陳穎婷，何柯新，王云秀，何 敏△,鄭智明

(1.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120；2.廣州市惠愛醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510108)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)(RA)在臨床上未能明確其發(fā)病機(jī)制，但是作為全身性、慢性、涉及身體免疫功能的疾病，具有高風(fēng)險(xiǎn)致殘率，嚴(yán)重威脅現(xiàn)代人的生活。RA易引起侵襲性、對(duì)稱性、小關(guān)節(jié)多關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生，臨床表現(xiàn)多樣復(fù)雜[1-2]。西藥多采用非甾體抗炎藥、改善病情的抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素和生物藥物進(jìn)行治療，治療期間需要長(zhǎng)期堅(jiān)持并與其他藥物聯(lián)合使用，由于RA病情的復(fù)雜性，導(dǎo)致用藥時(shí)需要多方位聯(lián)合用藥，較為麻煩，很難長(zhǎng)期堅(jiān)持，不利于患者的病情發(fā)展[3-4]。中醫(yī)遵循辨證論治，從多角度治療RA，認(rèn)為RA的發(fā)生與正氣、營(yíng)衛(wèi)及風(fēng)寒濕三者相關(guān)，多采用扶正祛邪、活血養(yǎng)陰、祛風(fēng)除濕等中藥進(jìn)行治療。雷公藤是在臨床上對(duì)RA具有肯定療效的中藥，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛、消腫止痛、解毒殺蟲等功效，其中的有效成分環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物——雷公藤內(nèi)酯醇，實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抗炎和免疫抑制的作用，但關(guān)于其治療機(jī)制的研究仍需深入研究[5-6]。本研究通過Toll-樣受體4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路和炎癥表現(xiàn)為切入點(diǎn)，觀察雷公藤內(nèi)酯醇的藥效，并探索其具體作用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)： SYXK(粵)2013-0001。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，LDZ5-2 型離心機(jī)購(gòu)自北京離心機(jī)廠，RM2015 型切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Media Cybernetics公司。

1.2.2試劑 雷公藤內(nèi)酯醇購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，雙氯芬酸鈉腸溶片(批準(zhǔn)文號(hào)H11021540)購(gòu)自北京諾華制藥有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司，熱殺死結(jié)核分枝桿菌購(gòu)自Difco實(shí)驗(yàn)室。大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-6 ELISA法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳寶安康生物公司。TLR-4 抗體(批號(hào)：dw253469)、NF-κB(p65)抗體(批號(hào)：dw016352)、p-NF-κB(p65)抗體(批號(hào)：ap160988)均購(gòu)自Abcam公司。Trizol(批號(hào)：122041)購(gòu)自 Invitrogen 公司。Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(批號(hào)：AK3711)、SYBR Premix Ex TaqTM(批號(hào)：AKA2451)均購(gòu)自 Takara 公司。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組 24只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，保持25 ℃室溫和75%濕度，將動(dòng)物隨機(jī)分成空白對(duì)照組、RA模型組、陽性藥雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組，每組6只。

1.3.2RA大鼠模型制作 RA模型組、陽性藥雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠腹腔注射10%水合氯醛全身麻醉后，固定到手術(shù)臺(tái)上，呈現(xiàn)仰臥位，固定頭部及四肢。在已消毒的大鼠尾根部皮下注射0.2 mL熱殺死結(jié)核分枝桿菌(5 mg/mL)，然后用消毒棉球壓住注射部位，防止藥物滲出和止血。注射位置不滲液后，松開固定的繩子和板，放于籠中讓其自然蘇醒和自由活動(dòng)。

1.3.3給藥 造模成功后，陽性藥雙氯芬酸組大鼠給予雙氯芬酸(10 mg/kg)灌胃，每日1次；雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠給予雷公藤內(nèi)酯醇(6 mg/kg)灌胃，每日1次；空白對(duì)照組和RA模型組大鼠給予等量0.9%生理鹽水灌胃，每日1次，共給藥3周。

1.3.4炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平檢測(cè) 灌胃3周后，乙醚輕麻醉大鼠，取各組大鼠眼底靜脈叢血漿1 mL，通過低溫高速離心機(jī)設(shè)定4 ℃，10 000 r/min離心10 min，取上清液。按照大鼠TNF-α、IL-4、IL-6 ELISA試劑盒的說明書操作，于酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、測(cè)定的A值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，公式計(jì)算血清TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平。

1.3.5關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足體積測(cè)量 利用四肢的病變程度累積計(jì)分，計(jì)算出關(guān)節(jié)炎指數(shù)。若無紅腫，得0分；小趾關(guān)節(jié)輕度紅腫，得1分；小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹，得2分；踝關(guān)節(jié)以下的趾甲腫脹，得3分；包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部趾甲、關(guān)節(jié)腫脹，得4分。每4天評(píng)價(jià)1次，共觀察20 d。用足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠的足體積，每4天測(cè)量1次。共觀察20 d。

1.3.6TLR4、NF-κB、p-NF-κB免疫組織化學(xué)檢測(cè) 取各組大鼠受試部位膝關(guān)節(jié)滑膜組織，進(jìn)行固定切片，切片進(jìn)行脫蠟、入水、熱修復(fù)抗原后，冷卻至25 ℃室溫，PBS洗滌3次，加入封閉液，室溫放置20 min后，先后滴加一抗(稀釋比例為1∶100)和二抗生物素化(IgG)，并在切片上依次加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)、DAB顯色、蘇木素輕度復(fù)染，并進(jìn)行脫水、透明、封片，運(yùn)用圖象分析管理系統(tǒng)分析，計(jì)算出平均A值。

1.3.7受試關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4 mRNA檢測(cè) 取各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織各100 mg，通過Trizol試劑盒提取總RNA，經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀確認(rèn)無污染，逆轉(zhuǎn)錄，采用TakaRa公司的Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒及SYBR Premix Ex TaqTM合成模板cDNA和擴(kuò)增目的基因cDNA片段，TLR4上游引物5′-CTC ACA AAC TCA GTG GCT GGA TTT A,下游引物3′-GTC TGG TCC CAC CAG ATT CTC，179 bp；GAPDH上游引物5′-GAC ATG AAT GGC ATC GTG GA，下游引物3′-ATG CAG GGA TGA ACA ACT GG，142 bp。擴(kuò)增結(jié)束后以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt公式計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1血清炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組相比，RA模型組血清中 TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與RA模型組比較，陽性藥雙氯芬酸組血清中TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平下降(P<0.05)，且雷公藤內(nèi)酯醇組TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著下降(P<0.01)。見表1。

2.2大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足體積比較 造模后，大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹和組織浸潤(rùn)，形成高透明度。與RA模型組比較，雷公藤內(nèi)酯醇組在第8、12、16、20 天時(shí)關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足體積降低(P<0.05)，陽性藥雙氯芬酸組在第12、16、20 d時(shí)關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足體積降低(P<0.05)。見表2、3。

2.3各組TLR4、NF-κB、p-NF-κB免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較 與空白對(duì)照組比較，RA模型組TLR4、NF-κB、p-NF-κB 蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。與RA模型組比較，陽性藥雙氯芬酸組滑膜組織中TLR4、 NF-κB蛋白表達(dá)量下降(P<0.05)，雷公藤內(nèi)酯醇組膜組織中TLR4、NF-κB、p-NF-κB 蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。見表4。

表1 各組炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平結(jié)果比較

注：與空白組比較，**P<0.01；與RA模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

注：與RA模型組比較，#P<0.05

表3 各組大鼠足體積比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與RA模型組比較，#P<0.05

表4 各組TLR4、NF-κB、p-NF-κB免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(平均A值)比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與RA模型組比較，#P<0.05

2.4各組TLR4 mRNA 檢測(cè)結(jié)果比較 與空白對(duì)照組比較，RA模型組TLR4 mRNA表達(dá)量升高(0.62±0.02vs. 1.00±0.00，P<0.05)；與RA模型組比較，陽性藥雙氯芬酸組(0.68±0.01)和雷公藤內(nèi)酯醇組(0.71±0.03)TLR4 mRNA表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)。

3 討 論

雷公藤內(nèi)酯醇是雷公藤的主要活性成分之一，是一個(gè)具有多種生物活性的天然產(chǎn)物，來源于中藥雷公藤的根。近年來，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇做了大量研究，提示雷公藤內(nèi)酯醇具有較為顯著的抗炎作用，尤其是對(duì)RA有非常好的功效，能顯著減輕骨關(guān)節(jié)疼痛、恢復(fù)關(guān)節(jié)功能、改善關(guān)節(jié)部位的組織液滲出性等[7-9]。本研究通過建立RA大鼠模型，對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足體積觀察，與RA模型組比較，雷公藤內(nèi)酯醇組在第8、12、16、20 天時(shí)關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足體積降低(P<0.05)，表明雷公藤內(nèi)酯醇可以顯著改善RA的病癥，對(duì)RA治療作用顯著，與其他研究結(jié)果相一致。

Toll樣受體(TLRs)是Ⅰ類跨膜蛋白的受體家族，它能夠識(shí)別病原相關(guān)分子，并介導(dǎo)固有免疫應(yīng)答。而TLR4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的TLRs，外來刺激因子與TLR4受體綁定是激活固有免疫系統(tǒng)的第一步，經(jīng)過一系列磷酸化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使NF-κB定植于細(xì)胞核，啟動(dòng)一系列炎性介質(zhì)的釋放，其中包括TNF-α、IL-4、IL-6等促炎性細(xì)胞因子[10]。近來發(fā)現(xiàn)，TLRs在自身免疫性疾病，特別是RA的發(fā)病中有重要作用[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)TLR4的表達(dá)明顯增加，并與RA嚴(yán)重程度的評(píng)分密切相關(guān)；在關(guān)節(jié)周圍也存在一些可以被TLR4識(shí)別的病原體相關(guān)模式分子[13-15]。熊小泉等[16]通過對(duì)AIA大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)的研究，證明機(jī)體固有的先天性免疫系統(tǒng)參與了RA的病理過程。本研究結(jié)果也顯示，在RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中，與空白對(duì)照組比較，RA模型組中TLR4、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá)量和TLR4 mRNA表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)，提示RA與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)，表明TLR4及其介導(dǎo)的信號(hào)通路是RA發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)。

NF-κB為普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子，主要由p65和p50 2個(gè)亞單位結(jié)合成二聚體或異二聚體，其中P65為其主要功能亞單位，具有顯著促炎活性。激活的TLR4可激發(fā)IKB激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活NF-κB，從而啟動(dòng)與炎癥免疫有關(guān)的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-4、IL-6等基因的表達(dá)，最終產(chǎn)生大量TNF-α、IL-4、IL-6等炎性細(xì)胞因子。NF-κB能調(diào)節(jié)多種炎性基因的表達(dá)水平，與炎性反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[17]。國(guó)內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的表達(dá)與活性在RA中起重要作用，并且有研究表明，雷公藤內(nèi)酯醇通過抑制NF-κB的活性和表達(dá)，在RA中發(fā)揮治療作用[18-21]。那么，在RA中雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)NF-κB的上游信號(hào)通路TLR4/NF-κB調(diào)控如何呢？國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，與RA模型組比較，雷公藤內(nèi)酯醇組在RA大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平呈極顯著下降(P<0.01)，說明雷公藤內(nèi)酯醇可以降低炎性反應(yīng)對(duì)RA的損傷。并且與RA模型組比較，雷公藤內(nèi)酯醇組RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá)量和TLR4 mRNA表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)，表明雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路有抑制作用，并可能由此減輕炎性細(xì)胞因子對(duì)RA的炎性反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)RA大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平及滑膜組織中TLR4、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，RA與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。雷公藤內(nèi)酯醇可能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的信號(hào)因子表達(dá)，從而減少炎性因子的產(chǎn)生，減輕炎性反應(yīng)，起到治療RA的作用，為治療RA新藥開發(fā)提供新途徑。