劉朝圣 申夢潔 韓曉鳳 彭麗麗 刁慶春

〔摘要〕 目的 研究紅景天苷對中波紫外線（ultraviolet B， UVB）輻射HaCat細(xì)胞增殖及Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)的作用。方法 將HaCat細(xì)胞分為6組：即正常對照組（Ⅰ組）、紅景天苷中劑量組（Ⅱ組）、UVB輻射組（Ⅲ組）、UVB+紅景天苷低劑量組（Ⅳ組）、UVB+紅景天苷中劑量組（Ⅴ組）、UVB+紅景天苷高劑量組（Ⅵ組），Ⅰ組未經(jīng)任何處理，Ⅱ組加入40 μg/mL的紅景天苷，Ⅲ組接受200 mJ/cm2劑量紫外線照射，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組分別加入10、40、80 μg/mL紅景天苷并進(jìn)行200 mJ/cm2紫外線照射。HaCat細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，采用MTT法檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期，Western blotting法檢測Caspase-3、Caspase-9表達(dá)的蛋白水平。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示隨著紅景天苷濃度的增加，HaCat細(xì)胞的生存率逐漸增加;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期顯示HaCat細(xì)胞的S峰值隨著紅景天苷濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢，Ⅵ組S峰值高于Ⅱ組;Western blotting顯示Ⅵ組Caspase-3/9的蛋白表達(dá)量均有下降。結(jié)論 紅景天苷可通過抑制Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)，減少UVB誘導(dǎo)HaCat細(xì)胞凋亡。

〔關(guān)鍵詞〕 紅景天苷;中波紫外線;細(xì)胞增殖;Caspase-3;Caspase-9

〔中圖分類號〕R285.5;R818 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.005

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Salidroside on proliferation and expression of Caspase-3/9 protein in HaCat cells induced by ultraviolet B （UVB） radiation. Methods HaCat cells were divided into 6 groups： a normal control group （group I）， a medium dose of Salidroside group （group II）， a UVB radiation group （group III）， a UVB+ low dose of Salidroside group （group IV）， a UVB+ medium dose group （group V）， a UVB+ high dose of Salidroside group （VI group）. Group I was not treated. Group II was added with 40 μg/mL of Salidroside; Group III was irradiated with ultraviolet radiation at 200 mJ/cm2; Group IV， Group V， Group VI were added with 10 μg/mL， 40 μg/mL， 80 μg/mL of Salidroside respectively and irradiated with 200 mJ/cm 2 doses of ultraviolet. After 24 hours of HaCat culture， cell viability was detected by MTT assay， and cell cycle was observed by flow cytometry. The protein levels of Caspase-3 and Caspase-9 were detected by western blotting. Results The results of MTT showed that the survival rate of HaCat cells was increased with the increase of Salidroside concentration. Flow cytometry suggested the S peak of HaCat cells increased with the increasing concentration of Salidroside. The S peak of group VI was higher than that of Group II. Western blotting revealed that the protein expression of Caspase-3/9 decreased in the Salidroside group with high concentration. Conclusion Salidroside can reduce HaCat cell apoptosis induced by UVB through inhibiting the expression of Caspase-3 and Caspase-9 protein.

〔Keywords〕 Salidroside; ultraviolet B; cell proliferation; Caspase-3; Caspase-9

多數(shù)天然產(chǎn)物含有抑制細(xì)胞凋亡作用的成分，紅景天作為一種常用的高原中藥材，其主要有效成分包括紅景天苷、酪醇及紅景天多糖等，其中紅景天苷是從大株紅景天的干燥根及根莖或干燥全草中提取的主要有效成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，紅景天在皮膚科的應(yīng)用中具有抗衰老[1]、防光老化[2]、抗菌[3]、抗輻射等多種活性作用，且副作用較小[4]。本文研究了不同濃度紅景天苷對中波紫外線（ultraviolet B， UVB）輻射HaCat細(xì)胞的增殖活性及對內(nèi)源性凋亡途徑中的凋亡因子Caspase-3、Caspase-9蛋白水平的影響，探討其抗輻射機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），二甲基亞砜（Sigma公司），MTT溶液（Amresco公司），嗅化乙錠（PI）染液、RNA酶、胎牛血清（均來自永捷實(shí)驗室），青霉素、鏈霉素、0.25%胰蛋白酶、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、RIPA裂解液、BCA試劑盒（均來自碧云天生物技術(shù)研究所），兔抗人Caspase-3一抗、兔抗人Caspase-9一抗、鼠抗人β-actin一抗（均來自Abcam公司），HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（均來自Sant Cruz公司），ECL發(fā)光試劑盒（美國Thermo Scientific公司）。人類永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株（HaCat細(xì)胞）由重慶市第一人民醫(yī)院皮膚科實(shí)驗室保存并提供;紅景天苷（每支20 mg，批號：H-040-141103）購自中國四川成都瑞芬思生物科技有限公司，實(shí)驗中用滅菌蒸餾水按所需濃度溶解配制。

1.1.2 ?主要儀器 ?311窄譜UVB治療儀（深圳半島醫(yī)有限公司），DNM-9602G酶標(biāo)儀分析儀（北京普朗公司），流式細(xì)胞儀（美國 Bio-Rad 公司），Model Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)（美國 Bio-Rad 公司），電泳儀、電轉(zhuǎn)槽、搖床（上海一恒）等。

1.2 ?實(shí)驗方法

1.2.1 ?細(xì)胞培養(yǎng) ?HaCat細(xì)胞采用細(xì)胞生長液（高糖DMEM、10%FBS、青霉素100 U/mL以及鏈霉素100 ？滋g/mL），于5% CO2、37 ℃細(xì)胞孵育箱中孵育。培養(yǎng)過程中，維持細(xì)胞密度在70%～90%的狀態(tài)，依細(xì)胞生長狀態(tài)3～4 d傳代1次。經(jīng)過2次傳代后，擇其生長旺盛、狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行分組實(shí)驗。

1.2.2 ?細(xì)胞分組及處理 ?調(diào)整HaCat細(xì)胞懸液濃度為（8～10）×104/mL，每孔1 mL接種在6孔板中，90%融合后進(jìn)行藥物干預(yù)處理及紫外線照射。分成6個組進(jìn)行實(shí)驗。正常對照組（下稱Ⅰ組）：普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，不進(jìn)行紫外線照射;紅景天苷中劑量組（40 μg/mL，下稱Ⅱ組）無紫外線照射;UVB輻射組（下稱Ⅲ組）：無任何試劑，紫外線照射;UVB+紅景天苷低劑量組（10 μg/mL，下稱Ⅳ組）進(jìn)行紫外線照射;UVB+紅景天苷中劑量組（40 μg/mL，下稱Ⅴ組）進(jìn)行紫外線照射;UVB+紅景天苷高劑量組（80 μg/mL，下稱Ⅵ組）進(jìn)行紫外線照射。

紫外線照射方法：將培養(yǎng)細(xì)胞置于距離紫外光光源垂直距離為2 cm的地方（每孔加入2 mL PBS），照射功率為200 mJ/cm2，照射時間為30 s。UVB照射后再常規(guī)培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3 ?檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 ?四唑鹽（MTT）比色法檢測各組細(xì)胞生存率 ?將細(xì)胞以1×104/mL接種到96孔板中，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁后，去除原培養(yǎng)液，進(jìn)行實(shí)驗分組并增設(shè)空白組，每組3個復(fù)孔。96孔板中細(xì)胞經(jīng)UVB輻射后24 h，各孔中加入5 mg/mL MTT 10 μL至MTT的終濃度為0.5 mg/mL，孵育箱中培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）進(jìn)行溶解，室溫下?lián)u床震蕩5 min，使甲瓚結(jié)晶完全溶解，用自動酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度A值，計算存活率。每組取各復(fù)孔的平均值，以空白組吸光度值調(diào)零。實(shí)驗重復(fù)3次。

存活率=（A值處理組-A值陰性對照組）/（A值陽性對照組-A值陰性對照組）×l00%

1.3.2 ?流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞周期 ?收集各組實(shí)驗細(xì)胞，PBS清洗2次。用提前預(yù)冷的75%乙醇4 ℃過夜固定細(xì)胞，離心（3 000 r/min，5 min），棄上清，PBS清洗2次，并離心（3 000 r/min，5 min）棄上清，每個樣本加入80 μL的50 μg/mL RNA酶，37 ℃孵育30 min后，加入100 μL的50 μg/mL的嗅化乙錠（PI）染液，混勻，室溫避光孵育10 min后，液體經(jīng)100 μm濾網(wǎng)膜過濾后上機(jī)檢測細(xì)胞周期，經(jīng)儀器自帶軟件處理直接得出細(xì)胞增殖活性。

1.3.3 ?Western Blotting方法測定Casepase-3/9蛋白表達(dá) ?使用PIPA細(xì)胞裂后按產(chǎn)品試劑盒說明用 BCA法檢測蛋白濃度，取等量的蛋白樣品（40 μg）經(jīng)10% SDS-PAGE分離膠和80 V恒壓電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉加PBST配置成封閉液室溫封閉2 h，加入鼠抗人β-actin 一抗按1∶5 000 BSA稀釋，兔抗人 Caspase3/9 一抗按1∶1 000 BSA稀釋，4 ℃搖床搖動孵育封閉過夜;TBST（H2O+TBS+Tuween20）洗滌3次（每次10 min）后，加入1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠或羊抗兔二抗，在室溫下孵育1 h，TBST再次洗膜3次（每次10 min），小心吸凈洗膜液后加入ECL發(fā)光底物，關(guān)閉電源，在凝膠成像系統(tǒng)中成像、攝圖。重復(fù)3次。應(yīng)用Quantity One軟件對紅景天苷蛋白的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，測定圖片上每個特異條帶的灰度值，用目的蛋白的灰度值/內(nèi)參β-Actin的灰度值，所得結(jié)果為目的蛋白相對含量。

1.4 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，定量資料以“x±s”表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）;以P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?MTT法檢測細(xì)胞的生存率

如表1所示：與Ⅰ組比較，UVB照射對HaCat細(xì)胞的存活率有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），相同劑量的UVB照射條件下隨著紅景天苷的濃度增加HaCat細(xì)胞的OD值呈逐漸上升趨勢，10、40、80 μg/mL紅景天苷組的生存率分別為（75.37±13.45）%、（80.87±11.12）%、（84.65±9.22）%，與Ⅱ組、Ⅲ組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 ?流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期比較增殖活性

利用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞儀觀察對HaCat細(xì)胞周期的影響， 根據(jù)ModFit軟件分析得到實(shí)驗數(shù)據(jù)，如圖1、表2所示：在G0/G1期，與Ⅰ組比較，Ⅲ組的細(xì)胞含量（56.68±0.011）%為最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與Ⅱ組比較，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且隨著紅景天苷的濃度增加，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組的細(xì)胞分裂數(shù)量逐漸下降;與Ⅲ組相比較，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且在相同條件下UVB照射后，隨著紅景天苷的濃度增加，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組細(xì)胞的活躍度呈上升趨勢。在S期，Ⅰ組細(xì)胞活性明顯高于Ⅲ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與Ⅲ組比較，在相同條件下UVB照射后，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組細(xì)胞活性明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且隨著紅景天苷的濃度增加細(xì)胞的活躍度呈上升趨勢，Ⅵ組HaCat細(xì)胞活性值最高。在G2/M期，與Ⅲ組比較，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組的凋亡細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 ?Western Blotting方法測定Casepase-3、Casepase-9蛋白表達(dá)

從Caspase-3、Casepase-9的蛋白表達(dá)來看，與Ⅰ組比較，Ⅲ組的表達(dá)量均明顯高于Ⅰ組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與Ⅱ組比較，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;各實(shí)驗組Caspase-3、Casepase-9隨著紅景天苷濃度的增加，蛋白表達(dá)量逐漸下降，尤以高濃度紅景天苷組（Ⅵ組）下降最為明顯，與Ⅲ組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明低濃度（10 μg/mL）的紅景天苷對HaCat細(xì)胞的防護(hù)作用最差，而高濃度的紅景天苷組對HaCat細(xì)胞有一定的抑制凋亡的作用。見圖2、表3。

3 討論

日常生活中的UVB照射可誘使皮膚出現(xiàn)光老化、免疫抑制改變及發(fā)生皮膚癌變等。這些變化與UVB照射后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生數(shù)量較多的氧自由基（reactive oxygen specie，ROS）有關(guān)，它可以引起皮膚表皮及真皮細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷，從而導(dǎo)致皮膚癌的發(fā)生，因此如何防護(hù)其損傷顯得尤為重要。從天然植物和傳統(tǒng)藥物中開發(fā)新型抗輻射藥具有高效和低毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。

紅景天是景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物，《四部醫(yī)典》中記載它具有扶正固本，理氣養(yǎng)血，滋補(bǔ)強(qiáng)身之功效，藏族人民稱之為“雪域仙草”。紅景天多生長在海拔4 000多米的雪域高原上，其高原地屬紫外線輻射強(qiáng)烈地帶，故在雪域高原上生長的植物大部分都具有抗紫外線的特性。近幾十年來，國內(nèi)已經(jīng)研發(fā)含有紅景天成份的各類護(hù)膚產(chǎn)品，但其美白、抗氧化、防輻射等作用機(jī)制研究仍不夠明確，因此值得大家深入研究。

Caspase家族屬于介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一大類調(diào)節(jié)基因，是細(xì)胞凋亡的啟動和執(zhí)行者，是凋亡信號傳導(dǎo)的共同通路。其中Caspase-9位于Caspase級聯(lián)反應(yīng)的最上游，能在其它細(xì)胞因子的參與下發(fā)生自我活化并激活下游執(zhí)行型Caspase，如Caspase-3，后者可特異性地裂解底物使細(xì)胞發(fā)生生化及形態(tài)學(xué)改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5-7]。有相關(guān)藥理學(xué)研究表明紅景天苷可通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-xl通路[8]、紋狀體中DA、DOPAC和HVA的水平[9]，或者抑制慢性缺氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖[10]、增加Bax/Bcl-2比例[11]，或者抑制Caspase-3、Caspase-8、caspase-9活化等多種不同路徑，從而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行凋亡[12]。有研究證明紅景天苷可發(fā)揮抗多系統(tǒng)細(xì)胞氧化及細(xì)胞衰老的作用[13]，抗炎抗腫瘤，保護(hù)血管等[14-17]。本實(shí)驗在臨床觀察基礎(chǔ)上，從細(xì)胞凋亡角度探討紅景天抗輻射作理機(jī)制。

本實(shí)驗結(jié)果表明，不同濃度的紅景天苷的均能提高HaCat細(xì)胞存活率，增加細(xì)胞分裂活性，且呈濃度依賴性趨勢。在相對蛋白表達(dá)中，細(xì)胞因子Caspase-3、Caspase-9中UVB組（Ⅲ組）蛋白含量明顯高于其他各實(shí)驗組，而不同濃度的紅景天苷組 Caspase-3、Caspase-9相對蛋白表達(dá)均下調(diào)，尤以高濃度的下降最明顯，結(jié)果與張偉等[18]、史飛等[19]、饒燕等[20]相關(guān)研究報道基本一致。這表明紅景天抗紫外線輻射的作用機(jī)制可能是通過下調(diào)凋亡級聯(lián)因子從而減少細(xì)胞的凋亡水平而實(shí)現(xiàn)，本研究為紅景天在臨床應(yīng)用和產(chǎn)品研發(fā)提供了一定實(shí)驗依據(jù)。

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