李繼洋 胡 燕 姚 瑞 代培紅 劉曉東

基于優(yōu)化sgRNA系統(tǒng)提高海島棉CRISPR/Cas9基因組編輯功效的研究

李繼洋1,2,**胡 燕1,**姚 瑞2代培紅1,*劉曉東1,*

1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆烏魯木齊 830052;2石河子大學(xué)生命科學(xué)院, 新疆石河子 832000

CRISPR/Cas9基因組編輯體系已經(jīng)在多種作物中被建立, 其最大的優(yōu)勢在于能簡單高效定向創(chuàng)制突變體。然而, CRISPR/Cas9基因組編輯體系在實(shí)際操作過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)沒有編輯的情況, 或者靶向編輯目的基因的同時(shí)也會(huì)引發(fā)不同程度的脫靶效應(yīng), 這對CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的運(yùn)用帶來不利影響。本研究基于前期在海島棉體細(xì)胞中建立的CRISPR/Cas9基因組編輯體系, 通過對構(gòu)建Cas9不同密碼子優(yōu)化方式、不同PAM位點(diǎn)個(gè)數(shù)和不同靶位點(diǎn)數(shù)量的編輯載體, 來分析比較編輯效率和脫靶效應(yīng)的差異。結(jié)果表明, 2種Cas9密碼子不同優(yōu)化方式的編輯載體產(chǎn)生的編輯效率和脫靶效應(yīng)無顯著差異; 優(yōu)化后的雙PAM位點(diǎn)的編輯效率顯著高于單PAM位點(diǎn), 且脫靶效率顯著較低; 大部分雙靶序列編輯效率均高于單靶序列且脫靶效率較低。上述研究結(jié)果為今后優(yōu)化CRISPR/Cas9介導(dǎo)的海島棉基因組編輯體系奠定了重要的理論依據(jù)。

棉花; CRISPR/Cas9; 編輯效率; 脫靶效率; sgRNA類型

目前, CRISPR/Cas9基因組編輯體系已經(jīng)在多種作物中被建立[1], 然而對轉(zhuǎn)基因后代靶位點(diǎn)突變情況檢測發(fā)現(xiàn), 部分物種存在低編輯效率、同義突變等現(xiàn)象[2], 尤其在擬南芥等植物中, 轉(zhuǎn)基因后代還往往伴隨高頻脫靶效應(yīng)[2-3]。影響CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯效率的因素主要源于組成其系統(tǒng)的2個(gè)重要元件(Cas9和sgRNA)。前人研究發(fā)現(xiàn), 密碼子不同優(yōu)化程度的Cas9核酸酶對編輯效率和脫靶效應(yīng)都具有一定的影響[4-5]。負(fù)責(zé)招募Cas9的sgRNA包含一段約20 nt的guide RNA, 是引導(dǎo)Cas9靶向切割基因組的重要組成部分, guide RNA的特異性也決定了其脫靶效率[6-7]。

脫靶效應(yīng)是指由于引導(dǎo)核酸酶的向?qū)NA (gDNA)或RNA (gRNA)在對基因組靶標(biāo)序列識(shí)別的過程中出現(xiàn)了差錯(cuò), 使得核酸酶在與guide RNA高度同源位點(diǎn)處對基因組雙鏈進(jìn)行切割, 從而造成非目標(biāo)位點(diǎn)突變。事實(shí)上, 這一現(xiàn)象并不僅存在于CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯, 鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)和類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)等基因組編輯技術(shù)或NgAgo介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)同樣存在脫靶效應(yīng)[8-11], 除此之外, 脫靶效應(yīng)也影響基因組編輯效率。因此, 靶向編輯效率和脫靶效應(yīng)是CRISPR/Cas9基因組編輯過程中1對相互對立的結(jié)果[12]。

CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)在突變體創(chuàng)制過程中表現(xiàn)出絕對優(yōu)勢, 但由于廣泛存在的脫靶效應(yīng), 使其在農(nóng)業(yè)育種研究工作中留下潛在隱患, 對與此相關(guān)的農(nóng)業(yè)分子育種工作造成負(fù)面影響。為了高效安全地使用這一技術(shù), 就必須采取有效手段, 在保證其靶向編輯效率的同時(shí)盡可能降低脫靶效率, 為選育用于種質(zhì)創(chuàng)新的低脫靶效應(yīng)的靶向突變體提供技術(shù)保障[13-14]。到目前為止已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室研究出提高基因組編輯效率和增加基因靶向特異性的方法。Cong等[15]構(gòu)建了Cas9核酸酶的一種變體Cas9 (D10A), 該變體Cas9只能切割單鏈DNA, 如果要產(chǎn)生雙鏈斷裂, 引發(fā)基因突變, 就必須在基因靶位點(diǎn)區(qū)結(jié)合2條sgRNA。實(shí)驗(yàn)證明, 上述方法能有效降低轉(zhuǎn)基因T1代的脫靶效應(yīng), 或采用基因組雙向編輯技術(shù)在目的基因靶位點(diǎn)被編輯的同時(shí)使Cas9也被編輯[16-17], 通過減少后代Cas9表達(dá)累積量降低脫靶效應(yīng)。

通過對驅(qū)動(dòng)Cas9蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子進(jìn)行改造及優(yōu)化, 能顯著提高編輯效率, 降低脫靶效應(yīng)。例如,選擇卵細(xì)胞特異性表達(dá)的啟動(dòng)子EC1.2p或EC1.1p替代常規(guī)的CAMV35S或類啟動(dòng)子, 可以在T1代就能獲得3個(gè)基因同時(shí)突變的純合體植株, 突變率高達(dá)8.3%, 進(jìn)一步用融合了這2個(gè)啟動(dòng)子關(guān)鍵元件的新啟動(dòng)子去驅(qū)動(dòng)Cas9蛋白的表達(dá), 可以獲得比單個(gè)啟動(dòng)子更高的突變效率, 并且這些突變體中均未檢測到脫靶效應(yīng)。DMC1在玉米愈傷組織中高表達(dá), 應(yīng)用DMC1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9, 也能顯著提高基因組編輯的效率, 并且獲得的突變體中也均未檢測到脫靶效應(yīng)[18]。除此之外, 增加PAM位點(diǎn)的長度也是一種減少脫靶效應(yīng)的策略。目前已經(jīng)從不同的細(xì)菌物種中分離得到不同的Cas9蛋白, 除SpCas9[19]識(shí)別NGG類的PAM位點(diǎn)外, 還有NmeCas9識(shí)別NNNNGATT[20]; SaCas9識(shí)別NNGRRT[21]; St1Cas9和St2Cas9分別識(shí)別NNAGAAW和NGGNG[22]。與SpCas9蛋白相比, 這些不同來源的Cas9均可以增加基因靶向的特異性, 減少脫靶效應(yīng)。CRISPR-Cpf1是一種V型核酸內(nèi)切酶, 與Cas9蛋白相比, CRISPR-Cpf1系統(tǒng)在動(dòng)植物應(yīng)用中表現(xiàn)出更低的或未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)[23]。除了上述不同來源的Cas9可以增加基因靶向的特異性, 減少脫靶效應(yīng)外, 在野生型SpCas9蛋白的基礎(chǔ)上, 篩選高特異性Cas9蛋白變異體的研究也取得了良好的結(jié)果, 如eSpCas9[5]、Cas9- HF[3]、evoCas9[24]、HypaCas9[25]和Sniper-Cas9[26]。其中evoCas9、HypaCas9和Sniper-Cas9不僅顯著增加了基因靶向的特異性, 同時(shí)也提高了基因的編輯效率。上述提高基因組編輯效率和增加基因靶向特異性的方法, 多集中在Cas9蛋白方面, 而從sgRNA入手的研究還鮮見報(bào)道。2015年在線蟲中研究發(fā)現(xiàn)與單個(gè)PAM位點(diǎn)相比, 連續(xù)2個(gè)PAM位點(diǎn)可以顯著提高基因的編輯效率, 但脫靶率是否也同步提高并不清楚[27]。

在植物中, CRISPR/Cas9系統(tǒng)在擬南芥、水稻應(yīng)用較為廣泛, 但在棉花[28-29]中CRISPR/Cas9系統(tǒng)的報(bào)道還較少見, 其中在海島棉中還未見有報(bào)道能高效表達(dá)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。海島棉的組織再生存在體細(xì)胞胚胎發(fā)育困難、轉(zhuǎn)化期長、效率低等一些問題, 并且有研究發(fā)現(xiàn)陸地棉經(jīng)Cas9編輯后, 組織再生的過程中有大量的體細(xì)胞變異會(huì)影響編輯效率[28], 這對初步構(gòu)建海島棉CRISPR/Cas9基因組編輯增進(jìn)了困難, 因此, 使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法快速驗(yàn)證構(gòu)建的CRISPR/Cas9基因組編輯載體的有效性是最佳的方法。本研究在基于前期海島棉原生質(zhì)體中建立的CRISPR/Cas9基因組編輯體系[30], 針對Cas9表達(dá)量和sgRNA的優(yōu)化設(shè)計(jì), 對比轉(zhuǎn)化不同sgRNA個(gè)數(shù)和不同類型sgRNA對基因組編輯效率和脫靶效應(yīng)的影響進(jìn)行了初步分析和試驗(yàn)來驗(yàn)證上述假設(shè)。以期為今后利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)進(jìn)行精確的分子設(shè)計(jì)育種奠定一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

新海16胚性愈傷組織由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供, 用于制備海島棉原生質(zhì)體, 載體U6-4P::-sgRNA、U6-5P::-sgRNA、()(簡稱SK載體)、pUC19均由本實(shí)驗(yàn)室保存, 2種不同密碼子優(yōu)化的基因(和)分別由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所惠贈(zèng), 限制性內(nèi)切酶和DNA聚合酶均為NEB和Thermo公司產(chǎn)品, 纖維素酶和離析酶由IUZMI株式會(huì)社提供, 引物合成及測序由武漢昆泰瑞有限公司(新疆分公司)完成。

1.2 海島棉編輯載體構(gòu)建

1.2.1 基礎(chǔ)載體構(gòu)建 以新海16基因組DNA為模板克隆獲得和基因部分序列用于靶序列設(shè)計(jì), 靶序列的設(shè)計(jì)除滿足其基本要求外[29], 選擇在和基因組CDS區(qū)域不超過20 bp長度任意片段的3￠末端含有連續(xù)2個(gè)5￠NGG3￠(N代表任意堿基)位點(diǎn)的區(qū)域, 分別設(shè)計(jì)包含2個(gè)NGG位點(diǎn)(No shift sgRNA)和包含1個(gè)NGG (Shift sgRNA)位點(diǎn)的sgRNA序列, 引物序列如表1, 靶序列設(shè)計(jì)模式如圖1。

將經(jīng)過DNA復(fù)性反應(yīng)后的靶序列分別連接于以I酶切獲得的U6-4P::-sgRNA和U6-5P::-sgRNA線性化載體。退火反應(yīng)體系為20 μL, 包括10 μmol L-1的上下游靶序列各10 μL。復(fù)性程序?yàn)?5℃至20℃, 每5 s降低0.5℃。經(jīng)測序驗(yàn)證上述(shift)U6-4P(5P)::-sgRNA和(shift)U6-4P::-sgRNA2質(zhì)粒構(gòu)建正確后備用。

表1 本研究使用的引物信息

圖1 No shift sgRNA和Shift sgRNA靶序列特點(diǎn)及其作用模式

紅框標(biāo)識(shí)為CRISPR/Cas9作用的PAM位點(diǎn)。

The red box identifies the PAM site for the action of CRISPR/Cas9.

1.2.2 編輯載體組裝 以I、I酶切U6-5P::-sgRNA1載體, 同時(shí)以IdIII酶切U6-4P::-sgRNA2和U6-4P::- sgRNA2載體, 以I、dIII酶切pUC19載體, 三片段連接構(gòu)建U6-5P::-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2-pUC19-U6-5P::-sgRNA1-U6-4P:sgRNA2-pUC19過渡載體, 以I、dIII酶切上述過渡載體和Cas9-I編輯載體, 構(gòu)建U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9-I和U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9-I編輯載體(圖2-A)。以I、dIII酶切U6-5P::-sgRNA1載體, 同時(shí)以I、d III酶切U6-4P::-sgRNA2和U6-4P::-sgRNA2載體, 以I、I酶切SK載體, 3個(gè)片段連接構(gòu)建U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- SK和U6-5P::-SgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- SK過渡載體, 以I、I酶切上述過渡載體和Cas9II編輯載體, 構(gòu)建U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9II和U6-5P::-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2-Cas9II編輯載體(圖2-B), 以U6- 5P::-sgRNA1-Cas9-I和U6-5P::-sgRNA1- Cas9II及其連接2種基因不含靶序列U6- 5P(4P):: sgRNA為對照。構(gòu)建Shift sgRNA類型編輯載體方法同上。

圖2 海島棉基因組編輯載體結(jié)構(gòu)示意圖

A: 含Cas9I編輯載體; B: 含Cas9II編輯載體。

A: editing vector containing Cas9I; B: editing vector containing Cas9II.

1.3 海島棉原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化

1.3.1 富集編輯載體核心片段 經(jīng)酶切檢測正確的編輯載體利用富集引物(Cas9I編輯載體采用FJ-1引物, Cas9II編輯載體采用FJ-2引物), 采用超保真DNA聚合酶(北京全式金)擴(kuò)增編輯載體的核心區(qū)域, 擴(kuò)增體系參照說明書推薦反應(yīng)體系, PCR產(chǎn)物純化參照本實(shí)驗(yàn)室已有成熟體系[29], 純化后的PCR產(chǎn)物用雙蒸水溶解并調(diào)整濃度至0.5~1.0 μg μL-1,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化 取新海16擴(kuò)繁培養(yǎng)約15 d的胚性愈傷組織, 利用本實(shí)驗(yàn)室建立的改良CPW雙酶法制備原生質(zhì)體[31]。取10 μg富集的PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體, 方法參照擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法[32], 過程略有改進(jìn)(懸浮原生質(zhì)體不使用MMG溶液), 為獲得較高轉(zhuǎn)化率, 本研究在原有成熟體系基礎(chǔ)上優(yōu)化了海島棉胚性愈傷組織與酶解液最適反應(yīng)比例(每毫升酶解液加入約0.45 g海島棉胚性愈傷組織), 轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體于28℃, 50 r min-1避光孵育48 h。

1.4 內(nèi)源靶基因編輯效應(yīng)檢測

將孵育48 h的原生質(zhì)體懸浮液以1000 ×離心1 min, 去盡上清, 用于提取原生質(zhì)體沉淀的基因組DNA, 方法參照Trans Easypure plant Genomic DNA Kit (北京全式金)說明書要求。除轉(zhuǎn)化U6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I和U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9II載體提取的基因組DNA直接用相應(yīng)的Test引物(Test-sg1F和Test-sgR)進(jìn)行PCR擴(kuò)增外, 轉(zhuǎn)化其余編輯載體提取的基因組DNA采用先酶切后PCR方式檢測, PCR體系共20 μL, 包含ddH2O 11.2 μL、5×Phusion buffer 4 μL、2.5 mmol L-1dNTP 1.6 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL、Phusion超保真DNA 聚合酶0.2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 2 min; 98℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 4 min 30 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃ 7 min。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)EasyPure Quick Gel Extraction Kit (北京全式金)回收后, 連接(北京全式金)載體, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans T1, 經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定正確后, 將鑒定正確的單克隆菌液進(jìn)行序列測定, 測序序列采用DNAstar和DNAMAN軟件進(jìn)行比對分析, 統(tǒng)計(jì)基因組靶序列20 bp區(qū)域堿基突變個(gè)數(shù)并計(jì)算相應(yīng)區(qū)域堿基突變頻率, 通過計(jì)算得到編輯效率, 利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析, 對比每種類型編輯載體轉(zhuǎn)化Shift sgRNA和NO shift sgRNA靶序列類型對應(yīng)的單靶序(U6-5P::- sgRNA1)以及雙靶序(U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2)編輯效率差異的顯著性。

1.5 脫靶效率分析

根據(jù)設(shè)計(jì)的Guide RNA序列, 瀏覽華中農(nóng)業(yè)大學(xué)CRISPR sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http://crispr.hzau.edu. cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)[6], 尋找本研究設(shè)計(jì)使用的-sgRNA1和Shift-sgRNA1靶序列, 并分別預(yù)測得到脫靶率較高的2種靶序列(表2), 利用該序列, 登錄中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花基因組數(shù)據(jù)庫(https:// cgp.genomics.org.cn/), 通過BLAST獲得每條預(yù)測的脫靶序列對應(yīng)的同源序列, 再通過Mapping View將上述核苷酸序列定位到具體的染色體進(jìn)而獲得涵蓋該脫靶序列的基因組序列, 設(shè)計(jì)用于檢測脫靶率的引物(表3)。

表2 脫靶序列預(yù)測信息

加粗部分為靶序列PAM位點(diǎn)。Bold part shows the target sequence PAM sites.

表3 脫靶序列檢測引物信息

以上述轉(zhuǎn)化不同編輯載體核心片段原生質(zhì)體提取的基因組DNA為模板, 擴(kuò)增獲得涵蓋脫靶序列的片段, 克隆該序列, 方法參照編輯效應(yīng)分析方法, 將菌落PCR鑒定正確的單克隆菌液進(jìn)行序列測定, 測序序列采用DNAstar軟件進(jìn)行比對分析, 統(tǒng)計(jì)基因組涵蓋脫靶序列20 bp區(qū)域中堿基突變個(gè)數(shù)并計(jì)算相應(yīng)區(qū)域堿基突變頻率, 利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析, 對比分別轉(zhuǎn)化Shift sgRNA和No shift sgRNA靶序列類型對應(yīng)的單靶序列和雙靶序列目標(biāo)片段脫靶效率的差異是否具有顯著性。

1.6 sgRNA及其Cas9表達(dá)分析

收集轉(zhuǎn)化后孵育48 h的原生質(zhì)體, 參照Biospin Plant Total RNA Extration Kit (DNA-free)試劑盒(Bioer Technology Co, Ltd.)說明書立即提取總RNA, 將質(zhì)檢合格用于合成cDNA第1條鏈的總RNA質(zhì)量調(diào)整至1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 方法參照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (北京全式金)試劑盒說明書, 將合成的cDNA用于、-sgRNA1、-sgRNA2、-sgRNA2半定量RT-PCR檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 編輯載體的構(gòu)建

采用雙酶切方式(IdIII)檢測上述構(gòu)建的編輯載體, 酶切結(jié)果符合預(yù)期設(shè)計(jì), 證明分別連接不同的U6-5P--sgRNA1、U6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2和U6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2的編輯載體均構(gòu)建成功(圖3)。連接Shift相關(guān)靶序列的上述編輯載體鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。

2.2 原生質(zhì)體制備

基于前期本實(shí)驗(yàn)室建立的較成熟的原生質(zhì)體制備體系, 轉(zhuǎn)化前后原生質(zhì)體形態(tài)如圖4, 經(jīng)計(jì)算每毫升轉(zhuǎn)化前原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)到約4×106個(gè)左右, 鏡檢視野內(nèi), 原生質(zhì)體未出現(xiàn)明顯畸形或破壁現(xiàn)象, 表明制備的原生質(zhì)體能夠用于編輯效率、脫靶效率以及半達(dá)量RT-PCR的檢測分析。

2.3 編輯效率結(jié)果分析

2.3.1 海島棉基因組編輯檢測分析 將轉(zhuǎn)化U6-5P--sgRNA1和轉(zhuǎn)化U6-5P::- sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2提取的基因組DNA采用酶切(I、I)后PCR方式檢測, 轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2采用直接PCR方式檢測, 結(jié)果如圖5, 轉(zhuǎn)化Cas9 I型靶序列編輯載體的原生質(zhì)體DNA酶切后PCR檢測存在擴(kuò)增條帶, 對照則未出現(xiàn)明顯條帶, 初步證明, 轉(zhuǎn)化U6-5P--sgRNA1和轉(zhuǎn)化U6-5P::- sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2編輯載體造成海島棉基因組相應(yīng)的靶位點(diǎn)突變, 將上述PCR產(chǎn)物克隆后測序結(jié)果(圖6和圖7)分析發(fā)現(xiàn), 所有轉(zhuǎn)化靶序列的原生質(zhì)體均檢測到堿基突變現(xiàn)象, 轉(zhuǎn)化與之對應(yīng)空載體的原生質(zhì)體未檢測到堿基突變現(xiàn)象, 對比轉(zhuǎn)化不同載體的原生質(zhì)體, 雖然靶序列作用位點(diǎn)相同, 但引發(fā)堿基突變的個(gè)數(shù)和位置均不同。分析后認(rèn)為, 可能是轉(zhuǎn)化不同編輯載體引起不同程度編輯效應(yīng)造成的結(jié)果。針對轉(zhuǎn)化Shift相關(guān)靶序列的基因組編輯載體, 也獲得與上述相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 相比同一位點(diǎn)2種(No shift sgRNA和shift sgRNA)不同靶序列類型, 轉(zhuǎn)化No Shift靶序列的原生質(zhì)體其編輯效率高于轉(zhuǎn)化Shift靶序列, 增幅為20.0%~49.6% (表4)。轉(zhuǎn)化Cas9II型編輯載體結(jié)果與上述類似。

圖3 海島棉編輯載體酶切檢測結(jié)果

A:U6-5P--sgRNA1編輯載體酶切檢測結(jié)果; M1為1 kb plus marker。B: 1和2分別為U6-5P::-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2和U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2編輯載體酶切檢測結(jié)果; M2為2 kb plus II marker。

A:U6-5P--sgRNA 1 editing vector digestion test results; M1 is 1 kb plus marker. B:U6-5P::-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2 andU6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2 edit vector restriction test results; M2 is 2 kb plus II marker.

圖4 海島棉原生質(zhì)體制備及其轉(zhuǎn)化結(jié)果

A: 海島棉轉(zhuǎn)化前原生質(zhì)體鏡檢結(jié)果; B: 海島棉轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I載體后原生質(zhì)體鏡檢結(jié)果。標(biāo)尺為40 μm。

A: microscopic examination ofL. protoplast before transformation; B: after protoplast microscopy results transformation ofU6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I vector. Bar = 40 μm.

圖5 海島棉轉(zhuǎn)化不同靶序列編輯效應(yīng)檢測結(jié)果

A: 1為轉(zhuǎn)化U6-5P--sgRNA1-Cas9I載體酶切前直接PCR擴(kuò)增結(jié)果, 2為轉(zhuǎn)化U6-5P--sgRNA1-Cas9I載體酶切后PCR擴(kuò)增結(jié)果, 3為轉(zhuǎn)化U6-5P-sgRNA1-Cas9I載體酶切前直接PCR擴(kuò)增結(jié)果, 4為轉(zhuǎn)化U6-5P-sgRNA1-Cas9I載體酶切后PCR擴(kuò)增結(jié)果。B: 1為轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I直接PCR擴(kuò)增結(jié)果, 2為轉(zhuǎn)化U6-5P-sgRNA1-U6-4P-sgRNA2- Cas9I直接PCR擴(kuò)增結(jié)果。C: G1、E1為轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I酶切前直接PCR擴(kuò)增結(jié)果, G2、E2為轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I酶切后PCR擴(kuò)增結(jié)果, G3、E3為轉(zhuǎn)化U6-5P-sgRNA1-U6-4P- sgRNA2-Cas9I酶切前直接PCR擴(kuò)增結(jié)果, G4、E4為轉(zhuǎn)化U6-5P-sgRNA1-U6-4P-sgRNA2-Cas9I酶切后PCR擴(kuò)增結(jié)果。M1為1 kb plus marker, M2為2 kb plus II marker。

A: 1 is the result of direct PCR before transformation ofU6-5P--sgRNA1-Cas9I vector, 2 is PCR amplification after transformation ofU6-5P--sgRNA1-Cas9I vector As a result, 3 was obtained by direct PCR amplification before transformation ofU6-5P-sgRNA1- Cas9I vector and 4 was PCR amplification after transformation withU6-5P-sgRNA1-Cas9I vector. B: 1 was transformed withU6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I direct PCR amplification results, 2 for the transformation ofU6-5P-sgRNA1-U6- 4P-sgRNA2-Cas9I direct PCR amplification results. C: G1 and E1 are the results of direct PCR before transformation ofU6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I, G2 and E2 are the results of transformation ofU6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9 digestion after PCR amplification results, G3 and E3 to transformU6-5P-sgRNA1-U6-4P-sgRNA2-Cas9I digestion before direct PCR amplification results, G4 and E4 to transformU6-5P-sgRNA1-PCR amplification results afterU6-4P-sgRNA2-Cas9 digestion. M1 is 1 kb plus marker, M2 is 2 kb plus II marker.

圖6 海島棉轉(zhuǎn)化不同類型靶序列堿基突變測序結(jié)果

A: 轉(zhuǎn)化U6-5P--sgRNA1-Cas9I載體靶位點(diǎn)編輯效應(yīng)測序檢測結(jié)果; B: 轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9I載體靶位點(diǎn)編輯效應(yīng)測序檢測結(jié)果; C: 轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I載體靶位點(diǎn)編輯效應(yīng)測序檢測結(jié)果; D: 轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I載體-sgRNA2靶位點(diǎn)編輯效應(yīng)測序檢測結(jié)果; E: 轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I載體-sgRNA1靶位點(diǎn)編輯效應(yīng)測序檢測結(jié)果。紅色框?yàn)镻AM位點(diǎn)的位置。

A: Transformation ofU6-5P--sgRNA 1-Cas9I vector target site editing effect sequencing detection results; B: TransformationU6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I vectortarget site editing effect sequencing detection results; C:U6-5P::- sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I vectortarget site editing sequencing results; D: transformationU6-5P:-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2-Cas9I vector-sgRNA2 target site editing effect sequencing test results; E: transformationU6-5P::-sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA2-Cas9I vector-sgRNA1 target site editing effect sequencing test results. The red box is the location of the PAM site.

圖7 海島棉轉(zhuǎn)化不同類型靶序列堿基突變部分測序峰圖

A: 轉(zhuǎn)化U6-5P--sgRNA1-Cas9I靶序列基因組堿基突變測序峰圖; B: 轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9I靶序列基因組堿基突變測序峰圖; C: 轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I靶序列基因組堿基突變測序峰圖。

A: baseline mutation map of genomes transformed withU6-5P--sgRNA1-Cas9I target sequence; B: transformation ofU6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I target sequence; C: baseline mutation sequencing of the genome of transformedU6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I target sequence.

表4 轉(zhuǎn)化不同靶序列編輯效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表格中分子代表突變個(gè)數(shù), 分母代表克隆測序個(gè)數(shù); 概率值均為平均值。

The number of molecules in the table represents the number of mutations, and the denominator represents the number of clones; the probabi-lity values are the average.

2.3.2 Cas9及其相關(guān)sgRNA表達(dá)量檢測 半定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)化靶序列和對照編輯載體原生質(zhì)體中Cas9及其對應(yīng)sgRNA表達(dá)量, 結(jié)果如圖8, 在轉(zhuǎn)化包括對照編輯載體的原生質(zhì)體中, Cas9和相應(yīng)sgRNA表達(dá)量均無明顯差異, 表明不同載體轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中Cas9和相應(yīng)sgRNA表達(dá)量均無明顯差異。

2.4 脫靶效應(yīng)檢測結(jié)果

對轉(zhuǎn)化不同類型靶序列編輯載體的海島棉基因組進(jìn)行脫靶率鑒定后發(fā)現(xiàn), 在海島棉原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)的基因組編輯過程中也存在一定概率的脫靶現(xiàn)象(圖9、圖10和圖11), 轉(zhuǎn)化不同類型靶序列的編輯載體, 脫靶效應(yīng)存在差異, 這說明不同類型靶序列對海島棉基因組編輯效應(yīng)影響不同, 對比編輯效率較高的靶序列類型發(fā)現(xiàn)其脫靶效率并未相應(yīng)升高, 同時(shí)對比轉(zhuǎn)化單靶序列和雙靶序列類型的編輯載體,其脫靶效率同樣存在差異且轉(zhuǎn)化單靶序列脫靶效率高于雙靶序列(表5), 同時(shí), 轉(zhuǎn)化No shift sgRNA靶序列脫靶率顯著低于Shift sgRNA (表5)。

3 討論

3.1 靶序列類型對編輯效率影響

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)已在各種動(dòng)物、植物、微生物和人中得到了廣泛的應(yīng)用。但基因編輯的脫靶效應(yīng)和編輯效率低, 甚至常常不編輯的現(xiàn)象也引起了科學(xué)家們的關(guān)注。一系列提高基因編輯效率和增加基因靶向特異性的方法陸續(xù)研發(fā)出來, 這些方法多集中在Cas9蛋白方面[19-26], 而從sgRNA入手的研究還鮮見報(bào)道。在線蟲中研究發(fā)現(xiàn), 與單個(gè)NGG的PAM位點(diǎn)(Shift)相比, 連續(xù)2個(gè)NGG位點(diǎn)(No shift)可以顯著提高基因的編輯效率。那么在植物體內(nèi)No shift是否也能顯著提高基因的編輯效率？為此本文開展了相關(guān)的研究工作。根據(jù)在3個(gè)基因靶位點(diǎn)、5組獨(dú)立的轉(zhuǎn)化編輯實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示, 在海島棉原生質(zhì)體內(nèi)優(yōu)化后, No shift編輯效率較對應(yīng)的Shift的編輯效率有所提高, 提高幅度為20.0%~49.6%。這與在秀麗隱桿線蟲中報(bào)道的結(jié)果相似[33], 只是提高的幅度低于線蟲。連續(xù)2個(gè)NGG位點(diǎn)(No shift)可以顯著提高基因的編輯效率, 推測No shift sgRNA類型靶序列引導(dǎo)Cas9發(fā)揮基因組編輯時(shí), Cas9在確定最適作用位點(diǎn)時(shí)需要在基因組的作用區(qū)域發(fā)生滑動(dòng), 該過程類似于RNA聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子的過程[34-35], 連續(xù)的NGG堿基組成相當(dāng)于雙PAM結(jié)構(gòu), 可能增加了Cas9識(shí)別切割位點(diǎn)的效率, 從而使得Cas9-sgRNA-DNA編輯復(fù)合體更穩(wěn)定, 編輯效率也因此更高。另外在對編輯效率統(tǒng)計(jì)時(shí)還發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)化不同類型雙靶序列編輯效率均高于單靶序列, 原因可能是更多的DNA雙鏈斷裂激活了細(xì)胞體內(nèi)的錯(cuò)誤傾向修復(fù)的SOS應(yīng)急反應(yīng), 使細(xì)胞有了更高的突變率[36]。但該結(jié)論還需要進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)規(guī)模來驗(yàn)證。Cas9和相應(yīng)sgRNA的表達(dá)量在不同載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)沒有明顯差異, 表明出現(xiàn)的編輯效率的差異不是因?yàn)榛虮磉_(dá)差異引起的, 而是因?yàn)閟gRNA的選擇不同。

圖8 轉(zhuǎn)化海島棉不同類型靶序列的原生質(zhì)體Cas9及對應(yīng)sgRNA半定量檢測結(jié)果

1、2分別為轉(zhuǎn)化U6-5P--sgRNA1-Cas9I和對照編輯載體檢測-sgRNA1, 3、4為U6-5P--sgRNA1-U6-4P--sgRNA2-Cas9I編輯載體分別檢測-sgRNA1、- sgRNA2, 5、6為轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9I分別檢測-sgRNA1、-sgRNA2, 7為轉(zhuǎn)化與U6-5P-sgRNA1-4P-sgRNA1Cas9I對照編輯載體檢測- sgRNA1。

1 and 2 is transformedU6-5P--sgRNA1-Cas9I edit vector and Control edit vector were detected-sgRNA1, 3 and 4 is transformedU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA1- Cas9I edit vector were detected-sgRNA1,-sgRNA2, 5 and 6 is transformedU6-5P--sgRNA1-U6-4P::- sgRNA2-Cas9I edit vector were detected-sgRNA1,- sgRNA2, 7 is transformedU6-5P-sgRNA1-4P-sgRNA1-Cas9I control edit vector were detected-sgRNA1.

圖9 海島棉脫靶目標(biāo)序列擴(kuò)增檢測

轉(zhuǎn)化No shift sgRNA類型靶序列: 1、2分別為轉(zhuǎn)化U6-5P--sgRNA1-Cas9I和對照編輯載體, 3、4為U6-5P--U6-4P-sgRNA1--sgRNA2-Cas9I和對照編輯載體, 5、6為轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2 -Cas9I和對照編輯載體。轉(zhuǎn)化Shift sgRNA類型靶序列: 1、2分別為轉(zhuǎn)化ShiftU6-5P--sgRNA1-Cas9I和對照編輯載體, 3、4為ShiftU6-5P--U6-4P-sgRNA1--sgRNA2- Cas9I和對照編輯載體, 5、6為轉(zhuǎn)化ShiftU6-5P::- sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I和對照編輯載體。

Transform No shift sgRNA type target sequence: 1 and 2 is transformedU6-5P--sgRNA1-Cas9I edit vector and Control edit vector, 3 and 4 is transformedU6-5P--sgRNA1-U6- 4P::-sgRNA1-Cas9I edit vector and Control edit vector, 5 and 6 is transformedU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9I edit vector and Control edit vector. Transform Shift sgRNA type target sequence: 1 and 2 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-Cas9I edit vector and Control edit vector, 3 and 4 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA1- Cas9I edit vector and Control edit vector, 5 and 6 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I edit vector and Control edit vector.

3.2 靶序列類型對脫靶效率影響

對轉(zhuǎn)化不同類型靶序列后脫靶效應(yīng)測序統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)化雙靶序列脫靶效率顯著低于單靶序列, 推測上述原因, 一方面, 由轉(zhuǎn)化不同數(shù)量靶序列結(jié)果分析, 轉(zhuǎn)化雙靶序列進(jìn)行基因組編輯時(shí), 由于Cas9在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量基本相似(從Cas9半定量RT-PCR結(jié)果可以得出), Cas9核酸酶在同一細(xì)胞內(nèi)需同時(shí)編輯2個(gè)基因組位點(diǎn), 相比單一位點(diǎn)基因組編輯(轉(zhuǎn)化一個(gè)靶序列類型), Cas9作用更加分散, 冗余性更低, 在發(fā)揮基因組編輯效應(yīng)時(shí), 雙靶序列對Cas9蛋白的競爭作用強(qiáng)于單靶序列, 作用于脫靶靶序列的Cas9蛋白效應(yīng)相比單靶序列更弱, 因此造成的脫靶效率相應(yīng)較低。另一方面, No shift sgRNA類型靶序列在設(shè)計(jì)過程中選擇3￠末端帶有連續(xù)“NGG”結(jié)構(gòu)作為候選靶序列, 使得No shift sgRNA靶序列與基因組匹配特異性較Shift sgRNA靶序列類型特異性提高約16倍(基因組具有連續(xù)5￠-NGG-3￠結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)數(shù)目少于單一NGG結(jié)構(gòu)), 同時(shí)由No shift sgRNA靶序列產(chǎn)生的脫靶序列與基因組匹配度特異性降低了約256倍, No shift sgRNA靶序列與基因組匹配度提高有利于增強(qiáng)sgRNA與基因組結(jié)合穩(wěn)定性, 同時(shí)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)sgRNA表達(dá)量仍處于同一水平(從sgRNA半定量RT-PCR結(jié)果可以得出), 因此編輯效率也相應(yīng)提高, 從降低脫靶效率角度, No shift sgRNA靶序列對避免脫靶的貢獻(xiàn)率更加顯著。

圖10 海島棉脫靶目標(biāo)序列突變檢測

A: OTtest-SG1-2引物檢測; 1為轉(zhuǎn)化ShiftU6-5P-- sgRNA1-Cas9I編輯載體, 2為ShiftU6-5P--U6-4P- sgRNA1--sgRNA2-Cas9I編輯載體, 3為轉(zhuǎn)化ShiftU6- 5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I編輯載體。 B: OTtest-G1-2引物檢測; 1為轉(zhuǎn)化U6-5P--sgRNA1-Cas9I編輯載體, 2為U6-5P--U6-4P-sgRNA1--sgRNA2- Cas9I編輯載體, 3為轉(zhuǎn)化U6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I編輯載體。C: OTtest-SG1-1引物檢測; 1為轉(zhuǎn)化ShiftU6-5P--sgRNA1-Cas9I編輯載體, 2為ShiftU6-5P--U6-4P-sgRNA1--sgRNA2-Cas9I編輯載體, 3為轉(zhuǎn)化ShiftU6-5P::-sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9I編輯載體。

A: OTtest-SG1-2 primer detection; 1 is transformed ShiftU6- 5P--sgRNA1-Cas9I edit vector, 2 is transformed ShiftU6- 5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA1-Cas9I edit vector, 3 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9I edit vector. B:OTtest-G1-2 primer detection; 1 is transformedU6-5P--sgRNA1-Cas9I edit vector, 2 is transformedU6- 5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA1-Cas9I edit vector, 3 is transformedU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2-Cas9I edit vector. C: OTtest-SG1-2 primer detection; 1 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-Cas9I edit vector, 2 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA1-Cas9I edit vector, 3 is transformed ShiftU6-5P--sgRNA1-U6-4P::-sgRNA2- Cas9I ditvector.

圖11 海島棉脫靶目標(biāo)序列測序峰圖

A、B、C分別為OTtest-SG1-2、OTtest-G1-2、OTtest-SG1-1引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)化下圖對應(yīng)載體得到的目標(biāo)片段測序結(jié)果。紅框標(biāo)識(shí)為堿基突變位點(diǎn)。

A, B, and C are OTtest-SG1-2, OTtest-G1-2, and OTtest-SG1-1 primers to transform the sequencing result of the target fragment amplified by the corresponding vector in the figure below, respectively. The red box identifies the base mutation site.

表5 轉(zhuǎn)化不同靶序列脫靶效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

長期以來, 棉花功能基因組學(xué)研究由于缺乏適宜創(chuàng)制突變體的方法, 使得對棉花功能基因挖掘及其分子育種工作都造成嚴(yán)重影響。棉花遺傳轉(zhuǎn)化由于操作困難, 受基因型影響限制了棉花功能基因組學(xué)研究工作。CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的出現(xiàn)為棉花功能基因組學(xué)研究拓寬了思路, 有利于針對性地創(chuàng)制棉花突變體。隨著該技術(shù)在近幾年發(fā)展逐漸趨于成熟, CRISPR/Cas9技術(shù)也正如當(dāng)初人類基因組計(jì)劃, 可以暢想, CRISPR/Cas9技術(shù)也必將呈現(xiàn)出一個(gè)以高效、精準(zhǔn)、高通量基因編輯為代表的后基因組編輯時(shí)代。然而目前, 棉花基因組編輯研究面臨著與擬南芥等物種相同的現(xiàn)象, 如何在棉花中實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)高效的基因組編輯, 需要對CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化, 提高編輯效率, 降低脫靶效率, 本研究為利用CRISPR/Cas9技術(shù)對棉花功能基因組學(xué)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)化不同類型雙靶序列編輯效率大部分顯著高于單靶序列(轉(zhuǎn)化-sgRNA1--sgRNA2和Shift-sgRNA1--sgRNA2差異不顯著), 其對應(yīng)的脫靶效率較單靶序列均有所降低, 轉(zhuǎn)化No shift sgRNA類型靶序列編輯效率顯著高于轉(zhuǎn)化Shift sgRNA。

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Enhancing CRISPR/Cas9 genomic editing efficiency based on optimization of sgRNA ofL.

LI Ji-Yang1,2,**, HU Yan1,**, YAO Rui2, DAI Pei-Hong1,*, and LIU Xiao-Dong1,*

1Agricultural College, Xinjiang Agricultural University / Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China;2Life Sciences College, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang, China

The CRISPR/Cas9 genome editing system has been established in many crops. The advantages of its directional creation of mutants are increasingly favored by researchers. However, the CRISPR/Cas9 genome editing technology targets the editing of the target gene and also triggers off-target effects at different frequencies, which determine the reliability of the genome editing system. This study was based on the previous CRISPR/Cas9 genome editing system established in the island-cotton somatic cells. Edit the vector by constructing different codon optimization methods for Cas9, different numbers of PAM sites and different target sites, and the difference in editing efficiency and off-target effect were analyzed and compared. There was no significant difference in editing effects and off-target effects caused by Cas9-edited vectors with different optimal codons. The partially double-sgRNA had significantly higher editing efficiency and significantly lower off-target efficiency than the single sgRNA; the editing efficiency of the transformed No shift sgRNA target sequence was significantly higher than that of the Shift sgRNA and the former had a significant decrease in off-target efficiency relative to the latter. Therefore, using No shift sgRNA type target sequence can effectively improve the editing efficiency and significantly reduce the off-target efficiency, thus laying a theoretical foundation for optimizing the CRISPR/Cas9mediated island cotton genome editing system and accurately and efficiently creating island cotton functional gene mutants in the future.

cotton; CRISPR/Cas9; editing efficiency; off-target efficiency; sgRNA type

本研究由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)-新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合基金項(xiàng)目(KYYJ201603)和新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科發(fā)展基金項(xiàng)目資助。

This study was supported by the Nanjing Agricultural University-Xinjiang Agricultural University Joint Fund Project (KYYJ201603) and Xinjiang Agricultural University Crop Science Key Discipline Development Fund Project.

劉曉東, E-mail: xiaodongliu75@aliyun.com; 代培紅, E-mail: 40836520@qq.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

lijiyangbio@163.com; 胡燕, E-mail: 532084683@qq.com

2018-10-16;

2019-05-12;

2019-05-31.

10.3724/SP.J.1006.2019.84130

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190530.1035.006.html