張?jiān)娨?，?楠，黃 攀，周 穎，徐寶才，李沛軍*

（農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

威寧火腿是貴州著名的傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，至今已有600多年的歷史。威寧火腿由高原瘦肉型良種“烏金豬”后腿加工而成，該豬腿部肌肉緊實(shí)，肌纖維質(zhì)量高，為威寧火腿的加工提供了上乘的原料[1]。目前，威寧火腿仍延用家庭作坊式模式，于每年冬至后開(kāi)始制作，采用自然發(fā)酵法生產(chǎn)。自然發(fā)酵中的微生物主要來(lái)源于原料肉及周圍環(huán)境，火腿中微生物種類復(fù)雜且易受到有害微生物的污染，因此產(chǎn)品質(zhì)量受環(huán)境影響較大，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致發(fā)酵過(guò)程的失敗，引起火腿腐敗變質(zhì)[2]。

在現(xiàn)代發(fā)酵肉制品加工工藝中，使用人工接種來(lái)控制生產(chǎn)過(guò)程已經(jīng)成為一種趨勢(shì)[3]。與自然發(fā)酵相比，人工接種發(fā)酵不僅能保持產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、縮短發(fā)酵時(shí)間，還能保證產(chǎn)品安全性，統(tǒng)一生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期[4-5]。因此，分離、鑒定威寧火腿中的有益微生物就顯得至關(guān)重要。本研究以威寧火腿為研究對(duì)象，使用劃線培養(yǎng)法對(duì)其中的微生物進(jìn)行分離并鑒定，同時(shí)對(duì)其耐鹽、耐亞硝酸鹽和耐低溫特性進(jìn)行研究，以期揭示威寧火腿中優(yōu)勢(shì)微生物分布，為實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)理論依據(jù)；同時(shí)，可擴(kuò)充我國(guó)肉用益生菌菌種庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

成熟期1 年的威寧火腿，購(gòu)于威寧彝族回族苗族自治縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，樣品置于放有冰袋的保溫箱中低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

亞硝酸鈉 山東煙臺(tái)佳晶食品工業(yè)有限公司；氯化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司；革蘭氏染液 北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

甘露醇氯化鈉瓊脂（mannitol salt agar，MSA）液體培養(yǎng)基（牛肉浸膏5.0 g、?蛋白胨10.0 g、D-甘露醇10.0 g、氯化鈉75.0 g、酚紅1.5 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 7.4f0.2，121 ℃滅菌20 min） 自制；MRS肉湯液體培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

向上述液體培養(yǎng)基中各添加15.0 g/L瓊脂，得到相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。MSA固體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、麥芽汁固體培養(yǎng)基分別用于葡萄球菌、乳酸菌、酵母菌的分離培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

AC2-4S1生物安全柜 新加坡藝思高科技有限公司；H1650-W微量臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；721G可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；YX280/15手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；BSD-250培養(yǎng)箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；JY系列電子天平 上海衡平儀器儀表廠；Tanon 1600蛋白核酸檢測(cè)儀 上海天能科技有限公司；DYY-6D電泳儀 北京六一生物科技有限公司；SCIENTZ 09無(wú)菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴(kuò)增儀 美國(guó)Bio-Rad公司；C-HGFI Nikon Intensilight熒光顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌刀從威寧火腿表層和內(nèi)部1.0～2.0 cm處分別切取5 g樣品，放入盛有25 mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌袋中。將無(wú)菌袋放入無(wú)菌均質(zhì)器中拍打30 s，得均質(zhì)液備用。

1.3.2 菌株的分離純化

取上述均質(zhì)液加入到無(wú)菌生理鹽水中適度稀釋后，吸取200 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基、MSA固體培養(yǎng)基和麥芽汁固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取單菌落，采用平板劃線法進(jìn)行劃線培養(yǎng)，重復(fù)操作直至獲得純種培養(yǎng)物。將純化后菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，于4 ℃保存。

1.3.3 菌種鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌落形態(tài)特征分析：觀察并記錄菌落的表面形貌、色澤、透明度等特征。

個(gè)體形態(tài)特征分析：挑取細(xì)菌菌體進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢；酵母菌通過(guò)水浸片法觀察[6]，記錄菌體細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3.2 DNA序列鑒定

參照細(xì)菌、酵母基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取細(xì)菌、酵母基因組DNA，并于－20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。?xì)菌16S rRNA基因采用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增：上游引物27F（5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’），下游引物1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。酵母菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列擴(kuò)增通用引物為：上游引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’），下游引物ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）[7-8]。PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：Taq PCR Master Mix 25 μL、模板DNA 2 μL、引物各2 μL、無(wú)菌ddH2O 19 μL，混勻30 s。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，使用BLAST對(duì)基因的同源性進(jìn)行分析，獲取與目的基因序列同源性較高不同種序列。使用MEGA-X軟件構(gòu)建Neighbor-Joinging系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[9-10]，同時(shí)綜合考慮菌株菌落特征和菌體形態(tài)，確認(rèn)菌株名稱。

1.3.4 微生物特性研究

1.3.4.1 耐鹽特性

吸取活化3 代后的菌液200 μL，分別接種于NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、6%和9%的選擇性液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，以未接種培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。細(xì)菌、酵母經(jīng)10 h培養(yǎng)后，測(cè)定培養(yǎng)液在600 nm波長(zhǎng)處的光密度（optical density，OD600nm）[11]。

1.3.4.2 耐亞硝酸鹽特性

吸取活化3 代后的菌液200 μL，接種于NaNO2添加量分別為0、150 mg/kg的選擇性液體培養(yǎng)基中[12]，37 ℃培養(yǎng)，其中前者為對(duì)照組。細(xì)菌、酵母經(jīng)10 h培養(yǎng)后測(cè)定培養(yǎng)液的OD600nm。耐受系數(shù)定義為實(shí)驗(yàn)組OD600nm與對(duì)照組OD600 nm之比[13]。

1.3.4.3 耐低溫特性

吸取活化3 代后的菌液200 μL，接種于選擇性液體培養(yǎng)基中，于4 ℃條件下培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)組設(shè)為對(duì)照組。細(xì)菌、酵母經(jīng)10 h培養(yǎng)后測(cè)定培養(yǎng)液的OD600nm。耐受系數(shù)為實(shí)驗(yàn)組OD600nm與對(duì)照組OD600nm之比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Statistix 8.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，使用Origin 2017軟件作圖。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 威寧火腿中微生物的分離與鑒定

對(duì)威寧火腿中的優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行分離純化，共得到10 株菌，分別編號(hào)為WN1～WN10，通過(guò)形態(tài)學(xué)分析和DNA序列分析，鑒定威寧火腿中微生物的種類。

2.1.1 形態(tài)學(xué)分析

表1 威寧火腿中分離菌株的菌落特征及菌體形態(tài)Table 1 Colony and cell morphology of the isolated strains

由表1可知：分離純化得到的8 株細(xì)菌均為革蘭氏陽(yáng)性（G+）菌，菌落形態(tài)圓整，邊緣整齊，成對(duì)、成堆或成葡萄狀排列；2 株酵母菌菌落大而厚，表面光滑，呈卵圓形，均有酒香。

圖1為細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢圖像，圖2為酵母菌鏡檢圖像。

2.1.2 DNA序列鑒定

提取獲得各菌株基因組DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖3可知，樣品WN1～WN8擴(kuò)增產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為1 500 bp，樣品WN9、WN10擴(kuò)增產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為500 bp，且擴(kuò)增條帶清晰、明亮可見(jiàn)。所有條帶分子質(zhì)量大小符合理論預(yù)期。

利用N C B I數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)分離菌株的D N A序列進(jìn)行BLAST分析，確定菌種鑒定結(jié)果。由表2可知，威寧火腿的10 個(gè)分離菌株中包括4 株馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、2 株木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、2 株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、1 株變平滑假絲酵母菌（Candida metapsilosis）和1 株近平滑假絲酵母菌（Candida parapsilosis）。

對(duì)比國(guó)內(nèi)三大火腿，宣威火腿最顯著的特點(diǎn)是表面存在大量耐鹽的G+菌，其優(yōu)勢(shì)菌群包括葡萄球菌和微球菌[14]。黃艾祥[15]發(fā)現(xiàn)，云南干腌火腿中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要有馬胃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌和變異微球菌等，其中葡萄球菌是云腿加工過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌。樣品中檢出的酵母菌數(shù)量相對(duì)較少，經(jīng)分離鑒定主要有紅酵母、德巴利酵母、漢遜酵母、誕沫假絲酵母、彎假絲酵母及隱球酵母。蔣云升等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在如皋火腿的自然發(fā)酵過(guò)程中，球菌、桿菌、酵母菌是優(yōu)勢(shì)菌群。余翔[17]研究發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)代化發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的金華火腿中，細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種為乳酸菌，其次為葡萄球菌；在真菌方面，內(nèi)部占優(yōu)勢(shì)的酵母菌主要是歐諾比假絲酵母、白色布勒擲孢酵母等。國(guó)外著名腌制火腿中，Jamon Iberico火腿發(fā)酵成熟過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌包括葡萄球菌屬和微球菌屬，從Parma火腿表面樣品中可以分離出乳球菌屬細(xì)菌，從內(nèi)部樣品可以分離出耐鹽菌[18-19]。Virgili等[20]從Italian火腿表面分離得到12 株酵母菌，經(jīng)鑒定屬于德巴利酵母屬、假絲酵母屬和漢森酵母屬。

本研究分離鑒定得到的大多數(shù)微生物在上述國(guó)內(nèi)外火腿（宣威火腿、如皋火腿、金華火腿、Jamon Iberico火腿、Parma火腿、Italian火腿）中較為常見(jiàn)，如馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌和乳酸片球菌。但也有幾種微生物，如變平滑假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌，報(bào)道比較少，這可能是由于在不同生產(chǎn)環(huán)境下，不同火腿中的微生物種類存在差異。2004年，近平滑假絲酵母菌被確立為種水平上的新分類單元[21]。梁慧等[22]從傳統(tǒng)臘魚(yú)中分離篩選得到2 株產(chǎn)香酵母，其中1 株為近平滑假絲酵母菌。郭壯等[23]從生膜牛肉醬中分離到4 株變平滑假絲酵母菌，并且發(fā)現(xiàn)它們能使牛肉醬產(chǎn)膜，其在火腿中的作用有待進(jìn)一步研究。

2.2 威寧火腿中分離微生物的特性研究

從分離得到的5 種菌中各選擇1 株代表菌株（WN1、WN5、WN7、WN9、WN10），開(kāi)展耐鹽、耐亞硝酸鹽和耐低溫特性研究。

2.2.1 耐鹽特性研究

耐鹽能力是選擇發(fā)酵肉制品發(fā)酵劑的一個(gè)重要因素，對(duì)發(fā)酵肉制品的感官質(zhì)量和生物安全性有重要影響。篩選出的菌株要求能夠在至少6%的食鹽含量下正常生長(zhǎng)[24-25]。因此，研究鹽含量對(duì)5 株菌生長(zhǎng)的影響。

由圖4可知，隨著培養(yǎng)基NaCl含量的增加，各菌株的生長(zhǎng)量均呈下降趨勢(shì)。各菌株在NaCl含量為3%時(shí)生長(zhǎng)量最大，表明高NaCl含量會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)。其中，乳酸片球菌WN7在6% NaCl含量下生長(zhǎng)量顯著下降（P＜0.05），降幅超過(guò)60%。當(dāng)NaCl含量增加到9%時(shí)，木糖葡萄球菌WN5基本停止生長(zhǎng)，馬胃葡萄球菌WN1、變平滑假絲酵母菌WN9和近平滑假絲酵母菌WN10的生長(zhǎng)量有所下降但仍能生長(zhǎng)，故耐鹽性較好。

潘明[26]從如皋火腿中分離、純化得到耳式葡萄球菌、表皮葡萄球菌和木糖葡萄球菌3 種葡萄球菌，結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的NaCl能夠促進(jìn)3 種葡萄球菌的生長(zhǎng)，其中耳式葡萄球菌的耐鹽性最強(qiáng)，當(dāng)NaCl含量達(dá)到8%時(shí)才對(duì)其有抑制作用，木糖葡萄球菌的耐鹽性稍差，但在12% NaCl含量下依然能夠生長(zhǎng)，其耐鹽特性超過(guò)馬胃葡萄球菌WN1。

2.2.2 耐亞硝酸鹽特性研究

肉制品生產(chǎn)過(guò)程中，亞硝酸鈉是重要添加劑。肉類工業(yè)中，通常要求菌株在150 mg/kg的亞硝酸鈉條件下可良好生長(zhǎng)[27]。因此，研究添加亞硝酸鈉對(duì)5 株菌生長(zhǎng)的影響。

由圖5可知，在亞硝酸鈉含量為150 mg/kg的培養(yǎng)基中，5 株菌均可生長(zhǎng)。其中，馬胃葡萄球菌WN1的耐受系數(shù)接近于1.00，表明其生長(zhǎng)幾乎不受亞硝酸鹽添加的影響，耐亞硝酸鹽能力顯著高于其他菌株（P＜0.05）；木糖葡萄球菌WN5、乳酸片球菌WN7和近平滑假絲酵母菌WN10在亞硝酸鈉添加量為150 mg/kg時(shí)生長(zhǎng)有所抑制，但耐受系數(shù)均能達(dá)到0.70以上，耐亞硝酸鹽能力次之；而變平滑假絲酵母菌WN9的耐受系數(shù)最低（0.62），對(duì)亞硝酸鹽的耐受力最差。

李欣蔚等[28]研究劍門(mén)火腿中葡萄球菌、乳酸菌在亞硝酸鹽添加量為150 mg/kg時(shí)的生長(zhǎng)量，結(jié)果表明，5 株菌均具有一定的耐亞硝酸鹽特性，其中葡萄球菌（S-1、S-2和S-3）對(duì)亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的耐受性，而乳酸菌（L-1和L-2）的耐受性相對(duì)較弱。潘明[26]從如皋火腿分離、純化得到的耳式葡萄球菌、表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌和德巴利漢遜酵母均有較好的耐亞硝酸鹽特性，其中葡萄球菌耐亞硝酸鹽性最好。與本研究結(jié)果一致。

2.2.3 耐低溫特性研究

溫度在發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。通常情況下，發(fā)酵肉制品的腌制溫度為4 ℃，最適發(fā)酵溫度為25～30 ℃[29]。此外，中式火腿制作周期較長(zhǎng)，其腌制工序一般不少于40 d。因此，本研究探討低溫（4 ℃）對(duì)5 株菌生長(zhǎng)的影響。

由圖6可知，在培養(yǎng)溫度降低至4 ℃時(shí)，5 個(gè)菌株均能維持一定的生長(zhǎng)量，但不同菌株受低溫的影響程度存在顯著差異（P＜0.05）。3 株細(xì)菌的耐受系數(shù)分別為0.40、0.04和0.12，故細(xì)菌對(duì)低溫的耐受力依次為馬胃葡萄球菌WN1＞乳酸片球菌WN7＞木糖葡萄球菌WN5，其中馬胃葡萄球菌WN1的耐受系數(shù)明顯高于其他細(xì)菌，耐低溫性最好。在4 ℃培養(yǎng)溫度下，變平滑假絲酵母菌WN9和近平滑假絲酵母菌WN10的耐受系數(shù)最高，分別為0.55和0.60，表明其在低溫條件下依然能較好地生長(zhǎng)。

劉曉強(qiáng)[30]從云南火腿中分離得到1 株變異微球菌和2 株木糖葡萄球菌，這3 株菌均能耐受6% NaCl和150 mg/kg亞硝酸鹽。用MRS培養(yǎng)基分離得到2 株戊糖片球菌和2 株清酒乳桿菌，也均能耐受6% NaCl和150 mg/kg亞硝酸鹽，但是均不耐低溫。本研究篩選得到的木糖葡萄球菌WN5能耐受6% NaCl和150 mg/kg亞硝酸鹽但不耐低溫，與劉曉強(qiáng)[30]研究結(jié)果相一致；而乳酸片球菌WN7與其相比耐鹽性較差。

3 結(jié) 論

從威寧火腿中分離出10 株微生物，經(jīng)過(guò)菌落特征、個(gè)體形態(tài)分析以及DNA序列鑒定，最終確定為5 種菌，分別為馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌、乳酸片球菌、變平滑假絲酵母和近平滑假絲酵母。其中，馬胃葡萄球菌WN1、變平滑假絲酵母菌WN9和近平滑假絲酵母菌WN10耐鹽性較好，乳酸片球菌WN7耐鹽性稍差，而木糖葡萄球菌WN5在9% NaCl含量下幾乎不能生長(zhǎng)。馬胃葡萄球菌WN1對(duì)亞硝酸鈉含量為150 mg/kg的培養(yǎng)基耐受力最好，平滑假絲酵母菌WN9的耐受力最差。在4 ℃培養(yǎng)溫度下，變平滑假絲酵母菌WN9和近平滑假絲酵母菌WN10的耐低溫能力顯著高于其他菌株，細(xì)菌中馬胃葡萄球菌WN1的耐受系數(shù)最高。因此，馬胃葡萄球菌WN1和近平滑假絲酵母菌WN10耐鹽、耐亞硝酸鹽和耐低溫能力較好，能夠適應(yīng)不同外部環(huán)境。

本研究揭示了威寧火腿中細(xì)菌和酵母的組成及特性，擴(kuò)充了肉制品有益菌菌種庫(kù)，為后續(xù)肉制品發(fā)酵劑的本土化研究和開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。而在威寧火腿發(fā)酵過(guò)程中，微生物對(duì)火腿風(fēng)味等品質(zhì)的影響還有待進(jìn)一步研究。