陳靈 張相林 柳芳 周漢明

摘 要 目的：研究白藜蘆醇對缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠認知功能及沉默信息調節(jié)因子1（SIRT1）/核轉錄因子κB（NF- κB）信號通路的影響。方法：將SD新生大鼠隨機分為假手術組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）和白藜蘆醇低、高劑量組（30、60 mg/kg），每組12只，假手術組大鼠行假手術，其余各組大鼠采用Rice法建立缺氧缺血性腦損傷模型，建模成功后，各組大鼠每天腹腔注射相應藥物，連續(xù)給藥6周。采用水迷宮實驗分析各組大鼠空間學習記憶功能，記錄給藥1、3、6周后的逃避潛伏期和給藥6周后的穿臺次數(shù)。采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法觀察各組大鼠給藥6周后的腦組織梗死面積，Western blot方法檢測海馬組織CA1區(qū)內(nèi)凋亡相關蛋白B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）及其相關X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）表達和SIRT1/NF-κB通路相關蛋白SIRT1、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）表達。結果：與假手術組比較，模型組大鼠給藥1、3、6周后的逃避潛伏期明顯延長（P<0.05），給藥6周后的穿臺次數(shù)明顯減少（P<0.05），腦組織梗死面積明顯增加（P<0.05），海馬組織CA1區(qū)內(nèi)Bax、Caspase-3、p-NF-κB蛋白表達明顯增強，Bcl-2、SIRT1蛋白表達明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠給藥1、3、6周后的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），給藥6周后的穿臺次數(shù)明顯增加（P<0.05），腦組織梗死面積明顯減?。≒<0.05），海馬組織CA1區(qū)內(nèi)Bax、Caspase-3、p-NF-κB蛋白表達明顯降低，Bcl-2、SIRT1蛋白表達明顯增強（P<0.05），且高劑量組大鼠上述指標的改善效果明顯優(yōu)于低劑量組（P<0.05）。結論：白藜蘆醇可改善缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠認知功能障礙，其可能與SIRT1/NF-κB信號通路有關。

關鍵詞 缺氧缺血性腦損傷；白藜蘆醇；沉默信息調節(jié)因子1；核轉錄因子κB；認知功能；新生大鼠

Effects of Resveratrol on Cognitive Function and SIRT1/NF-κB Signaling Pathway in Neonatal Rats with Hypoxic-ischemic Brain Injury

CHEN Ling1，2，ZHANG Xianglin2，LIU Fang2，ZHOU Hanming1（1.Dept. of Pharmacy， Tongren Hospital of Wuhan University/Wuhan Third Hospital， Wuhan 430060， China；2.Dept. of Pharmacy， China-Japan Friendship Hospital， Beijing 100029， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of resveratrol （Res） on cognitive function and SIRT1/NF-κB signaling pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. METHODS： SD neonatal rats were randomly divided into sham operation group （normal saline）， model group （normal saline）， Res low-dose and high-dose groups （30， 60 mg/kg）， with 12 rats in each group. Except that sham operation group received sham operation， hypoxic-ischemic brain injury model was established by Rice method in other groups. After modeling， the rats were given relevant medicine intraperitoneally each day， for consecutive 6 weeks. Water maze test was used to analyze spatial learning and memory function of rats in each group. The escape latency after 1， 3 and 6 weeks of administration and the times of crossing platform after 6 weeks of administration were recorded. TTC staining was used to detect cerebral infraction area of rats after 6 weeks of medication. Western blot was used to detect the expression of Bcl-2， Bax， Caspase-3， SIRT1， SIRT1/NF-κB pathway related protein SIRT1 and p-NF-κB in hippocampal CA1 region. RESULTS： Compared with sham operation group， escape latency of rats was prolonged significantly in model group after 1， 3， 6 weeks of medication （P<0.05）， the times of crossing platform was decreased significantly after 6 weeks of medication （P<0.05）； the area of cerebral infarction was increased significantly （P<0.05）； the protein expression of Bax， Caspase-3 and p-NF-κB in hippocampus CA1 region were increased significantly， while the protein expression of Bcl-2 and SIRT1 were decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the escape latency of Res low-dose and high-dose groups were shortened significantly after 1， 3， 6 weeks of medication （P<0.05）， while the times of crossing platform was increased significantly after 6 weeks of medication （P<0.05）； the area of cerebral infarction was decreased significantly （P<0.05）， and the protein expression of Bax， Caspase-3 and p-NF-κB protein in hippocampal CA1 area were decreased significantly， while the protein expression of Bcl-2 and SIRT1 were increased significantly （P<0.05）. The improvement of above indexes in high-dose group were significantly better than low-dose group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Res can improve cognitive dysfunction in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury， which is related with SIRT1/NF-κB signaling pathway.

KEYWORDS Hypoxic-ischemic brain injury； Resveratrol； SIRT1； NF-κB； Cognitive function； Neonatal rat

缺氧缺血性腦損傷（Hypoxic-ischemic brain injury，HIBI）為新生兒死亡和出現(xiàn)認知功能障礙的主要因素[1]，目前無很好的治療方法。早期流行病學報道，發(fā)達國家HIBI發(fā)病率為0.1%～0.8%，而發(fā)展中國家為2.6%[2]。中國地區(qū)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)每年約4.5萬名新生兒出現(xiàn)HIBI[3]。調查發(fā)現(xiàn)HIBI患兒中有1.5%～2.5%出現(xiàn)死亡，另外超過2.5%的患兒出現(xiàn)永久性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，比如腦癱、癲癇、認知功能障礙或視覺障礙等[4]。當下，亞低溫是有效治療HIBI的手段，但是該方法僅僅對足月中重度患兒有效，治療時間窗非常短，而且還會有一半的患兒出現(xiàn)后遺癥[5]。已有研究證實，細胞凋亡、氧化損傷、神經(jīng)毒性等都可以引起神經(jīng)元死亡進而促使認知功能障礙[6]。其中，細胞凋亡為HIBI中神經(jīng)元壞死的主要方式，該過程由相關信號傳導及凋亡蛋白共同參與介導[7]。于是，尋找抗神經(jīng)元凋亡藥物成為治療恢復HIBI后認知功能的研究熱點。沉默信息調節(jié)因子1（SIRT1）廣泛表達于海馬神經(jīng)元細胞，SIRT1活化能夠降低核轉錄因子κB（NF-κB）炎性信號傳導，起著抗神經(jīng)元細胞凋亡的作用[8]。白藜蘆醇（Resveratrol）表現(xiàn)出廣泛的藥理活性，其中在抗氧化、抗細胞凋亡、抗炎癥等方面效果顯著，并且對認知功能也有著較好的改善作用[9]。白藜蘆醇可抑制缺血缺氧導致的新生大鼠神經(jīng)元凋亡，可改善糖尿病大鼠空間認知功能的損害，其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制可能與抑制凋亡途徑和抗炎作用密切相關[10]。因此，本實驗研究了白藜蘆醇對HIBI模型新生大鼠認知功能的影響，并研究了其對SIRT1/NF-κB信號通路的影響，以期為白藜蘆醇的臨床應用提供實驗參考。

1 材料

1.1 儀器

XR-XM101型Morris水迷宮（江蘇賽昂斯生物公司）；i Mark型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；GX-2020M-E型凝膠成像系統(tǒng)（美國Syngene公司）。

1.2 藥品與試劑

白藜蘆醇原料藥（批號：13-627，純度：≥98%）和增強化學發(fā)光試劑（ECL，批號：SY-126-30）均購自美國Sigma公司；兔抗鼠B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）及其相關X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、NF-κB、磷酸化NF- κB（p-NF-κB）、SIRT1、β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（英國Abcam公司，批號：ab9023124、ab1023652、ab6302147、ab3320145、ab1325047、ab1852102、ab2201234）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（上海谷歌生物有限公司，批號：SY-109840）。

1.3 動物

新生1周SD大鼠48只，SPF級，♂，體質量為（12.8±1.6） g，購自北京維通利華動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（京）2018-0001。本動物實驗經(jīng)過武漢大學附屬同仁醫(yī)院（武漢市第三醫(yī)院）倫理委員會批準。

2 方法

2.1 分組與給藥

將48只大鼠隨機分為4組，每組12只，包括假手術組、模型組和白藜蘆醇低、高劑量組。除假手術組大鼠行假手術（即頸部切口后，立即縫合）外，其余各組大鼠采用Rice法[11]復制HIBI模型，大鼠吸入乙醚麻醉后，在中位頸部切口，分離左頸總動脈，結扎血管，并立即縫合傷口；2 h恢復期后，把大鼠安置于37 ℃水浴密閉缺氧環(huán)境中，給予混合氣體（8%氧氣+92%氮氣）進行缺氧處理25 h。造模完成后，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠每天腹腔注射白藜蘆醇1次，給藥劑量分別為30、60 mg/kg[12]，給藥體積均為50 μL，假手術組和模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，連續(xù)給藥6周。

2.2 認知功能檢測

給藥1、3、6周時，使用Morris水迷宮，每組隨機抽取6只大鼠行定位航行實驗，分別從4個象限的池壁中點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在2 min內(nèi)從入水到登上平臺的時間即為逃避潛伏期，倘若大鼠在2 min內(nèi)沒有登上平臺，則由實驗員將其引導至平臺休息30 s，記錄逃避潛伏期為2 min。末次定位航行實驗結束后把平臺撤離進行空間探索實驗，將大鼠由4 個象限的原入水點面向池壁放入水中，記錄各個象限2 min內(nèi)大鼠穿越原來平臺所在位置的次數(shù)。

2.3 腦組織梗死面積檢測

空間探索實驗結束后，每組處死6只大鼠，取出腦組織，置于4 ℃的磷酸鹽緩沖液（PBS）中冷卻5 min，沿冠狀面切片。采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法，將切片浸入以PBS制備的2%TTC溶液中，室溫孵育30 min，PBS清洗2遍，再用4 ℃福爾馬林溶液避光固定后拍攝圖像。采用Image J 1.8.0軟件測量切片圖像的梗死面積。

2.4 海馬組織CA1區(qū)凋亡相關蛋白及SIRT1/NF-κB信號通路蛋白檢測

空間探索實驗結束后，麻醉各組剩余的6只大鼠，分離出海馬CA1區(qū)組織，碾碎后加入RIPA裂解液在冰上充分裂解組織30 min，在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，然后吸取上清測蛋白濃度。組織勻漿采用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）4 h（電壓為45 V），隨后轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，置于兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、p-NF-κB、SIRT1、β-actin單克隆抗體溶液中（稀釋比例1 ∶ 1 000），4 ℃反應過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，然后室溫條件下孵育HRP羊抗兔IgG二抗（稀釋比例1 ∶ 3 000）1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL顯色后，成像系統(tǒng)進行曝光顯影，Image J 1.8.0軟件分析蛋白灰度值，以目標蛋白與內(nèi)參（β-actin）灰度值的比值進行評價。

2.5 統(tǒng)計學方法

實驗結果采用SPSS 20.0軟件進行分析。多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 認知功能

與假手術組比較，模型組大鼠給藥1、3、6周時的逃避潛伏期明顯延長（P<0.05），穿臺次數(shù)明顯減少（P<0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠給藥1、3、6周時的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），穿臺次數(shù)明顯增加（P<0.05）。與白藜蘆醇低劑量組比較，白藜蘆醇高劑量組大鼠給藥1、3、6周時的逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），穿臺次數(shù)明顯增加（P<0.05）。各組大鼠的逃避潛伏期和穿臺次數(shù)比較見表1。

3.2 腦組織梗死面積

TTC染色發(fā)現(xiàn)，假手術組大鼠腦組織沒有發(fā)生梗死現(xiàn)象；模型組大鼠腦組織出現(xiàn)了大片呈白色的梗死區(qū)域；白藜蘆醇低劑量組大鼠腦組織仍有較大區(qū)域呈白色的梗死現(xiàn)象；白藜蘆醇高劑量組大鼠腦組織有極少區(qū)域呈白色的梗死現(xiàn)象。與假手術組比較，模型組大鼠腦組織梗死面積明顯增加（P<0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠腦組織梗死面積明顯減?。≒<0.05）。與白藜蘆醇低劑量組比較，白藜蘆醇高劑量組大鼠腦組織梗死面積明顯減?。≒<0.05）。各組大鼠腦組織的TTC染色切片圖見圖1，梗死面積比較見圖2。

3.3 海馬組織CA1區(qū)凋亡蛋白表達比較

與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3蛋白表達明顯增強（P<0.05），而抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)中Bax、Caspase-3蛋白表達明顯降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達明顯增強（P<0.05）。與白藜蘆醇低劑量組比較，白藜蘆醇高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)中Bax、Caspase-3蛋白表達明顯降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達明顯增強（P<0.05）。各組大鼠海馬組織CA1區(qū)內(nèi)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的電泳圖見圖3，蛋白表達比較見圖4。

3.4 白藜蘆醇對大鼠海馬組織CA1區(qū)SIRT1/NF-κB信號通路的影響

4組大鼠海馬組織CA1區(qū)中NF-κB蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)中SIRT1蛋白表達明顯降低（P<0.05），p-NF-κB蛋白表達明顯增強（P<0.05）。與模型組比較，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)中SIRT1蛋白表達明顯增強（P<0.05），p-NF-κB蛋白表達明顯降低（P<0.05）。與白藜蘆醇低劑量組比較，白藜蘆醇高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)中SIRT1蛋白表達明顯增強（P<0.05），p-NF-κB蛋白表達明顯降低（P<0.05）。各組大鼠海馬組織CA1區(qū)內(nèi)SIRT1、p-NF-κB蛋白表達的電泳圖見圖5，蛋白表達比較見圖6。

4 討論

早期實驗發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血能導致新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡，而且這一過程出現(xiàn)的時間較長[13]。本文利用經(jīng)典的Rice法構建新生大鼠HIBI模型，大腦TTC染色發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的梗死面積，提示實驗造模成功。Western blot結果提示，模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達明顯高于假手術組，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達明顯低于假手術組，說明HIBI能引起海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生。早期有學者發(fā)現(xiàn)，HIBI對大腦海馬區(qū)影響最明顯，而CA1區(qū)神經(jīng)元功能與機體認知能力有關，當該CA1區(qū)神經(jīng)組織損傷時能導致機體的學習記憶功能明顯減弱[14]。本研究對模型組大鼠學習記憶能力考察發(fā)現(xiàn)，HIBI能顯著誘導大鼠空間學習記憶能力減弱，與文獻結果相同[15]。綜上，HIBI可以誘導大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，進而促使大鼠空間學習記憶力降低。

白藜蘆醇屬于一種天然植物多酚，表現(xiàn)出廣泛的藥理活性。近十年研究報道，白藜蘆醇對大鼠由多種原因引起的認知功能障礙具有改善作用。林茂等[16]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以改善阿爾茨海默病小鼠認知功能障礙；唐明等[17]研究提示，白藜蘆醇可通過調節(jié)凋亡相關蛋白表達來緩解大鼠的認知障礙；譚宇亭等[18]也發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能通過抑制氧化損傷改善七氟烷暴露所致新生大鼠的學習記憶能力障礙；黃效東等[19]也闡述了白藜蘆醇能有效抑制癲癇發(fā)作及提高大鼠認知能力。然而，關于白藜蘆醇對HIBI模型大鼠認知功能障礙的影響尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇低、高劑量組大鼠腦梗死面積明顯小于模型組，說明白藜蘆醇對大鼠腦損傷表現(xiàn)出較好的藥理作用；白藜蘆醇低、高劑量組大鼠的逃避潛伏期比模型組明顯縮短，穿臺次數(shù)明顯增加，說明白藜蘆醇可以在一定程度上提高大鼠的學習記憶能力；白藜蘆醇低、高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)Bax、Caspase-3蛋白表達明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達明顯強于模型組，說明白藜蘆醇可以減輕神經(jīng)元凋亡。

SIRT1屬于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙?；?，主要分布于大腦海馬區(qū)，SIRT1發(fā)生去乙酰化反應后會作用于下游NF-κB信號傳導，介導細胞代謝、增殖、凋亡等多種生物學效應[20-21]。SIRT1/NF-κB信號傳導可參與慢性腦缺血的炎性因子產(chǎn)生，當對SIRT1進行活性誘導時，可通過抑制NF-κB信號活化，降低細胞凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過激活SIRT1降低卵巢顆粒細胞凋亡[22]；還有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可激活SIRT1信號傳導能抑制腎小球足細胞表型改變[23]。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能誘導SIRT1表達，抑制NF-κB信號通路活化，提示白藜蘆醇能通過激活SIRT1/NF-κB信號通路改善HIBI引起的大鼠認知功能障礙。

本研究初步探討了白藜蘆醇對HIBI模型新生大鼠認知功能障礙的保護作用及其作用機制。結果表明，白藜蘆醇可能通過影響SIRT1信號通路活化，降低海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，進而發(fā)揮改善缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠認知功能障礙的作用。

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（收稿日期：2019-01-30 修回日期：2019-03-13）

（編輯：鄒麗娟）