向國(guó)艷，樊 佳，葉震璇，付 雪，張海燕，張 華,4△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)臨檢教研室，貴州貴陽(yáng) 550004；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州 646000；3.貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽(yáng) 550002；4.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550004)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是自身免疫性肝病中最常見(jiàn)的一種類(lèi)型，其以膽管上皮細(xì)胞被破壞、肝內(nèi)膽汁淤積為主要特征。該病好發(fā)于中老年女性，起病隱匿且病程較長(zhǎng)[1-2]。目前，PBC的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)是膽管上皮細(xì)胞破壞、膽汁淤積的主要原因之一，該原因也成為研究PBC致病機(jī)制的關(guān)鍵點(diǎn)。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLRP3)是參與固有免疫應(yīng)答的受體之一。最新報(bào)道，gasdermin D(GSDMD)蛋白裂解后得到的N端結(jié)構(gòu)域可能是激活NLRP3炎性小體的關(guān)鍵物質(zhì)[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-1和白細(xì)胞介素(IL)-18參與了PBC細(xì)胞免疫炎性反應(yīng)[5-6]，但是對(duì)于其上游的調(diào)控蛋白NLRP3及與NLRP3激活相關(guān)的GSDMD在PBC中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)PBC患者及體檢健康者NLRP3與GSDMD的mRNA和蛋白表達(dá)水平、血漿中Caspase-1和IL-18的表達(dá)水平，探討NLRP3炎性小體及其上游激活蛋白GSDMD與PBC免疫炎性反應(yīng)的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年11月至2017年9月貴州省人民醫(yī)院確診為PBC的患者(PBC組)及體檢健康者(健康對(duì)照組)，各30例。PBC組患者平均年齡為(58.27±13.61)歲，健康對(duì)照組平均年齡為(53.83±9.64)歲，兩組男女比例一致。該研究經(jīng)貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)(2017109)，并且所有患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除系統(tǒng)性自身免疫病、膽管炎、其他原因引起的肝臟疾病等。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)肝病學(xué)會(huì)(AASLD)于2009年推薦的診斷指南[7]。

1.2儀器與試劑 人外周血淋巴細(xì)胞分離液、DNA/RNA/蛋白共提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GreenⅡ試劑盒購(gòu)自索萊寶生物股份有限公司；GodViewⅡ核酸染料、Anti-NLRP3單克隆抗體、Anti-GSDMD單克隆抗體、β-actin單克隆抗體購(gòu)自Abcam生物有限公司。

1.3方法

1.3.1生化檢測(cè)和自身抗體譜檢測(cè) 收集受試者外周靜脈血3 mL，分離的血漿和血清分別用于自身抗體譜和肝功能檢測(cè)。間接免疫熒光法檢測(cè)抗線(xiàn)粒體抗體(AMA)，免疫印記法檢測(cè)抗線(xiàn)粒體M2型抗體(AMA-M2)，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能。

1.3.2外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的富集及RNA/蛋白的提取 收集納入研究者外周血3 mL于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中，3 500 r/min離心15 min分離血漿與血細(xì)胞，血細(xì)胞用于單個(gè)核細(xì)胞提取。通過(guò)Ficoll法分離PBMC，并取5×106個(gè)細(xì)胞用于RNA的提取。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA與蛋白，并經(jīng)微量核酸定量?jī)x檢測(cè)其水平與純度。使用凝膠成像儀檢測(cè)其完整性，28S/18S約等于2∶1且無(wú)DNA條帶時(shí)，說(shuō)明完整性較好。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得cDNA與蛋白保存于-20 ℃，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。采用q-PCR與Western blot分別檢測(cè)兩組PBMC中NLRP3與GSDMD的mRNA和蛋白的表達(dá)量。

1.3.3NLRP3及GSDMD的mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用Primer Premier 5.0與Oligo 6軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。NLRP3(155 bp)上游引物 5′-GCC ACG CTA ATG ATC GAC TT-3′，下游引物5′-ACA GTG GGA TTC GAA ACA CG-3′；GSDMD(156 bp)上游引物 F:5′-GGA CCC TAA CAC CTG GCA GAC T-3′，下游引物5′-TTG TGG GTG CGC GTG ACT T-3′。應(yīng)用ABI7500 PCR 儀檢測(cè)目的基因。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算結(jié)果。

1.3.4NLRP3和GSDMD的蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 用BCA試劑盒測(cè)定蛋白水平后，以β-actin為內(nèi)參，依次進(jìn)行蛋白凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體等步驟，曝光采集圖片后通過(guò)Image J分析灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5Caspase-1與IL-18的表達(dá)水平檢測(cè) 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)多功能酶標(biāo)儀在450 nm/620 nm波長(zhǎng)處分別對(duì)PBC組與健康對(duì)照組外周血血漿中Caspase-1與IL-18進(jìn)行吸光度(A)值檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1AMA與AMA-M2檢測(cè) 30例PBC患者中AMA-M2均為陽(yáng)性(100.0%)，其中≥“++”有29例(96.7%)。AMA滴度≥1∶320有21例(70.0%)。而30例健康對(duì)照者AMA與AMA-M2均為陰性。在鼠腎基質(zhì)片中近曲小管和遠(yuǎn)曲小管可見(jiàn)明顯顆粒狀熒光。見(jiàn)表1、圖1。

2.2肝功能相關(guān)生化指標(biāo) 健康對(duì)照組的6項(xiàng)肝功能生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。PBC組6項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 PBC組AMA及AMA-M2的表達(dá)

2.3總RNA的純度及完整性 根據(jù)1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示28S/18S約為2∶1，有少量的5S RNA。微量核酸檢測(cè)儀結(jié)果顯示，所有的標(biāo)本在A260/A280的比值在1.9～2.0,說(shuō)明RNA的純度較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。10個(gè)樣本的電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.4NLRP3和GSDMD mRNA的表達(dá)情況 PBC組PBMC中NLRP3與GSDMD mRNA的表達(dá)水平分別為健康對(duì)照組的1.977倍和3.275倍(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：A表示AMA滴度為1∶320的示意圖(4×40倍)；B表示免疫印跡膜條示意圖

圖AMA熒光模型和免疫印跡模條

表2 肝功能相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；AKP表示堿性磷酸酶，γ-GT表示γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，ALT表示丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST表示天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，TBIL表示總膽紅素，DBIL表示直接膽紅素

圖2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

注:*P<0.05；A表示NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量；B表示GSDMD mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖3 NLRP3和GSDMD mRNA的相對(duì)表達(dá)情況

2.5NLRP3和GSDMD蛋白的表達(dá)水平 PBC組與健康對(duì)照組的NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為1.973 2±0.040 7與1.746 0±0.060 6，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PBC組與健康對(duì)照組的GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為2.885 3±0.059 6與2.206 0±0.081 5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

2.6Caspase-1和IL-18的表達(dá)水平 使用Caspase-1及IL-18 的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算得到R2值分別為0.998 9和0.999 7。PBC組與健康對(duì)照組血漿中Caspase-1的水平分別為(118.504±64.472)pg/mL與(63.935±27.284)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PBC組與健康對(duì)照組血漿中IL-18的水平分別為(439.326±180.101) pg/mL與(229.310±109.559)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖5。

注:*P<0.05;A表示NLRP3相對(duì)表達(dá)水平；B表示GSDMD相對(duì)表達(dá)水平；C表示W(wǎng)estern blot圖

圖4 NLRP3和GSDMD蛋白的相對(duì)表達(dá)情況

注:**P<0.01；A表示Caspase-1；B表示IL-18

圖5血漿中Caspase-1和IL-18的表達(dá)情況

3 討 論

PBC是一種免疫介導(dǎo)的肝內(nèi)小膽管漸進(jìn)性破壞、慢性膽汁淤積性肝臟疾病[1]。目前，PBC的發(fā)病機(jī)制仍不明確，可能是免疫、環(huán)境及遺傳等因素的相互作用[8]，發(fā)生針對(duì)自身抗原的免疫反應(yīng)，引起肝內(nèi)小膽管損傷和膽汁淤積而誘發(fā)PBC。對(duì)于PBC的診斷主要依據(jù)生化指標(biāo)如堿性磷酸酶(AKP)升高、血清AMA或AMA-M2陽(yáng)性、肝臟穿刺出現(xiàn)非化膿性破壞性膽管炎及小葉間膽管破壞的組織學(xué)證據(jù)[7]，符合以上3點(diǎn)中的2點(diǎn)即可確診。其中，血清中AMA-M2陽(yáng)性對(duì)該病的診斷有很高的特異度和靈敏度。然而對(duì)于AMA-M2陰性的患者，則需要進(jìn)行肝穿刺。鑒于肝穿刺可能會(huì)導(dǎo)致一些并發(fā)證，患者一般難以接受，因此，目前臨床上多以生化指標(biāo)AKP升高、血清AMA或AMA-M2陽(yáng)性來(lái)診斷PBC。AMA-M2檢測(cè)采用的是免疫印記法，該方法包被的抗原為高純化抗原，在方法學(xué)上有靈敏度和特異度的優(yōu)勢(shì)。因此，AMA-M2的檢出率一般都高于AMA，故間接免疫熒光法和免疫印記法聯(lián)用，可避免漏診和誤診。本研究中，30例PBC患者組AMA-M2陽(yáng)性有30例(100.0%)，而AMA滴度≥1∶320只有21例(70.0%)，該結(jié)果也符合AMA-M2檢出率更高的特點(diǎn)。

NLRP3炎性小體由NOD樣受體蛋白3、接頭分子凋亡相關(guān)蛋白(ASC)和效應(yīng)分子前體半胱氨酸酶1(Pro-Caspase-1)組成。在某些因素的誘導(dǎo)下，NLRP3炎性小體可通過(guò)ASC招募Pro-Caspase-1，使其形成Caspase-1 p10/p20四聚體的活性形式，Caspase-1進(jìn)一步將IL-1β和IL-18前體裂解為有活性的IL-1β和IL-18，從而參與炎性反應(yīng)并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[9-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-1、ASC和IL-18參與了PBC細(xì)胞免疫炎性反應(yīng)并發(fā)揮重要的作用[5-6]。因此，猜想其上游的NLRP3也可能參與了PBC的發(fā)生。本研究檢測(cè)了NLRP3、Caspase-1和IL-18的表達(dá)，結(jié)果表明NLRP3、Caspase-1和IL-18在PBC組中水平顯著增高，說(shuō)明在PBC患者體內(nèi)NLRP3基因轉(zhuǎn)錄增多，使蛋白表達(dá)增加。鑒于NLRP3炎性小體激活后，可活化其下游的Caspase-1和IL-18的成熟和釋放。推測(cè)在PBC患者體內(nèi)，NLRP3大量表達(dá)后促使下游炎性因子IL-18的釋放，IL-18可通過(guò)核因子κB通路刺激CD4+T細(xì)胞增殖分化為T(mén)h1 細(xì)胞，Th1細(xì)胞分泌γ-干擾素(IFN-γ)，而IFN-γ又可促進(jìn)IL-18的生成，如此惡性循環(huán)致使肝臟膽管炎癥發(fā)生。

目前，NLRP3的具體調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。以往認(rèn)為，NLRP3炎性小體主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流途徑、溶酶體途徑和活性氧生成途徑等被激活[11]。最新研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD的N端結(jié)構(gòu)域可能參與NLRP3炎性小體的激活。通常情況下，GSDMD的N端和C端結(jié)構(gòu)域相互抑制，使得GSDMD處于無(wú)活性的自抑制狀態(tài)[12]。炎性小體激活后可促使Caspase-1的成熟和分泌，成熟的Caspase-1通過(guò)水解GSDMD使其形成并釋放具有活性的N端結(jié)構(gòu)域[13]。本研究采用q-PCR和Western blot法檢測(cè)GSDMD mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示GSDMD水平在PBC患者PBMC中顯著升高，推測(cè)在PBC患者體內(nèi)，可能由于NLRP3基因轉(zhuǎn)錄增加活化了Caspase-1，從而促使大量GSDMD蛋白N端結(jié)構(gòu)域的形成和釋放。而N端結(jié)構(gòu)域又可以促使NLRP3進(jìn)一步活化，最終形成惡性循環(huán)的炎性反應(yīng)。大量炎癥因子攻擊膽管上皮細(xì)胞使其受損從而導(dǎo)致膽汁淤積，進(jìn)而促使肝纖維化甚至肝硬化[14]。

針對(duì)NLRP3炎性小體的調(diào)控可以不同程度緩解疾病進(jìn)程[15]，這預(yù)示著NLRP3炎性小體可能成為多種疾病治療的靶點(diǎn)。若能調(diào)控NLRP3炎性小體的活化，減少促炎性細(xì)胞因子的釋放，阻止疾病早期的炎性反應(yīng)，或許能對(duì)疾病起到一定的預(yù)防和緩解的作用。因此，對(duì)GSDMD與NLRP3在PBC發(fā)病中的作用進(jìn)行研究是十分必要的。

4 結(jié) 論

本研究證實(shí)，PBC患者NLRP3、GSDMD、Caspase-1和IL-18的表達(dá)均明顯高于健康對(duì)照者，在PBC患者體內(nèi)GSDMD的高表達(dá)激活NLRP3，間接促進(jìn)Caspase-1與IL-18的成熟和釋放導(dǎo)致炎性反應(yīng)發(fā)生。NLRP3、GSDMD可能參與了PBC的免疫炎性反應(yīng)。