陳華 張麗娟 李素一 柯翎 陳敘 林晨韜

摘要：【目的】研究飼料中添加裂殖壺菌對魚類抗細(xì)菌感染能力的影響，為裂殖壺菌作為飼料添加劑的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā恳?個月的成年斑馬魚為研究對象，以基礎(chǔ)顆粒飼料為對照組（c組），試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼料中添加干重3%的裂殖壺菌（s組），進(jìn)行28d飼喂試驗(yàn)。28d后以創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus菌株FJ03-X2對斑馬魚進(jìn)行攻毒，統(tǒng)計(jì)免疫保護(hù)率，并收集斑馬魚的腎臟組織提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過Real-time-RT-PCR檢測相關(guān)基因lysozyme和tnfb的表達(dá)?！窘Y(jié)果】飼料中添加3%裂壺菌能夠顯著提高斑馬魚感染創(chuàng)傷弧菌后的存活率，相對保護(hù)率為42.8%;Real-timeRT-PCR檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)s組的斑馬魚腎臟中溶菌酶Lysozyme的mRNA水平極顯著高于對照組（P<0.01），而腫瘤壞死因子TNFb的mRNA水平則極顯著低于對照組（P<0.01）?！窘Y(jié)論】裂殖壺菌作為營養(yǎng)添加劑可以提高斑馬魚抗創(chuàng)傷弧菌感染的能力。

關(guān)鍵詞：裂殖壺菌;斑馬魚;創(chuàng)傷弧菌;飼料添加劑

中圖分類號：S941文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）10-1117-07

0引言

【研究意義】脂肪酸是構(gòu)成動物日糧油脂的主要組成部分。目前大量的研究表明，脂肪酸作為一種調(diào)節(jié)因子，參與眾多細(xì)胞的功能、炎癥反應(yīng)及免疫力的調(diào)節(jié)。其中研究較多的脂肪酸是多不飽和脂肪酸（poly unsaturated fatty acids，PUFAs）。PUFAs來源較廣，但高度不飽和脂肪酸（HUFAs）則只在深海魚類和海藻中含量較高。絕大部分動物不能新合成ω-3PUFAs和ω-6PUFAs，動物體只能通過日糧攝取補(bǔ)充。目前較主流的方法就是在飼料中添加含有大量不飽和脂肪酸的魚油或藻類。相對于魚油容易氧化、會污染水質(zhì)等不足，來自于海水的微藻是更理想的飼料添加劑。通過在基礎(chǔ)飼料中添加富含PUFAs的裂殖壺菌，了解其對斑馬魚的免疫力特別是抗菌能力的影響，可為開發(fā)新型富含多不飽和脂肪酸的飼料添加劑提供理論基礎(chǔ)，也為養(yǎng)殖業(yè)的病害綜合防治提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】裂殖壺菌（Schizochytrium）又稱裂壺藻，是一類海洋真菌。營養(yǎng)成分研究分析表明其中脂肪酸含量相當(dāng)高，甚至可占細(xì)胞干重50%以上，總脂肪酸中DHA含量高達(dá)35%-40%，其他脂肪酸含量低。PCWA暴露在空氣中容易氧化，但是在裂殖壺菌中是包被于細(xì)胞內(nèi)而不易氧化，而且細(xì)胞內(nèi)的DHA含量還可以通過培養(yǎng)基的優(yōu)化來控制。PUFAs具有許多特殊的生理功能，如調(diào)節(jié)腸道健康以及具有抗菌活性，還具有抗炎及調(diào)節(jié)免疫的活性。有研究表明：ω-3PUFAs與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，能有效降低促炎癥因子FGE2和白三烯B4的生成，同時對IL-6、IL-8和TNF-a等促炎癥因子也有一定抑制作用。給注射脂多糖LPS的動物或燒傷的動物飼喂含有大量PUFAs的魚油后，其循環(huán)血液中TNF-a、IL-1及IL-6濃度相應(yīng)降低，從而降低遲發(fā)超敏反應(yīng)的強(qiáng)度。大鼠或小鼠飼以缺乏多不飽和脂肪酸ω-3PUFAs或ω-6PUFAs的日糧后，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用和細(xì)胞毒性作用以及中性粒細(xì)胞的趨化性都出現(xiàn)減弱。此外，研究發(fā)現(xiàn)ω-3PUFAs還能促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及其他形式的細(xì)胞死亡而具有抗腫瘤的活性。此外，裂殖壺菌的細(xì)胞內(nèi)還含有豐富的維生素、必需氨基酸等其他營養(yǎng)成分，與酵母、魚油相比有更高的實(shí)用價值。創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）是一種常見的、分布廣泛的嗜鹽性革蘭氏陰性病原菌。它是一種人獸共患的致病菌，能引起原發(fā)性敗血癥和軟組織感染，曾導(dǎo)致日本和歐美等國鰻鱺產(chǎn)業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。創(chuàng)傷弧菌也是近年來在福建沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖中較為常見、危害較大的病原菌?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以往對裂殖壺菌作為飼料添加劑的研究主要集中于對動物生長性能的提高，對其影響動物尤其是水生動物免疫性能方面的探索并不深入，主要檢測相關(guān)生化指標(biāo)或免疫相關(guān)酶的活性。本研究以常見的水產(chǎn)病原菌對斑馬魚進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，更為直接地研究裂殖壺菌添加對動物的抗茵能力的影響，并檢測了相關(guān)免疫因子，對其中的機(jī)制進(jìn)行探索。【擬解決的關(guān)鍵問題】為了解裂殖壺菌作為飼料添加劑的作用效果，本課題組以斑馬魚為研究對象，在基礎(chǔ)飼料中添加裂殖壺菌。飼喂28d后，以福建省常見的水產(chǎn)病原菌創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，計(jì)算免疫保護(hù)率并檢測斑馬魚的相關(guān)炎癥因子的表達(dá)變化，以此來評估裂殖壺菌作為飼料添加劑在提高魚類抗菌能力方面的作用，了解以DHA為代表的多不飽和脂肪酸是通過何種途徑影響斑馬魚抗菌能力，為裂殖壺菌作為飼料添加劑的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株裂殖壺菌（資源編號ATCCMYA-1381）由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院惠贈。創(chuàng)傷弧菌FJ03-X2是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所魚病研究室于2003年在福建省長樂某養(yǎng)殖場分離到的一株鰻源創(chuàng)傷弧菌，保存于-80℃。

1.1.2試驗(yàn)動物

斑馬魚親魚購自國家斑馬魚資源中心，6個月大的成年野生型AB系斑馬魚由本實(shí)驗(yàn)室自主繁殖，平均體重約為0.2g，健康狀況良好。

1.1.3主要試劑酵母提取物、蛋白胨、D-葡萄糖均購自上海生工生物工程有限公司;海鹽（益爾Yier）;培養(yǎng)基TSA、TSB均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;0.1%DEPC處理水;氯仿;異丙醇;無水乙醇;Trizol試劑（Invitrogen，Cat.No.15596026）;試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和SYBR Premix Ex Taq II（RR820A）均購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1裂殖壺菌培養(yǎng)及冷凍干燥

培養(yǎng)基參考ATCCMedium 790ByMedium：每升中含酵母提取物1.0g，蛋白胨1.0g，D-葡萄糖5.0g，海鹽27.5g。錐形瓶加蓋可通氣瓶塞培養(yǎng)60h，溫度20%，搖床轉(zhuǎn)速220r·rain。無需光照。

收集裂殖壺菌，室溫8000r·min離心10min，去除上清，將收集的沉淀置于冷凍干燥儀中凍干24h，樣品的脂肪酸含量經(jīng)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所測定（檢測標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.168-2016）。用研缽將凍干的裂殖壺菌磨成粉末，以3%的比例添加入基礎(chǔ)飼料中，充分混勻，放置于陰涼干燥處備用。

1.2.2裂殖壺菌對斑馬魚的養(yǎng)殖投喂試驗(yàn)用水族箱大小約為15cm×25cm×40cm，帶自動循環(huán)控溫及紫外消毒過濾系統(tǒng)。凈水器過濾自來水，曝氣24h作為循環(huán)水源，控制水溫（28±1）℃，鹽度0.05%，每個水族箱放養(yǎng)斑馬魚20尾。斑馬魚每天上、下午各飼喂1次，投餌量為體重的1%，對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)組飼喂上述添加干重3%的裂殖壺菌的基礎(chǔ)飼料，攻毒試驗(yàn)前一天禁食?；A(chǔ)飼料為臺灣海豐寶贈紅小型魚飼料，基礎(chǔ)營養(yǎng)成分見表1。

1.2.3斑馬魚創(chuàng)傷弧菌攻毒試驗(yàn)創(chuàng)傷弧菌FJ03-X2的培養(yǎng)、復(fù)蘇及活化參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。創(chuàng)傷弧菌對斑馬魚半致死劑量的測定方法參考文獻(xiàn)[161的方法。

對照組（c組）和試驗(yàn)組（s組）的斑馬魚各15尾以MS-222麻醉后，分別以上述半致死量的創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行攻毒。每天觀察記錄死亡情況，試驗(yàn)持續(xù)1周，統(tǒng)計(jì)保護(hù)率。攻毒試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Real-time RT-PCR檢測斑馬魚相關(guān)基因的表達(dá)總RNA的提?。涸贔J03-X2攻毒24h后，分別解剖各組存活和死亡的斑馬魚腎臟組織（每組隨機(jī)選取3尾），參照TRIzol Reagent說明書，提取總RNA。以NanoDrop Spectrophotometer ND-1000進(jìn)行RNA的濃度測定。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：嚴(yán)格按照PrimeScript RT reagent Kitwith gDNAEraser試劑盒說明書的操作步驟，將上述總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，將制備的cDNA保存于-40%，待用。

SYBR Green Real-time RT-PCR：采用SYBRGreen I嵌合熒光法，按SYBR Premix EX TaqII（RR820A）說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)體系為20ul：10ul SYBR Premix EX Taq（2×），1ul上游引物，1ul下游引物，0.4ul ROX Reference DyeⅡ（50×），1ul cDNA模板，6.6ul ddn2O。Real-time PCR在ABI 7500實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s、退火溫度60℃下退火34s;40個循環(huán)用于檢測PCR擴(kuò)增特異性的熔解曲線反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃15s，60℃60s，95℃15s。實(shí)時熒光定量測定方法參照文獻(xiàn)[16]，以β-actin作為內(nèi)參基因，以未添加模板的反應(yīng)體系作為空白對照，Real-timeRT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成（表2），每個樣品3個平行。反應(yīng)結(jié)束后，通過熔解曲線分析產(chǎn)物的單一性，并利用2來確定每個基因的相對表達(dá)量。公式如下：

1.3數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?；虮磉_(dá)結(jié)果采用相對表達(dá)量的形式，所有數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.01為差異極顯著標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用Excel 2010和SPSSl6.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1裂殖壺菌的脂肪酸含量及各脂肪酸組成

經(jīng)測定，裂殖壺菌總脂肪酸含量占干重的25.2%，其中DHA含量占總脂肪酸的39.62%，EPA含量占總脂肪酸的1.25%，詳細(xì)結(jié)果見表3。

2.2斑馬魚創(chuàng)傷弧菌攻毒試驗(yàn)結(jié)果

創(chuàng)傷弧菌以半致死量攻毒12h后，部分斑馬魚開始出現(xiàn)腮、腹部、尾鰭出血以及腹水等典型的敗血癥癥狀，陸續(xù)死亡。攻毒后24h-7d各組斑馬魚均未再出現(xiàn)死亡。c組（對照組）的死亡率為46.7%，接近半致死量;s組（試驗(yàn)組）的平均死亡率為26.7%，保護(hù)率達(dá)到42.8%（表4）。

2.3免疫相關(guān)基因lysozyme和tnfb在斑馬魚腎臟中的表達(dá)

創(chuàng)傷弧菌攻毒前后C組和S組斑馬魚腎臟中l(wèi)ysozyme和tnfb西的mRNA水平如圖1、2所示。lysozyme的檢測結(jié)果（圖1）顯示：1）創(chuàng)傷弧菌攻毒后，斑馬魚腎臟中l(wèi)ysozyme表達(dá)急劇降低，尤其是攻毒后死亡的斑馬魚;2）s組lysozyme表達(dá)水平高于c組，其中s組存活的斑馬魚中l(wèi)ysozyme的表達(dá)水平極顯著高于c組存活的斑馬魚（P<0.01）;3）s組內(nèi)存活的斑馬魚舾ozyme的表達(dá)極顯著高于死亡的斑馬魚（P<0.01）。表明飼料中添加裂殖壺茵可通過提高lysozyme的表達(dá)水平來抵抗細(xì)菌的感染，從而對斑馬魚產(chǎn)生保護(hù)作用，提高其存活率。

斑馬魚腎臟中加tnfb的表達(dá)情況（圖2）可以看出：1）攻毒前s組斑馬魚腎臟的加tnfb表達(dá)水平低于c組;2）攻毒后s組與c組存活的斑馬魚相較于死亡的斑馬魚，其腎臟中tnfb的表達(dá)極顯著降低（P<0.01），而與各自攻毒前的表達(dá)水平差異不大;3）死亡的斑馬魚中s組的加tnfb表達(dá)相對于c組也極顯著降低（P<0.01）。這一結(jié)果暗示：短時間內(nèi)tnfb的過量表達(dá)有可能對斑馬魚造成不利影響，導(dǎo)致感染后死亡;飼料中添加裂殖壺菌可以抑制tnfb的過量表達(dá)，從而提高斑馬魚急性感染后的存活率。

3討論與結(jié)論

本研究中應(yīng)用的菌株ATCC MYA-1381經(jīng)測定總脂肪酸含量占干重的25.2%，其中多不飽和脂肪酸DHA含量占總脂肪酸的39.62%，EPA含量占總脂肪酸的1.25%，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。

大量研究表明，飼料中添加裂殖壺菌能提高動物的生長性能，并且隨著添加量的提高，其生長速度也隨之增加：例如Matthew等的研究表明，在大西洋鮭魚的飲食中用裂殖壺菌油替代魚油，可以顯著提高魚肉組織中的DHA含量;裂殖壺菌作為魚油DHA替代資源在金頭海鯛養(yǎng)殖上也顯示出的巨大潛力;以正常商品飼料作對照，用1%的裂殖壺菌投喂對蝦，其生長率、成活率有顯著性差異;焦建剛等的研究表明，在對蝦基礎(chǔ)飼料中添加0.5%的裂殖壺菌發(fā)酵粉，可明顯地促進(jìn)其生長，降低飼料系數(shù)（FCR），提高肌肉中蛋白質(zhì)及DHA的含量，改善了對蝦的品質(zhì)。本研究選擇的是6個月的成年斑馬魚，發(fā)現(xiàn)飼喂28d后，試驗(yàn)組和對照組的體重、體長并沒有顯著差異。后期將會對3個月以下的幼魚進(jìn)行飼喂，以便更好地了解裂殖壺菌的添加對斑馬魚生長發(fā)育的影響。

本研究試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C組（基礎(chǔ)飼料組）的平均死亡率為46.7%，接近半致死量。s組（裂殖壺菌添加組）的平均死亡率為26.7%，保護(hù)率達(dá)到42.8%。說明飼料中添加裂殖壺菌具能夠有效提高斑馬魚的抗創(chuàng)傷弧菌感染的能力。研究表明飼料中添加裂殖壺菌可顯著提高對蝦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、丙二醛（MDA）等免疫指標(biāo)（p<0.05）;黃亮華等發(fā)現(xiàn)在飼料中添加裂殖壺菌除了可以提高刺參的特定生長率（SGR），還可以明顯提高其體腔液中的SOD、LZM、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）等的活性。說明裂殖壺菌作為一種天然的海洋真菌，對水生生物機(jī)體具有明顯的免疫刺激作用。

魚類具有特異性和非特異性免疫反應(yīng)，但與哺乳動物相比，其特異性免疫機(jī)制發(fā)育尚不完全。非特異性免疫是魚類免疫系統(tǒng)的第一道防線，具有作用范圍廣，反應(yīng)快，遺傳性等特點(diǎn)，是一切免疫防御的基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步探究添加裂殖壺菌對魚類的非特異免疫調(diào)節(jié)的機(jī)理，本研究通過熒光定量PCR技術(shù)，檢測了斑馬魚腎臟組織中免疫相關(guān)基因lysozyme和tnfb的表達(dá)情況。

溶菌酶（Lysozyme）作為非特異性免疫的重要因子，在抵御病原菌入侵過程中發(fā)揮重要作用，是機(jī)體免疫機(jī)能的重要評價指標(biāo)之一。本研究中，創(chuàng)傷弧菌攻毒后，斑馬魚腎臟中l(wèi)ysozyme表達(dá)急劇降低，特別是攻毒后死亡的斑馬魚，說明lyso.zyme的表達(dá)水平與斑馬魚的抗菌能力密切相關(guān)。值得注意的是：s組與c組相比lysozyme表達(dá)水平上調(diào)，其中s組存活的斑馬魚中l(wèi)ysozyme的表達(dá)較c組存活的斑馬魚顯著上調(diào)。這一結(jié)果提示飼料中添加裂殖壺菌可能通過提高斑馬魚的lysozyme表達(dá)水平來抵抗細(xì)菌的感染，從而產(chǎn)生保護(hù)作用，提高其存活率。

腫瘤壞死因子（TNF）不僅具有殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞的作用，同時也是重要炎癥介質(zhì)之一，具有抗感染，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等作用。TNF常被稱為一把雙刃劍，它與細(xì)菌感染的關(guān)系是兩方面的：一方面適量TNF有助于增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的吞噬殺傷功能，促進(jìn)病原菌的消除，增強(qiáng)局部組織的抗感染能力，從而保護(hù)機(jī)體;另一方面過量的TNF則介導(dǎo)組織炎癥損傷，引起多器官功能損害、循環(huán)衰竭，是高死亡率的重要病理機(jī)制之一。本研究中，攻毒前s組斑馬魚腎臟的加tnfb表達(dá)水平低于c組;攻毒后這兩組存活的斑馬魚腎臟中tnfb的表達(dá)顯著低于死亡的;死亡的斑馬魚中s組的tnfb表達(dá)也顯著相低于c組。提示細(xì)菌感染后短時間內(nèi)加7西的過量表達(dá)可能對斑馬魚造成不利影響，導(dǎo)致其死亡;飼料中添加裂殖壺菌可能通過抑制tnfb的過量表達(dá)，從而提高斑馬魚急性感染后的存活率。這一結(jié)果與DHA可以抑制斑馬魚炎癥因子如TNF、IL-1β以及NF-rB等的表達(dá)，從而提高斑馬魚在病原菌攻毒后的存活率相一致。

在下一步的研究中，我們將檢測斑馬魚中更多的免疫相關(guān)因子，特別是IL-1β、NF-rB、IL-6以及IL-8等炎癥因子的表達(dá)情況，并檢測SOD、MDA、ACP、AKP、CAT等免疫指標(biāo)，從而進(jìn)一步了解裂殖壺菌提高斑馬魚抗感染能力的作用機(jī)制。

綜上所述，飼料中添加裂殖壺菌可以提高斑馬魚抵抗創(chuàng)傷弧菌感染的能力，提高其存活率。本研究提供了一種新的思路：養(yǎng)殖業(yè)病害的防控可以從病原入手，如使用有效的藥物或疫苗，也可以從飼料人手，通過有效的添加劑增強(qiáng)動物的免疫力，減輕癥狀，提高生存率。