核內β-catenin蛋白明顯增加，Wnt/β-eatenin信號通路被顯著激活（見圖3）。

2.3Wnt-S蛋白可拮抗ox-LDL引起HUVEC細胞存活率的降低將空白對照組細胞存活率設置為100%，選取20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L和100mg/L五個濃度的ox-LDL與HUVEC細胞共培養(yǎng)。MTT實驗表明，與空白對照組相比，60mg/L的ox-LDL作用HUVEC 24 h后，細胞存活率降低至36.5%，選擇此濃度進行后續(xù)實驗。Wnt-S處理能顯著拮抗ox-LDL所致HUVEC細胞存活率的降低（見圖4）。

2.4 Wnt-S的對凋亡的抑制作用 選取60mg/L ox-LDL進行造模，100ng/mL Wnt-S蛋白做給藥處理，ox-LDL組Hoechst染色結果可見更多的細胞核呈亮藍色熒光，細胞核具有凋亡形態(tài)特點，而ox-LDL+Wnt-S呈亮藍色熒光細胞核明顯減少。進一步的機制研究發(fā)現，與空白對照組相比，OXmLDL組Cleaved Caspase-3表達顯著上調（P<0.01）;而用Wnt-S處理后，Cleaved Caspase-3表達水平較ox-LDL組顯著下調（P<0.01），表明ox-LDL能促進HUVEC中Caspase-3的活化，而Wnt-S蛋白可抑制ox-LDL誘導的HUVEC中Caspase-3的激活（見圖5）。

3討論

內皮功能障礙與凋亡是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關鍵步驟，因此有效保護內皮細胞是改善動脈粥樣硬化重要措施。本研究以OXLDL誘導HUVEC凋亡，在此基礎上研究Wnt替代蛋白對ox-LDL誘導HUVEC凋亡的作用。結果顯示，ox-LDL可顯著降低HUVEC存活率，并誘導Caspase-3的活化和凋亡發(fā)生;而經Wnt替代蛋白處理后細胞凋亡率顯著降低，且Cleaved Caspase-3表達也顯著降低。提示Wnt替代蛋白可拮抗ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，具有一定保護血管內皮的活性。

目前已經發(fā)現了19種不同的哺乳類Wnt蛋白，這些蛋白與10種FZD受體雜亂的結合，形成了不同的生物學功能。Wnt翻譯后通過蛋白質棕櫚化作用形成了棕櫚油酸酯修飾，這個修飾對于Wnt蛋白的分泌和其與FZD相互作用的關鍵位點形成至關重要。然而，棕櫚油酸酯化使天然Wnt蛋白變得非常疏水，這嚴重阻礙了Wnt重組蛋白的制備和應用。本文中，我們發(fā)現人工合成的Wnt替代蛋白具有與天然Wnt3a蛋白類似的生物學功能，都能激活HUVEC細胞中Wnt/β-catenin信號通路。Wnt-S蛋白的優(yōu)勢在于水溶性高、容易表達純化和大規(guī)模制備，可能具有更廣闊的生物和醫(yī)學應用前景。

綜上所述，本研究發(fā)現Wnt-S蛋白可通過激活Wnt細胞通路而減少Caspase-3活化，從而拮抗ox-LDL誘導的血管內皮細胞凋亡，為Wnt-S蛋白在臨床上應用于動脈粥樣硬化的靶向治療提供了理論依據。