張靖鵬 江錦秀 林裕勝 游偉 胡奇林

摘要：【目的】構(gòu)建表達絲狀支原體山羊亞種特異性蛋白基因Mmc-3740的重組表達菌，為Mmc-3740蛋白的進一步研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎肞cR技術(shù)從Mnlc-47中擴增出該基因，進行克隆、測序，將克隆質(zhì)粒與pET-28a分別雙酶切，回收正確的片段進行連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至表達菌BL21（DE3）中，IPTG誘導(dǎo)表達，產(chǎn)物用sDs-PAGE檢測，用鎳柱對其純化后免疫小鼠獲得高免血清，并進行Westenl-blot驗證。【結(jié)果】成功構(gòu)建了克隆和表達載體，重組菌表達目的蛋白大小約21ku。表達產(chǎn)物通過鎳柱純化后可得到單一的目的蛋白條帶，westem-blol檢測結(jié)果顯示所表達的目的蛋白有較好的免疫原性?！窘Y(jié)論】成功在BL2l（DE3）宿主菌內(nèi)表達了Mnlc-3740重組蛋白。

關(guān)鍵詞：絲狀支原體山羊亞種;特異基因;原核表達;免疫原性

中圖分類號：S852.62文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）10-1124-05

0引言

【研究意義】絲狀支原體山羊亞種Mycoplasmamycoides subsp.capri，Mille是引起羊支原體性肺炎（Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats，MPGS）的重要病原之一，此外，還可引起山羊的乳房炎、敗血病、角膜結(jié)膜炎等。MPGS以羊持續(xù)流鼻液、漸進性消瘦為主要臨床癥狀，剖檢以肺實質(zhì)、小葉間質(zhì)及胸膜發(fā)生漿液性和纖維素性炎、肺部有明顯的肝變H為主要特征，傳染性強，發(fā)病率約50%，致死率約為40%，給國內(nèi)外養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。Mmc屬絲狀支原體簇（mycoplasmamycoides cluster，Mm cluster），絲狀支原體簇是柔膜體綱支原體目支原體科支原體屬下一群遺傳上和血清學(xué)關(guān)系相近的支原體，包含6個重要的反芻獸病原支原體，其中與小反芻獸有關(guān)的支原體除MmC以外還有山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasmacapricolum subsp.capripneumoniae，Mccp）及山羊支原體山羊亞種（Mycoplasma capricolum subsp.capri-colum，Mcc），它們的基因組同源性很高，理化特性相似，血清學(xué)上存在交叉反應(yīng)，不易通過血清學(xué)方法進行準(zhǔn)確鑒定。因此，對Mille特異蛋白的研究對Mmc血清學(xué)檢測方法的建立有重要的意義。【前人研究進展】Thiaucourt F對Mmc 95010（登錄號：FQ377874.1）株進行全基因組測序，分析發(fā)現(xiàn)其基因組大小約1153998bp，包含922個開放閱讀框架和一個1840bp的質(zhì)粒，但到目前為止，有關(guān)Mmc特異性蛋白的研究報道較少，主要免疫相關(guān)蛋白也尚未明確。課題組前期應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)Mmc-3740基因為Mmc特有的基因，長度為435bp，編碼144個氨基酸，通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測其為免疫原性良好的分泌型蛋白。【本研究切入點】關(guān)于Mmc-3740基因功能的研究尚未見開展，因此通過原核表達并驗證該蛋白的特異性和免疫原性，對其后續(xù)的研究與應(yīng)用具有十分重要的意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對Mmc-3740基因表達及其表達產(chǎn)物的初步鑒定，為進一步研究該基因的生物學(xué)與免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，同時促進Mmc相關(guān)診斷方法的研究開發(fā)。

1材料與方法

1.1材料

Mmc菌株Mmc-45、Mmc-47由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定和保存。

普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、E.coli DH5a、限制性內(nèi)切酶BamHI、HindlII，pMD-19T和T4DNA連接酶購自大連寶日醫(yī)生物;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Proteintech公司;基因組提取試劑盒、蛋白質(zhì)純化試劑盒和Ni-NTAHis.Bind Resin購自北京全式金生物有限公司;SDS.PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、BSA封閉液、LB培養(yǎng)基、IPTG、卡那霉素、氨芐青霉素等購自上海生工生物，表達菌BL21（DE3）、表達質(zhì)粒pET-28a由本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計與合成

根據(jù)Mmc-3740基因序列，利用Primer 6.0設(shè)計引物FM-37401、RM-37401。上游引物FM-374015'-GGATCCGTGATAAAGTTATTGACTTTATTAG-3’，引入酶切位點BamHI，下游引物RM-374015’-AAGCTTTTATTGTACTGTATTGTGTTCTTC-3’，引入酶切位點HindlII，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2基因的提取與目的基因的擴增、測序利用組織/細(xì)菌DNA提取試劑盒提取Mmc-47基因組DNA，用于擴增Mmc-3740基因。PCR擴增體系為50ul：Mmc基因組DNA3ul，上、下游引物（10umol-L）各1ul，TaqDNA聚合酶25ul，去離子水20ul;擴增條件為：95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，50%退火20s，72°C延伸30s，35個循環(huán)，72℃延伸10min。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶用膠回收試劑盒進行回收，將其與pMD-19T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，利用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒做PCR鑒定和酶切鑒定后，送上海生工進行測序。

1.2.3重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建將測序正確的重組pMD-19T質(zhì)粒，與pET-28a質(zhì)粒分別雙酶切，酶切體系為：BamHI 1ul，HindlII 1ul，10XBuffer 2ul，16ul 的pMD-19T與pET-28a，總體積20ul，37°C酶切2h。分別回收目的片段與pET-28a的質(zhì)粒片段，于16°C連接過夜，連接體系：T4DNA連接酶1ul，Buffer 2ul，目的基因6ul，pET-28a載體1ul。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。利用藍白斑篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒，送上海生工進行測序，將重組質(zhì)粒命名為DET-28a-3740。

1.2.4重組Mmc-3740蛋白的誘導(dǎo)表達 將鑒定為陽性的重組菌接種于含100ug.mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C，200r·min振蕩培養(yǎng)至OD值達到0.6，加入IPTG，并使其終濃度為1mmlo.L，37°C、200r.min誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。

1.2.5表達產(chǎn)物的鑒定與純化將10mL誘導(dǎo)培養(yǎng)的重組菌離心，以2mL pH7.8的PBS重懸，超聲破碎，離心后吸取上清，并向沉淀中加2mLPBS重懸，各取15ul的上清與沉淀分別與5ul4×Proteinloading buffer混合，煮沸10min后上樣進行SDS.PAGE。將超聲破碎后的沉淀用0.45pan的濾器過濾后，用上海生工的鎳離子層析柱對表達蛋白進行純化。

1.2.6Western blotting驗證用純化的表達蛋白免疫小鼠，每只60ul，共免疫3次，第一次以弗氏完全佐劑免疫，后兩次以弗氏不完全佐劑免疫，每次相隔14d，以制備小鼠高免血清。表達蛋白經(jīng)過SDS.PAGE后，利用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，BSA封閉液4°C封閉過夜，以1：2000稀釋的小鼠高免血清作為一抗37°C孵育1h，PBST洗滌，1：10000稀釋的羊抗鼠IgG 37℃孵育1h，PBST洗滌，利用4-CN顯色法，對結(jié)果進行判定。

2結(jié)果與分析

2.1Mmc-3740基因的擴增與鑒定

以Mmc-47株基因組為模板，進行PCR擴增后，得到與目的條帶大小相符的基因片段，約435bp（圖1）。對其進行TA克隆后構(gòu)建的pMD.19T載體測序后與NCBI上公布的Mmc 95010株進行比對，相似性為94.2%，與本研究室保存的Mmc-45株相比，相似性為98.4%，均為點突變，翻譯為氨基酸序列后進行比對，其氨基酸序列相似性為100%。

2.2重組質(zhì)粒PET-28a-3740的構(gòu)建

將含有Mmc-3740基因的重組pMD-19T質(zhì)粒與表達載體pET-28a分別雙酶切，回收目的片段，經(jīng)T4DNA連接酶連接后，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a-3740，轉(zhuǎn)化BL21（DE3），擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，分別進行酶切和測序驗證，雙酶切結(jié)果如圖2所示。

2.3誘導(dǎo)表達

重組菌在37℃培養(yǎng)至OD值0.6時加入IPTG，在IPTG誘導(dǎo)下，經(jīng)SDS-PAGE分析得到目的條帶約21ku（圖3），以不含目的基因的空載體加IPTG誘導(dǎo)，相同條件下在BL21（DE3）中不表達目的蛋白。

2.4表達蛋白的純化與鑒定

利用超聲法破碎IPTG誘導(dǎo)后的重組表達菌液，收集上清與沉淀進行鎳柱純化，最后的洗脫液經(jīng)SDS-PAGE分析，在21ku處可見一條單一的條帶，得到純化的目的蛋白（圖4）。以純化的蛋白免疫小鼠，采集血清作為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，通過Western-blot驗證的結(jié)果證明該蛋白具有良好的免疫原性。

3討論與結(jié)論

羊支原體性肺炎（MPGS）在山羊和綿羊中廣泛流行，是一種危害嚴(yán)重的疾病，Mille為MPGS的重要病原之一，其僅僅感染山羊，大量研究表明，目前Mmc在中國多個省份的山羊養(yǎng)殖場中流行，給山羊養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失。

支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核微生物，對營養(yǎng)要求非常苛刻，需要在特殊培養(yǎng)基中才能生長，且生長緩慢，常需要培養(yǎng)3-7d，因此傳統(tǒng)的病原分離培養(yǎng)鑒定Mmc費時費力。絲狀支原體簇成員之間很高的同源性使得用傳統(tǒng)的血清學(xué)方法無法對其進行區(qū)分。目前對于Mmc特異性抗原的報道還比較少，已報道的特異性抗原基因有LPPA基因和由10個ORF串聯(lián)而成的麥芽糊精/麥芽糖（maltodextrin/maltose）基因，張玲等表達了LPPA融合基因，并驗證其有良好的免疫原性和反應(yīng)性，但未見其應(yīng)用于檢測方法研究的報道。儲岳峰等利用MmcPG3株經(jīng)超聲波破碎處理后的產(chǎn)物致敏經(jīng)戊二醛和鞣酸處理過的綿羊紅細(xì)胞，建立了檢測Mmc抗體的間接血凝試驗方法，該方法可將Mmc與綿羊肺炎支原體和布魯氏桿菌區(qū)分，但對同源性更為相近的絲狀支原體簇成員的血清學(xué)檢測方法尚未見報道。

本研究基于對Mmc-3740基因的分析，成功構(gòu)建了pET-28a-3740重組表達質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中，通過優(yōu)化條件，使其在大腸桿菌中獲得大量表達，表達的融合蛋白大小約為21ku，不同濃度的分離膠的最佳分離范圍不同，根據(jù)預(yù)測的重組蛋白的大小，本試驗選用的分離膠濃度為12%，濃縮膠為5%，分離效果良好。將菌體超聲破碎離心后進行SDS-PAGE電泳分析，在沉淀與上清液中都含有目的蛋白條帶，主要為包涵體表達且有較高的表達量。本試驗主要用鎳離子螯合柱對pET-28a表達的帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白進行可逆性的親和結(jié)合而使重組蛋白達到分離純化;將純化后重組蛋白免疫小鼠制備重組Mmc-3740蛋白陽性血清，通過Western-blot驗證發(fā)現(xiàn)二者間可以發(fā)生反應(yīng)，證明Mmc-3740基因所表達的蛋白具有良好的免疫原性，與之前抗原性預(yù)測的結(jié)果一致。本研究在BL21（DE3）宿主菌內(nèi)成功表達了Mmc-3740重組蛋白，為進一步研究Mmc-3740蛋白的功能特性奠定了基礎(chǔ)，也為研究和篩選新的Mmc特異性蛋白提供了參考。