梁玲 趙燕玉 黃建忠

摘 要：為選育能夠合成蟲草素又能高效積累油脂的新型蛹蟲草菌株，將高產(chǎn)蟲草素的蛹蟲草FY1421及高效合成油脂特別是不飽和脂肪酸的深黃被孢霉菌株Z0108進行原生質體融合。對親本的原生質體的形成與再生、雙親滅活及融合的條件進行了篩選與優(yōu)化，并結合96微孔板初篩和搖瓶發(fā)酵復篩，獲取融合子。結果表明：蛹蟲草菌株FY1421采用1.5%溶壁酶+0.5%蝸牛酶+0.5%纖維素酶的混合酶液處理120 min，原生質體數(shù)量最多，再生率最高;深黃被孢霉菌株Z0108采用1%溶壁酶+1%蝸牛酶+1%纖維素酶的混合酶液處理4 h，原生質體數(shù)量最多，再生率最高;FY1421原生質體采用60℃水浴熱滅活10min，Z0108原生質體采用紫外線滅活30s，均可達到100%的滅活率;滅活雙親在35℃下，使用40%的PEG促融10 min，融合效率最高。從650株融合子篩選得到融合菌株RCS262，其搖瓶發(fā)酵蟲草素含量達5926μg·g-1，油脂含量達到37.5%。采用原生質體融合技術進行蛹蟲草與深黃被孢霉的種間雜交，成功獲得融合菌株既能高產(chǎn)蟲草素，也具有高效積累油脂的能力。

關鍵詞：蛹蟲草;深黃被孢霉;雜交;原生質體融合

中圖分類號：S567.39 ? 文獻標志碼：A ? 文章編號：0253-2301（2019）11-001

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.11.001

Selection of a New Type of Lipidproducing Cordyceps Militaris by Interspecific Hybridization

LIANG Ling， ZHAO Yanyu， HUANG Jianzhong

Abstract： In order to select a new strain of Cordyceps militaris that could synthesize cordycepin and accumulate oil efficiently， the protoplast fusion was performed on the strain FY1421 of Cordyceps militaris with high yield of cordycepin and the strain Z0108 of mortierella isabellina with high efficiency in oil synthesis， especially in unsaturated fatty acid synthesis. The conditions of protoplast formation and regeneration， inactivation and fusion of parents were screened and optimized. And the fusions were obtained by combining the initial screening of 96 microwell plate with the shaking flask fermentation. The results showed that the strain FY1421 of Cordyceps militaris was treated with a mixture of 1.5% lysozyme+0.5% snail enzyme+0.5% cellulase for 120 min， with the largest number of protoplasts and the highest regeneration rate. The strain Z0108 of mortierella isabellina was treated with a mixture of 1% lymolytic enzyme+1% snail enzyme+1% cellulase for 4 h， with the largest number of protoplasts and the highest regeneration rate. The protoplast of FY1421 was inactivated by 60℃ water bath for 10 min， and the protoplast of Z0108 was inactivated by ultraviolet ray for 30 s， both of which could achieve 100% inactivation rate. And the inactivated parents were fused with 40% PEG for 10 min at 35℃which could achieve the highest fusion efficiency. The fusion strain RCS262 was screened from 650 strains of fusions， and the content of cordycepin with the shaking flask fermentation reached 5926 μg·g-1， while the oil content reached 37.5%. The protoplast fusion technique was used to conduct the interspecific hybridization of Cordyceps militaris and Mortierella isabellina， and the fusion strain obtained successfully could not only produce high yield of cordycepin but also accumulate oil efficiently.

Key words： Cordyceps militaris; Mortierella isabellina; Hybridization; Protoplasts fusion

蛹蟲草Cordyceps militaris又稱為北蟲草、北冬蟲夏草、蛹草，分類學上隸屬于真菌門Eumycota，子囊菌亞門Ascomycotinia、子囊菌綱Ascomycctes、糞殼菌亞綱Sordariomycetes、肉座菌目Hypocreales、麥角菌科Clavicipitaceae、蟲草屬Cordyceps，是蟲草屬的模式菌，一種極具保健功能的名貴中藥[1]。據(jù)文獻報道，蛹蟲草富含多種生物活性成分，包括蟲草素、腺苷、蟲草多糖、蟲草酸、超氧化物歧化酶（SOD）、甾醇、糖醇、不飽和脂肪酸、多種氨基酸和維生素等，具有提高免疫力、調節(jié)內分泌、改善記憶力、延緩衰老、抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)靜、保護肝腎及呼吸系統(tǒng)等多種生理功能[1-3]。其活性成分中不飽和脂肪酸主要為γ亞麻酸及亞油酸，但是含量非常低，難以達到其應有的生理功效。

深黃被孢霉Mortierella isabellina用于微生物發(fā)酵，能夠生產(chǎn)γ亞麻酸等多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fattyacids， PUFAs），這些脂肪酸在保持細胞流動性、降低膽固醇、改善血液微循環(huán)等方面有重要作用[4]，其菌粉及提取物具有降血脂、降血糖的作用[5]。通過雜交技術使蛹蟲草菌株與深黃被孢霉優(yōu)勢互補，得到一種既具有蛹蟲草的生物活性功能，又兼具深黃被孢霉高產(chǎn)不飽和脂肪酸的新型菌株，實現(xiàn)蛹蟲草資源營養(yǎng)成分多優(yōu)并舉，是一個全新的課題，具有極高的現(xiàn)實意義與應用價值。

在不同的物種間，由于存在不親和性因子及細胞壁，種間雜交基本不可能。而將細胞去壁制備成原生質體后，便能夠跨過這個障礙，實現(xiàn)遠緣雜交，產(chǎn)生雜交后代。原生質體融合技術應用于種間雜交已有先例，劉寶等[6]利用原生質體融合技術將黃花煙草和枸杞進行雜交，得到了兼具雙親優(yōu)良性狀的雜種小苗。劉冰等[7]利用重寄生鏈霉菌與生防放線菌進行原生質體融合，得到了具有生防效果的放線菌。

本研究創(chuàng)新性地利用原生質體融合技術開展蛹蟲草菌株與深黃被孢霉的種間雜交，通過技術路線優(yōu)化（圖1），旨在獲取蛹蟲草本身腺苷類活性物質高含量的基礎上，促進油脂合成與積累，實現(xiàn)蛹蟲草資源生物活性物質的有效補充，達到一菌多效、生理活性功能物質多效疊加的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 出發(fā)菌種 蛹蟲草菌FY1421（Cordyceps militaris FY1421），由廈門元尊生物工程有限公司提供;深黃被孢霉Z0108（Mortierella isabellina Z0108），由教育部工業(yè)微生物工程研究中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）蛹蟲草斜面培養(yǎng)基及固體平板培養(yǎng)基PDA：馬鈴薯浸出粉20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂20 g·L-1， pH自然，121℃滅菌20 min。（2）深黃被孢霉斜面及固體平板培養(yǎng)基：葡萄糖70 g·L-1，尿素5 g·L-1，酵母膏2 g·L-1，檸檬酸鈉12 g·L-1，硫酸銨6 g·L-1，硫酸鎂 1 g·L-1，磷酸氫二鉀 1 g·L-1，維生素B6 10 mg，瓊脂20 g·L-1，pH自然，121℃滅菌20 min。（3）菌絲培養(yǎng)液：馬鈴薯浸出粉20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，蔗糖50 g·L-1，磷酸二氫鉀0.8 g·L-1，硫酸鎂0.3 g·L-1，pH 6.8～7.0，121℃滅菌20 min。（4）再生培養(yǎng)基：蔗糖205 g·L-1，馬鈴薯浸出粉20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，尿素 5 g·L-1，檸檬酸鈉12 g·L-1，pH自然，121℃滅菌20 min。（5）融合子種子培養(yǎng)基：蔗糖40 g·L-1，酵母粉8 g·L-1，磷酸二氫鉀0.5 g·L-1，硫酸鎂0.5 g·L-1，檸檬酸鈉1 g·L-1，檸檬酸1 g·L-1，微量元素母液10 mL，維生素B1 10 mg，維生素B6 10 mg，pH自然，121℃滅菌20 min;其中微量元素母液包括：七水合硫酸亞鐵280 mg，氯化鈣110 mg，五水硫酸銅25 mg，七水硫酸鋅29 mg，定容至1000 mL，4℃存儲，備用。（6）融合子發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40 g·L-1，蛋白胨15 g·L-1，酵母粉15 g·L-1，玉米粉35 g·L-1，硫酸銨5 g·L-1，磷酸二氫鉀 5 g·L-1，硫酸鎂3 g·L-1，微量元素母液10 mL，維生素B1 20 mg，維生素B2 10 mg，維生素B6 10 mg，pH調至6.8～7.0，121℃滅菌20 min。微量元素母液同融合子種子培養(yǎng)基。

1.1.3 主要藥品和試劑 （1）滲透壓穩(wěn)定劑：pH 6.0的0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液，0.6 mol·L-1氯化鈉，121℃滅菌20 min。（2）甘氨酸溶液：稱取20 g甘氨酸溶于100 mL水中，用0.22 μm的針頭式過濾器過濾除菌，-4℃保藏。（3）溶壁酶，購自于廣東微生物菌種保藏中心;蝸牛酶和纖維素酶均購自于生工生物工程（上海）有限公司。（4）PEG6000購自于國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器設備 高速冷凍離心機為貝克曼公司制造;UV2100型紫外可見分光光度計為尤尼柯（上海）儀器有限公司制造;梅特勒 pH計為瑞士梅特勒托利多集團制造;索氏抽提儀為上海洪紀儀器設備有限公司制造;高效液相色譜為日本島津公司制造。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛹蟲草菌株FY1421原生質體制備 將蛹蟲草菌株FY1421接種至固體斜面培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)7 d。取培養(yǎng)好的蛹蟲草FY1421新鮮斜面，加入5 mL的無菌水，將孢子洗脫下來，用脫脂棉過濾獲得孢子懸液，孢子濃度為5.0×107個·mL-1。取100 μL孢子懸液接種至50 mL菌絲培養(yǎng)液中，添加終濃度為0.5%的甘氨酸，置于恒溫搖床中26℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，離心收集菌絲體，用滲透壓穩(wěn)定劑重懸，洗滌離心1次，去除殘留的培養(yǎng)基，得到制備原生質體的出發(fā)菌絲體。取少量FY1421出發(fā)菌絲體進行適當稀釋后取100 μL涂布于固體PDA培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)至長出菌落，計算菌落數(shù)A。

在每一支離心管菌絲體中分別加入10 mL不同濃度配比的溶壁酶蝸牛酶纖維素酶混合酶液（濃度配比包括1%溶壁酶+1%蝸牛酶、1%溶壁酶+1%纖維素酶、1%蝸牛酶+1%纖維素酶，0.5%溶壁酶+0.5%蝸牛酶+0.5%纖維素酶、1%溶壁酶+1%蝸牛酶+1%纖維素酶、1.5%溶壁酶+1.5%蝸牛酶+1.5%纖維素酶、1.5%溶壁酶+1%蝸牛酶+1%纖維素酶、1.5%溶壁酶+0.5%蝸牛酶+0.5%纖維素酶），30℃水浴酶解，每隔5 min輕搖混勻，使原生質體脫落，每隔30 min鏡檢觀察原生質體形成情況。酶解時間設置為30、60、90、120、150、180 min，酶解結束后用脫脂棉過濾除去菌絲，3000r·min-1離心15 min，并用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌離心2次除酶，用適量的高滲溶液重懸得到蛹蟲草菌株FY1421的原生質體[8]。

1.2.2 深黃被孢霉原生質體制備 取培養(yǎng)好的Z0108新鮮斜面制備孢子懸液，孢子濃度為1.7×109個·mL-1。接種20 μL孢子懸液至50 mL菌絲培養(yǎng)液中，添加終濃度為1%的甘氨酸，28℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)16h，離心收集菌絲體，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌離心1次，得到制備原生質體的出發(fā)菌絲體。取少量Z0108出發(fā)菌絲體進行適當稀釋后取100μL涂布于固體PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)至長出菌落，計算菌落數(shù)A′。

在每一支離心管菌絲體中分別加入10 mL不同濃度配比的溶壁酶蝸牛酶纖維素酶混合酶液（濃度配比同1.2.1中蛹蟲草菌株FY1421原生質體制備），30℃水浴酶解，每隔5 min輕搖混勻，使原生質體脫落，每隔30 min鏡檢觀察原生質體形成情況。酶解時間設置為1、2、3、4、5、6 h，酶解結束后用脫脂棉過濾除去菌絲，3000r·min-1離心15 min，并用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌離心2次除酶，用適量的高滲溶液重懸得到深黃被孢霉菌株Z0108的原生質體[9-10]。

1.2.3 原生質體再生 將兩菌株的原生質體懸液用滲透壓穩(wěn)定劑梯度稀釋后取100 μL涂布于再生培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至長出菌落，計算FY1421菌落數(shù)B及Z0108菌落數(shù)B′。另外，將原生質體用無菌水梯度稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基平板，計算長出的FY1421菌落數(shù)C及Z0108菌落數(shù)C′。根據(jù)試驗結果結合后續(xù)試驗需求選擇合適的原生質體制備與再生條件。

1.2.4 原生質體滅活 蛹蟲草菌株FY1421原生質體的滅活條件為熱滅活。取多支5 mL 離心管中放入1 mL 原生質體懸液，于恒溫水浴鍋中分別進行50、55、60、65℃熱滅活處理，滅活時間分別為5、10、15、20 min，每梯度3次重復，并設置對照組。每隔5 min 輕輕振蕩離心管1次。滅活后涂布再生板培養(yǎng)，計算不同溫度和時間的致死率。

深黃被孢霉原生質體滅活方式為紫外線滅活。取1mL原生質體置于6cm平皿中，在功率為30W的紫外燈下，照射距離為20cm處開蓋，避免白光干擾條件下垂直照射15、20、25、30、35、40 s進行紫外滅活。涂布再生平板在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出單菌落，計算致死率。

1.2.5 原生質體融合與再生 采用最優(yōu)滅活條件滅活后的兩親株原生質體等體積混合，3000r·min-1離心15min，分別加入1mL 40%的PEG6000（含0.04 mol·L-1的CaCl2），輕柔混勻，置于30、33、35、37℃水浴中分別促融10、15、20min，加入滲透壓穩(wěn)定劑終止反應后離心，重懸后稀釋一定倍數(shù)后涂布再生平板，26℃培養(yǎng)7～9d至長出再生菌落，計算融合率。

1.2.6 融合子的檢出 平板長出的再生菌落，經(jīng)形態(tài)、顏色甄別后挑選類似融合子進行96微孔板初篩及搖瓶發(fā)酵復篩，發(fā)酵結束后檢測蟲草素及油脂含量，篩選出既能生產(chǎn)蟲草素和腺苷，且油脂含量高的融合菌。收集發(fā)酵菌絲采用HPLC測定蟲草素的含量[11]，采用索氏提取法[12]測定油脂含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

計算公式：菌株FY1421原生質體再生率=（B-C）/（A-C）×100%，菌株Z0108原生質體再生率=（B′-C′）/（A′-C′）×100%。融合率=再生菌落數(shù)/雙親原生質體總數(shù)×100%。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 進行統(tǒng)計分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草菌株FY1421原生質體制備最佳條件的選擇

2.1.1 酶系統(tǒng)的選擇 蛹蟲草菌株FY1421及深黃被孢霉Z0108皆為絲狀真菌，細胞壁的主要成分為幾丁質、葡聚糖層、纖維素等，因此選用了溶壁酶、蝸牛酶及纖維素酶的組合進行破壁。由表1可見，采用1.5%溶壁酶+0.5%蝸牛酶+0.5%纖維素酶的混合酶液處理蛹蟲草菌株FY1421時，原生質體的形成數(shù)量最多，達到3.22×107個·mL-1，此時的再生率也最高，為20.5%。因此選用1.5%溶壁酶+0.5%蝸牛酶+0.5%纖維素酶的混合酶液作為制備蛹蟲草菌株FY1421原生質體的最適酶液。

2.1.2 酶解時間的選擇 用最適酶液組合處理蛹蟲草菌株FY1421的菌絲體，隨著酶解時間的增加，通過顯微鏡觀察到越來越多的球狀原生質體從菌絲端脫落，最終在視野中全部變?yōu)榍蛐蔚脑|體。圖2結果顯示，蛹蟲草菌株FY1421隨著酶解時間的延長原生質體數(shù)量迅速增加，在酶解90min后增速變緩，酶解150min時原生質體達數(shù)最多，達到3.35×107個·mL-1，繼續(xù)延長酶解時間，原生質體數(shù)稍有減少，再生率在酶解120min時最高，達到21.8%，再延長酶解時間則再生率顯著下降，可能是由于時間過長部分原生質體酶解過度破裂。

2.2 深黃被孢霉菌株Z0108原生質體制備最佳條件的選擇

2.2.1 酶系統(tǒng)的選擇 由表2可見，采用1%溶壁酶+1%蝸牛酶+1%纖維素酶的混合酶液處理深黃被孢霉菌株Z0108時，原生質體生成數(shù)量最多，達到7.99×106個·mL-1，再生率也最高。選擇1%溶壁酶+1%蝸牛酶+1%纖維素酶的混合酶液作為制備深黃被孢霉菌株Z0108的最佳酶液。

2.2.2 酶解時間的選擇 深黃被孢霉菌株Z0108的原生質體數(shù)隨著酶解時間延長快速增加，在酶解4 h后原生質體數(shù)增加速度趨緩，由圖3可見，酶解6 h時，原生質體數(shù)達到最多。再生率在酶解之初隨著原生質體數(shù)量增加而不斷增加，在酶解4 h時達到最大，為17.3%，繼續(xù)延長酶解時間再生率顯著下降，可能原因是酶解時間太長時細胞膜受損，導致難以再生。因此選擇酶解4 h為最佳的酶解時間。

2.3 原生質體滅活條件確定

由表3可見，采用60℃以下溫度進行滅活蛹蟲草菌株FY1421原生質體時，時間延長至20 min也達不到100%的致死率，滅活溫度為60℃時，滅活10 min即可達到100%的致死率，因此選擇60℃滅活10 min為蛹蟲草菌株FY1421原生質體的滅活最佳條件。

如圖4所示，深黃被孢霉菌株Z0108原生質體對紫外線照射比較敏感，在距離30 W紫外燈20 cm處照射25 s時致死率達到了95%。為了后續(xù)融合子的檢出，需去除親株的干擾，選擇紫外線滅活30 s，深黃被孢霉Z0108原生質體的滅活率達100%。

2.4 融合條件的確定

采用40%的PEG6000（含0.04%的CaCl2）進行促融，由表4可見，融合溫度選擇35℃、時間為10 min時融合率最高。溫度偏低或偏高融合率都相對降低，融合時間太短時，可能有的原生質體還沒實現(xiàn)融合;而時間太長可能促融劑對細胞有毒害作用，造成融合率下降。

2.5 融合子檢出

蛹蟲草菌落為淺黃色，而深黃被孢霉菌落顏色為深灰色，菌落的顏色差異有助于識別融合子。在

融合子再生平板上挑選了顏色與親株有區(qū)別的菌株650株進行96孔板初篩，得到83株發(fā)酵產(chǎn)物中既含有蟲草素，又含有較高油脂產(chǎn)量的融合菌株。進行搖瓶發(fā)酵驗證，篩選得到12株蟲草素含量較高，且油脂含量提高幅度較大的融合菌，搖瓶發(fā)酵結果見圖5，其中1株編號為RCS262的融合菌，蟲草素含量為5926 μg·g-1，油脂含量達到37.5%，實現(xiàn)了高產(chǎn)蟲草素且富含油脂的目標。將融合菌連續(xù)傳代5次，每一代進行搖瓶發(fā)酵驗證蟲草素及油脂含量，產(chǎn)量差異在5%范圍內，基本保證了遺傳的穩(wěn)定性。

3 結論與討論

本研究以高產(chǎn)蟲草素的蛹蟲草菌株FY1421及高產(chǎn)油脂的深黃被孢霉Z0108為出發(fā)菌株，利用原生質體融合技術促進兩親株種間雜交。首先對兩親株原生質體制備的條件進行探索，對制備原生質體的關鍵因素優(yōu)化組合，找到了最佳的原生質體制備條件，即蛹蟲草菌株FY1421的原生質體制備條件為：采用1.5%溶壁酶+0.5%蝸牛酶+0.5%纖維素酶的混合酶液30℃水浴酶解120 min，可獲得最高的原生質體制備率及再生率;深黃被孢霉Z0108的原生質體制備條件為：采用1%溶壁酶+1%蝸牛酶+1%纖維素酶的混合酶液在30℃水浴酶解4 h，可獲得最高的原生質體制備率及再生率。雖然兩株出發(fā)菌株均為絲狀真菌，但由于菌株不同，細胞壁的成分存在一定差異，其最適的酶及酶解條件也不盡相同。

對兩個親株分別采取高溫和紫外方式滅活，采取不同的方式滅活可使細胞受損的機制不一致，以便在后期融合時兩親株能夠優(yōu)勢互補而修復，從而獲得融合子。本研究從眾多融合子中篩選的融合菌株RCS262獲得了雙親的高產(chǎn)性能，蟲草素產(chǎn)量達到5926 μg·g-1，油脂含量達到37.5%，這可能是雙親細胞核相互作用的結果，但距離原親株的產(chǎn)量還有一定差距，可能與細胞在融合過程中受到的損傷有關系。然而加熱及紫外照射也是一種誘變育種的方式，從理論上說有獲得更高產(chǎn)量的可能性，有待進一步試驗篩選。另外，融合子從菌絲形態(tài)與生長特性來說與親本之一的蛹蟲草菌株較為相似，而且擴增其ITS（Internal Transcribed Spacer）序列比對發(fā)現(xiàn)，其與親本之一的蛹蟲草菌株的相似性達到97.7%以上（結果另文發(fā)表），初步確認融合子仍為蛹蟲草菌株。

融合菌株通常穩(wěn)定性不高，易在后期傳代的過程中出現(xiàn)分離。本研究中獲得的大多數(shù)融合菌株在傳代3～4次之后逐漸出現(xiàn)分離，恢復親株的性狀。融合菌株RCS262雖經(jīng)過了多代分離，其遺傳性狀仍然保持穩(wěn)定，但其優(yōu)良性狀能否長期保持，是否還有其他雙親沒有的性狀以及與雙親的合成與代謝的差異將在后續(xù)從不同方面進一步探討。

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（責任編輯：柯文輝）

2019年第11期