楊成龍 方少忠 林智敏 郭文杰 蔡宣梅 張潔

摘要：【目的】研究百合種球反季節(jié)繁育二次抽薹過程中的淀粉代謝機制，為精確種球反季節(jié)繁育的收儲期，促進國產(chǎn)種球繁育提供理論依據(jù)。【方法】通過測量百合抽薹前后不同發(fā)育時期，鱗莖中的淀粉、還原糖含量，使用掃描電鏡觀察鱗片細(xì)胞中的淀粉顆粒形態(tài)內(nèi)容變化，定量分析不同發(fā)育時期種球的淀粉酶基因的表達情況?！窘Y(jié)果】百合鱗莖二次抽薹過程中，淀粉和還原糖含量在萌動期出現(xiàn)顯著性變化，淀粉含量下降4.98%，還原糖含量增加3.23%。掃描電鏡（SEM）觀察結(jié)果表明：百合鱗片抽薹過程中淀粉粒有A、B、c（大、中、小）3種類型。在膨大期和成熟期包含A型和B型淀粉粒;萌動期c型淀粉粒出現(xiàn)，A型淀粉粒出現(xiàn)異形、凹陷或是拉伸，長短軸比（L/S）達最大1.77，淀粉顆粒被逐漸拆分;抽薹期A型淀粉粒消失，B、c型顆粒表面出現(xiàn)大量泡狀突起，小顆?？梢娨浴俺鲅俊钡姆绞介L出。不同發(fā)育時期淀粉酶基因的實時熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）結(jié)果顯示：淀粉分解酶基因AMY在不同發(fā)育時期均有表達，在膨大期和成熟期表達量較低，在萌動期和抽薹期高度表達;淀粉合成酶相關(guān)基因SSS、SBE在不同發(fā)育時期均有表達，在膨大期和成熟期表達量較高，在萌動期和抽薹期表達量較低;淀粉分解酶和合成酶相關(guān)基因在種球不同發(fā)育時期表達情況與淀粉含量的變化情況相符。【結(jié)論】百合種球反季節(jié)繁育過程中，二次抽薹導(dǎo)致種球大量的淀粉被消耗，將影響商品球質(zhì)量以及鮮切花的品質(zhì)，為消除此不利因素，繁育過程中應(yīng)當(dāng)在種球進入成熟期后及時進行收儲。

關(guān)鍵詞：百合;種球;淀粉代謝;抽薹

中圖分類號：S682文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）10-1150-08

0引言

【研究意義】百合Lilium是多年生鱗莖植物，其切花商品價值高，市場需求量大。目前我國百合切花所需種球均從荷蘭等國進口，每年種球進口量達2億余頭，且需求仍在不斷增加。種球依賴進口導(dǎo)致切花成本居高不下，且市場抗風(fēng)險能力弱，因此百合種球國產(chǎn)化繁育勢在必行?；趤啛釒皆貐^(qū)的氣候資源稟賦，采用反季節(jié)繁育技術(shù)可創(chuàng)制高品質(zhì)的商品球，而繁育過程中經(jīng)常出現(xiàn)種球二次抽薹的異?，F(xiàn)象，對此異?，F(xiàn)象的形成機制進行深入分析并采取科學(xué)的技術(shù)措施消除不利影響對實現(xiàn)百合種球國產(chǎn)化繁育具有重大意義?！厩叭搜芯窟M展】為了解決百合原種問題，打破花卉大國的控制，近年來國內(nèi)陸續(xù)開展了相關(guān)種球繁育研究。主要集中在組培快繁、鱗片扦插、冷藏春化、栽培技術(shù)等幾個方面，而抽薹通常是作為冷藏春化是否完全的驗收指標(biāo)，而本研究所涉及的二次抽薹現(xiàn)象是基于亞熱帶平原地區(qū)種球反季節(jié)繁育方式所形成的獨特現(xiàn)象，其形成原因在于栽種的種球經(jīng)歷了冬春季節(jié)的低溫誘導(dǎo)形成了生理分化，到了夏季春化完全后誘發(fā)種球出現(xiàn)二次抽薹現(xiàn)象?！颈狙芯壳腥朦c】百合鱗莖作為多年生的地下貯藏器官，在其生長發(fā)育過程中經(jīng)歷了多次源、庫功能上的轉(zhuǎn)換，淀粉是百合鱗莖細(xì)胞內(nèi)碳水化合物的主要貯藏形式，其代謝作用直接關(guān)系到鱗莖及植株的發(fā)育。針對形成二次抽薹現(xiàn)象的生物學(xué)機制研究仍未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過對不同發(fā)育時期種球的淀粉代謝機制進行研究，探討百合種球二次抽薹前后不同發(fā)育時期，鱗莖中淀粉形態(tài)內(nèi)容物變化以及淀粉酶基因的活性變化情況，以深入了解二次抽薹現(xiàn)象的形成情況，揭示形成二次抽薹現(xiàn)象的生物學(xué)機制并提出解決措施，為實現(xiàn)種球國產(chǎn)化繁育提供了理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2018年4-6月在福州吳鳳百合基地進行。選用東方百合西伯利亞品種分4次進行取樣，4月24日取第一次樣品，5月4日第二次取樣，5月23日（鱗莖內(nèi)部已觀察到拔節(jié)），6月5日（鱗莖已抽薹8cm），以下筆者把這4個時期分別稱為膨大期、成熟期、萌動期、抽薹期。

1.2試驗方法

1.2.1取樣及養(yǎng)分含量測定4次取樣，每次取10個鱗莖，重復(fù)3次，洗凈烘干后打成粉末，混合取樣。用蒽酮比色法測定鱗片的淀粉、還原糖含量。

1.2.2掃描電鏡觀察分別取不同時期中層、外層鱗片進行切片觀察，切取鱗片中心部位薄片1cm×1cm，用5%的戍二醛固定樣品4h，磷酸緩沖液清洗樣品3遍（各15min），1%鋨酸固定4h，蒸餾水清洗3遍（各15min），50%～100%酒精逐級脫水（各15min，其中100%置換3次），環(huán)氧丙烷置換2遍，用日立（HTACrn3IHCP-2型臨界點干燥儀干燥，將樣品用IB-5離子濺射儀噴鉑金后，用日本電子（JEOL）JSM-6380LV型掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.3總RNA提取和cDNA的合成利用RNApreppure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，TIANGEN）提取百合鱗莖總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。以各樣品100ng總RNA為模板，利用RevertAid First Strand cDNA Synth.esis Kit#K1622（賽默飛世爾科技公司，Thermo Scientific）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，存于-80%儲藏備用。

1.2.4淀粉分解與合成關(guān)鍵酶基因表達分析應(yīng)用Applied Biosystems QuantStudio 熒光定量PCR儀進行熒光檢測，qRT-PCR的反應(yīng)體系為2×ChamQ SYBRqPCRMasterMix5ul，各樣品的cDNA11ul，F(xiàn)orwardPrimer和Reverse Primer（濃度10pm01.L）各0.4ul，用ddH2O補足體積至20ul。qRT-PCR的反應(yīng)程序為：95℃30s;95°C 10s;60%30s，40個循環(huán)。實驗設(shè)計3個技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)讀取由儀器自動完成，通過溶解曲線分析確定擴增產(chǎn)物的特異性。

根據(jù)百合已登錄序列采用Primer 6.0分別設(shè)計AMy、SSS、SBE 3個基因的特異性引物序列（表1），由福州白鯨生物科技有限公司合成，以ACTIN為內(nèi)參基因。采用2法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.3統(tǒng)計分析

利用Image Pro-Plus軟件對掃描電鏡的淀粉粒進行幾何特征分析;試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行計算和處理，利用DPS軟件進行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同發(fā)育時期鱗莖的養(yǎng)分含量變化

在4個不同的發(fā)育期中，百合淀粉含量總體呈先上升后下降趨勢（圖1），前期栽種的百合種球雖然地上植株已陸續(xù)開始黃化，但地下部仍在膨大貯藏養(yǎng)分，淀粉含量也從20.08%上升至21.26%，但到后期淀粉含量迅速下降，尤其在萌動期，淀粉含量相對之前下降了4.98%，而到了抽薹期，淀粉消耗相對趨緩。因此，在出現(xiàn)二次抽薹現(xiàn)象的過程中，百合的大部分能量用于內(nèi)部初始拔節(jié)。而還原糖的增長也主要集中在萌動期（圖2），增加了3.23%，之后緩慢下降，也就是說隨著百合鱗莖內(nèi)部拔節(jié)的發(fā)生，還原糖含量明顯增加，表明鱗片的代謝性養(yǎng)分供給加速，這與此時鱗片中淀粉含量大幅下降是相關(guān)聯(lián)的。

2.2不同發(fā)育時期鱗莖的淀粉粒掃描電鏡比較研究

在百合4個時期取鱗莖的中層鱗片，用掃描電鏡觀察百合鱗片中細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)，可清楚地看到淀粉粒形態(tài)和分布變化。從圖3（1.4）可以看出中層鱗片維管束細(xì)胞中淀粉粒的整體狀態(tài)，栽種期的鱗莖有部分淀粉粒游離在細(xì)胞腔內(nèi)，并且有絮狀物包裹。隨著鱗莖的生長發(fā)育，淀粉顆粒變大，開始逐步充滿整個細(xì)胞腔，絮狀物減少。到了拔節(jié)期，淀粉顆粒出現(xiàn)各種變形、凹陷、脫落，而抽薹期腔體空隙變大，小顆粒增多，顆粒表面及腔體內(nèi)壁均出現(xiàn)大量泡狀突起或是絮狀物。

同時，研究發(fā)現(xiàn)百合鱗莖細(xì)胞含有3種淀粉粒：A型（大粒）淀粉粒長軸直徑/>50um，B型（中粒）20um≤長軸直徑<50um，C型（小粒）長軸直徑<20gm（圖3，5-12，表2）。

（1）膨大期：包含A型和B型淀粉粒。A型淀粉粒平均大小為55.87um×36.78um，淀粉顆粒較大，呈橢圓型，淀粉粒表面粘連著豐富的絮狀粘絲。在A型淀粉粒周圍有部分B型淀粉粒分布，淀粉粒之間有空隙，排列較松散，平均大小為35.03um×24.22um。

（2）成熟期：包含A型和B型淀粉粒。A型淀粉粒排列較為緊密，呈菱形和橢圓型，顆粒間絮狀粘絲減少，淀粉粒平均為58.34um×43.00um，B型淀粉粒少量游離于A型淀粉粒周邊，平均為35.60um×25.37um。相比膨大期A型淀粉顆粒增幅顯著，顆粒變大，且數(shù)量增多，這與淀粉含量測定結(jié)果相符。

（3）萌動期：包含A、B、C3種類型淀粉粒，c型小粒開始出現(xiàn)。腔體內(nèi)淀粉顆粒總體排列松散，A型淀粉粒出現(xiàn)異形、凹陷或是拉伸（圖3-7、10），長短軸比（L/S）達最大（1.77），淀粉粒大小平均為61.48umX35.98um，因此在萌動期淀粉大顆粒長軸被拉伸，短軸減小，淀粉顆粒被逐漸拆分。B型淀粉粒多為圓型或橢圓型，平均為29.49umX21.59um，淀粒顆粒顯著減小。與此同時，近圓型的C型顆粒少量出現(xiàn)，平均為17.54um×14.19um，長短軸比（L/S）達最小（1.24）。此時的淀粉含量測定也發(fā)現(xiàn)萌動期百合鱗片中的淀粉含量相比膨大期和成熟期顯著下降，淀粉不斷被降解。

（4）抽薹期：包含B型和c型淀粉粒，A型淀粉粒消失。腔體內(nèi)排列著較為緊密的B型淀粉粒，平均為34.29um×25.82tma，c型淀粉粒在其周圍游離分布，平均為18.60um×14.66um。B、C型顆粒表面均出現(xiàn)大量泡狀突起，小顆粒可見以這種“出芽”（圖3.11）的方式長出。抽薹期A型淀粉粒消失，B型淀粉粒相比萌動期顯著增大，可以判斷百合鱗莖抽薹過程中A型淀粉粒被分解為B型淀粉粒，為百合抽薹提供能量。同時，筆者在抽薹期還發(fā)現(xiàn)部分大量包裹絮狀物的淀粉粒，觀察發(fā)現(xiàn)其中1個c型淀粉粒呈撕裂狀（圖3.12）。并伴有絮狀物，且極小淀粉粒形成之初都有大量絮狀物包裹（圖3.13），因此淀粉粒形成是否與絮狀物有關(guān)，絮狀物是何成分有待進一步研究。

2.3淀粉分解與合成關(guān)鍵酶基因表達分析

由圖4可知，百合鱗莖淀粉分解酶基因AMY在成熟期的表達量與膨大期并無顯著性差異且略有下調(diào)，萌動期與抽薹期的AMY基因高度表達，分別約為膨大期的2.4倍和6.2倍，該結(jié)果與不同時期的百合淀粉含量與還原糖含量變化趨勢相符。淀粉分解酶基因AMY集中在萌動期與抽薹期高度表達，a-淀粉酶將大量淀粉分解為還原糖和蔗糖，為百合種球二次抽薹的啟動提供能量來源。

由圖5-6可知，百合鱗莖淀粉合成酶關(guān)鍵酶基因SSS和SBE在成熟期表達水平最高，進入萌動期后表達強度出現(xiàn)顯著性逐漸減弱，基因表達水平變化趨勢與不同時期的百合淀粉含量變化趨勢一致。在種球成熟期階段，淀粉合成酶關(guān)鍵基因SSS和SBE高度表達，該時期百合種球內(nèi)部大量養(yǎng)分以合成淀粉的形式進行儲藏。

3討論

3.1淀粉和還原糖含量與百合抽薹的關(guān)系

孫紅梅等研究發(fā)現(xiàn)，亞洲系‘精粹’百合和蘭州百合在出苗階段淀粉含量下降，而在花后期達最大值，分別為28.64%和21.70%;還原糖含量則在花后期出現(xiàn)最小值?；絷盆沧C明，東方百合鱗莖在花芽分化時期中淀粉含量變化顯著，其含量隨著花芽分化的過程逐漸降低;夏宜平等測定表明，從栽種期到含苞期，東方百合淀粉含量均下降，至盛花期后逐漸上升，而去花苞處理的淀粉含量高于未去花苞的處理。本研究針對百合種球二次抽薹現(xiàn)象前后不同時期中的淀粉和還原糖進行測定，結(jié)果表明，在萌動期百合淀粉含量迅速下降了4.98%，與之相對，還原糖含量顯著增加，達11.3%。萌動期淀粉和還原糖含量的變化與前人的研究相符，當(dāng)百合鱗莖發(fā)生形態(tài)變化時，內(nèi)部淀粉分解為糖類，參于新陳代謝，為植株提供能量來源。

3.2淀粉粒的形態(tài)特征變化以及與百合抽薹代謝的關(guān)系

近幾年，對百合淀粉粒的研究主要有關(guān)花芽分化、低溫貯藏、鱗莖更新發(fā)育和不同培養(yǎng)方式，其中對淀粉粒顯微結(jié)構(gòu)變化的描述較為籠統(tǒng)，未進行幾何特性的系統(tǒng)分析和分類，因而對百合形態(tài)變化過程中淀粉粒的分化、產(chǎn)生以及形態(tài)變異闡述不清晰。本研究對百合抽薹過程中的淀粉粒進行分析發(fā)現(xiàn)，百合鱗莖細(xì)胞含有3種淀粉粒：A型（大粒）淀粉粒長軸直徑≥50um，B型（中粒）20um≤長軸直徑<50um，c型（小粒）長軸直徑<20um。膨大期和成熟期包含A型和B型淀粉粒，c型小淀粉粒在萌動期開始出現(xiàn)，而到了抽薹期A型大淀粉粒消失。萌動期A型淀粉粒出現(xiàn)異形、凹陷或是拉伸，長短軸比（L/S）達最大（1.77），變異度顯著增大，而抽薹期A型淀粉粒消失不見，取而代之的是大量的B型和c型淀粉粒，且B型淀粉粒相比萌動期顯著增大，可以判斷百合鱗莖抽薹期中的部分B型淀粉粒是由A型淀粉粒分解而來，淀粉粒的分解為百合抽薹提供能量，這與前面的淀粉和還原糖含量變化測定結(jié)果一致。韋存虛等對小麥胚乳淀粉粒的結(jié)構(gòu)觀察表明大淀粉粒的淀粉體通過縊縮進行增殖和分化，而百合鱗莖中是成熟的籽粒，不存在淀粉體，大淀粉粒很可能是以自身的拉伸變形來完成增殖和分化。邢世巖等對葉籽銀杏淀粉粒特性進行研究發(fā)現(xiàn)其中粒和小粒淀粉粒明顯可見以“出芽”方式從大淀粉粒上長出。本研究結(jié)果顯示，抽薹期B、c型顆粒表面均出現(xiàn)大量泡狀突起似“出芽”而其中一個c型淀粉粒又呈撕裂狀，極小淀粉粒形成之初都有大量絮狀物包裹，因此，小顆粒是以這種“出芽”的方式從大淀粉粒上長出或是通過拉伸撕裂的方式產(chǎn)生尚不明確。

3.3淀粉代謝相關(guān)酶與百合鱗莖生長發(fā)育的關(guān)系

碳水化合物是植物體內(nèi)非常重要的物質(zhì)，一方面它是植物體內(nèi)非常重要的組成成分，另一方面它參與新陳代謝，為植物提供能量來源，其組成形式及含量的變化影響著植物的生長發(fā)育。淀粉作為百合鱗莖內(nèi)主要的貯藏物質(zhì)，百合的整個生長發(fā)育過程其實就是淀粉代謝的過程。淀粉酶活性的強弱反應(yīng)了植物體內(nèi)碳水化合物的代謝狀況，與植物生長發(fā)育密切相關(guān)。吳沙沙的研究指出淀粉合成酶（可溶性淀粉合成酶）SSS可以作為百合鱗莖源或庫功能的指標(biāo)。楊春起通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)揭示了a-淀粉酶參與了種球的休眠解除。李雪艷等”對小鱗莖形成與發(fā)育轉(zhuǎn)錄組進行分析表明在生物學(xué)代謝過程中參與的基因最多，其中主要是淀粉.蔗糖代謝，并且驗證了淀粉合成酶（可溶性淀粉合成酶）基因SSS、淀粉分支酶基因SBE等參與了小鱗莖生長發(fā)育的過程。結(jié)合前人的研究，用淀粉合成酶基因SSS、SBE和淀粉分解酶基因AMY針對反季節(jié)種球繁育過程中出現(xiàn)的二次抽薹現(xiàn)象進行表達量相對分析，能夠直觀反映出該過程淀粉酶活性變化，同時揭示二次抽薹現(xiàn)象出現(xiàn)的過程中，前期淀粉以合成為主儲藏養(yǎng)分于種球之中，后期淀粉以分解為主，為二次抽薹提供能量來源。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，百合種球反季節(jié)繁育過程中出現(xiàn)二次抽薹的現(xiàn)象，其能量來源于種球內(nèi)部淀粉的消解。在種球膨大期到成熟期之間，測量的淀粉含量呈上升趨勢，還原糖含量呈下降趨勢，電鏡觀察顯示A型淀粉顆粒增幅顯著，顆粒變大，且數(shù)量增多，淀粉合成酶SSS、SBE高度表達，淀粉代謝形式以合成為主，種球汲取大量養(yǎng)分;在種球成熟期到萌動期之間，測定的淀粉含量大幅下降，還原糖含量大幅上升，電鏡觀察顯示c型淀粉粒出現(xiàn)，A型淀粉粒被拆分，B型淀粉粒顆粒變小，淀粉分解酶基因AMY高度表達，淀粉代謝形式以消解為主，種球貯藏的養(yǎng)分被釋放;在種球萌動期到抽薹期之間，測定的淀粉含量呈下降趨勢，還原糖含量呈上升趨勢，電鏡觀察顯示A型淀粉粒消失，淀粉分解酶基因AMY表達水平提高，淀粉代謝形式以消解為主，種球貯藏的養(yǎng)分被充分釋放。二次抽薹現(xiàn)象的出現(xiàn)消耗了種球內(nèi)部大量的養(yǎng)分不利于種球下一季的生長，對商品球的質(zhì)量和鮮切花的品質(zhì)造成不利影響。為消解此現(xiàn)象帶來的不利因素，種球反季節(jié)繁育過程當(dāng)中應(yīng)注重把握成熟種球的收儲時間，以亞熱帶平原地區(qū)的氣候條件為參考，夏季5月份上旬為成熟期種球的最佳采收時間。