王晴 李紅俠 李梅梅

摘 要：為提高紫蘇利用率，探究紫蘇花青素最佳提取條件并對(duì)其抗癌活性進(jìn)行研究.以新鮮紫蘇葉為試驗(yàn)材料，采用超聲波輔助提取法，研究在不同提取溫度、提取時(shí)間、溶劑濃度和溶液酸堿度條件下對(duì)原花青素提取效果的影響，并用噻唑藍(lán)法測(cè)定提取的花青素對(duì)腫瘤細(xì)胞（A549）的抗增殖活性.結(jié)果表明，當(dāng)提取溫度為60℃、時(shí)間為90min、溶劑濃度為70%以及pH為8時(shí)，原花青素提取的效果最好;原花青素濃度為100μg/mL時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞的抗增值性較好，IC50值為28.67μg/mL.

關(guān)鍵詞：紫蘇;原花青素;A549細(xì)胞;抗增殖活性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q946 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ?文章編號(hào)：1673-260X（2019）12-0028-03

0 引言

由于人們對(duì)飲食健康的重視，天然色素的需求日益增多，且其對(duì)癌癥、眼疾、心血管疾病等具有較好的預(yù)防效果[1]，因此開(kāi)發(fā)、研究和利用天然食用色素成為研究熱點(diǎn).紫蘇屬唇形科，是一年生草本植物，新鮮紫蘇葉片中，花色素苷類(lèi)色素含量大，具有較好的開(kāi)發(fā)前景.花色素苷是一種類(lèi)黃酮類(lèi)天然色素，不僅具有較強(qiáng)的抗氧化作用，還具有自由基清除活性[2].花色苷類(lèi)物質(zhì)在抗消炎作用、關(guān)節(jié)炎、預(yù)防心腦血管疾病、神經(jīng)細(xì)胞衰老、癌癥、糖尿病等起著重要作用[3].惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命和健康的疾病，其發(fā)病率和死亡率僅次于心腦血管疾病，位列第二[4].近年來(lái)癌癥的治療，常采用手術(shù)、化療等措施，其中化療在綜合治療領(lǐng)域有著重要地位，但在臨床應(yīng)用時(shí)化療仍存在療效、副作用以及腫瘤細(xì)胞耐藥等方面問(wèn)題.原花青素可預(yù)防細(xì)胞突變、癌細(xì)胞生成，控制腫瘤生長(zhǎng)快慢，減小腫瘤體積[5，6].以紫蘇葉為材料，探究其原花青素最佳提取工藝，并進(jìn)行抗癌活性試驗(yàn)，為色素在抗癌方面的研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紫蘇葉（宿州科學(xué)院提供）;A549細(xì)胞株（購(gòu)于上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）;甲醇、鹽酸、醋酸鉛、乙酸（均購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)）.

1.2 主要儀器

掃描酶標(biāo)儀（Sunrise，奧地利TECAN）;CO2培養(yǎng)箱（Heracel，美國(guó)Kendro）;倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS CX-40，日本OLYMPUS）等.

1.3 試驗(yàn)方法

工藝流程：紫蘇葉→烘干→粉碎→過(guò)篩→提取→濃縮→測(cè)定

1.3.1 原料預(yù)處理

將紫蘇葉用水洗凈，瀝干，置于干燥箱烘干至恒重（35-40℃），將烘干的紫蘇葉用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)50目篩，待用.

1.3.2 紫蘇原花青素含量測(cè)定

稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，用調(diào)節(jié)pH后的去離子水定容到50mL，分別配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度系列.以純凈水為參比液進(jìn)行紫外檢測(cè)，原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液在765nm處有最大吸光度.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度與濃度之間的關(guān)系，將所得的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)回歸處理后，繪制出紫蘇原花青素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.2367x+0.0688.R2=0.9986.

1.3.3 單因素試驗(yàn)

稱取備用的紫蘇葉粉末2.0g于容量瓶中，提取劑用60%、70%、80%的pH為4、6、8的甲醇，在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃五個(gè)不同溫度下超聲提取70min、80min、90min，提取液經(jīng)過(guò)2000r/min離心10min過(guò)濾后吸取0.5mL，再用調(diào)節(jié)pH后的純凈水定容至50mL容量瓶中，在最大波長(zhǎng)765nm下測(cè)得吸光度ΔA的值，根據(jù)吸光度ΔA的值，利用回歸方程解出濃度，再計(jì)算出提取液中原花青素含量.

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，得出較優(yōu)水平，根據(jù)四因素三水平正交表[7]進(jìn)行正交試驗(yàn)，以提取液原花青素濃度為指標(biāo)，探究最佳提取工藝.

1.3.5 原花青素抗腫瘤細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞，吹懸浮混勻并稀釋至每孔細(xì)胞數(shù)約5×103個(gè)，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔100μL細(xì)胞懸液.孔板外圍邊緣用PBS液體等體積填充.細(xì)胞貼壁后加入配置好的紫蘇花青素溶液，4個(gè)濃度，3個(gè)重復(fù).每孔100μL.24h后，每孔加20μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h.用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，根據(jù)寇氏公式，計(jì)算IC50值[8].

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)原花青素提取效果的影響

溫度越高，細(xì)胞膜的通透性越高，會(huì)加速對(duì)細(xì)胞的破壞，從而使得細(xì)胞內(nèi)溶物相比較容易提取，但溫度過(guò)高，原花青素含量降低，因?yàn)楦邷匾资乖ㄇ嗨胤纸?如圖1所示，提取液原花青素含量隨溫度升高而增加，60℃時(shí)達(dá)到峰值;超過(guò)60℃，原花青素含量呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明原花青素具有熱不穩(wěn)定性，最佳提取溫度為60℃.

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)原花青素提取效果的影響

由圖2可知，90min前原花青素含量隨提取時(shí)間增加呈上升趨勢(shì)，當(dāng)時(shí)間達(dá)到90min時(shí)原花青素含量達(dá)到最大，隨后開(kāi)始下降.提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)原花青素的穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致原花青素容易分解;提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)還會(huì)導(dǎo)致原花青素含量的損失，因?yàn)樽咸K中含有多酚氧化酶，而多酚氧化酶能夠破壞紫蘇原花青素.但提取時(shí)間過(guò)短則導(dǎo)致提取不充分，因此最佳提取時(shí)間為90min.

2.1.3 甲醇濃度對(duì)原花青素提取效果的影響

隨著甲醇濃度逐漸升高，提取液原花青素含量上升，甲醇濃度為70%時(shí)達(dá)到最高.因?yàn)樽咸K中還含有很多的糖和其他水溶性色素等，低濃度甲醇提取時(shí)糖和水溶性色素的溶解性較好，而這些物質(zhì)會(huì)影響原花青素的溶出，高濃度甲醇提取時(shí)，原花青素提取效果較好，因?yàn)闃O性較強(qiáng)的糖和水溶性色素等此時(shí)溶出較少.由圖3可知，最佳甲醇濃度為70%.

2.1.4 pH對(duì)原花青素提取效果的影響

由圖4可知，當(dāng)pH為6時(shí)，紫蘇原花青素的含量最高，穩(wěn)定性最好，當(dāng)pH<6.0時(shí)，原花青素的含量是隨著pH上升而上升，當(dāng)pH>6.0時(shí)，原花青素含量隨pH上升而減少的，故最佳提取溶劑pH為6.

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，由K值數(shù)據(jù)可以得出，最優(yōu)提取條件是60℃下用pH為8的70%的甲醇提取90min.

2.3 原花青素抗癌活性

由表2可得，當(dāng)原花青素濃度為100μg/mL時(shí)對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用最好.

3 結(jié)論與討論

提取溫度、提取時(shí)間、甲醇濃度、pH值均會(huì)影響紫蘇原花青素的提取效果，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)得到最優(yōu)條件為：提取溫度為60℃、提取時(shí)間為80min、甲醇濃度為70%、pH值為8，經(jīng)驗(yàn)證此時(shí)提取液原花青素含量為5.36mg/mL.紫蘇原花青素對(duì)A549癌細(xì)胞的抑制性較強(qiáng)，且隨花青素濃度的增大，對(duì)癌細(xì)胞的抑制性增強(qiáng)，與藍(lán)莓花青素呈現(xiàn)劑量依賴性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[9]結(jié)論一致，也與葡萄籽原花青素在抗癌作用上相同[10].紫蘇原花青素既不影響機(jī)體正常細(xì)胞又對(duì)A549癌細(xì)胞具有極強(qiáng)的細(xì)胞抑制性，提示其具有較好的抗癌活性，對(duì)其在抗癌藥物的應(yīng)用提供理論依據(jù).

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