鄒暉 李海明 王偉英 林江波

摘?要：【目的】利用建立的多效唑誘導中國水仙的SSH文庫，克隆中國水仙NtCCHC鋅指基因的cDNA序列，進行原核表達，為深入研究NtCCHC鋅指基因在中國水仙中的功能奠定基礎?！痉椒ā坎捎肨rizol法提取多效唑處理后的中國水仙葉片總RNA，反轉錄成cDNA后，根據(jù)已知的CCHC鋅指蛋白基因序列設計引物進行基因克隆和同源性分析，并構建原核表達載體進行誘導表達?！窘Y果】克隆一段810bp的cDNA編碼區(qū)序列，編碼269個氨基酸，同源性分析表明與多個物種的CCHC基因存在著較高的同源性，命名為NtCCHC。該基因能成功在pGEX-4T-3原核表達載體上實現(xiàn)誘導表達，系統(tǒng)進化樹分析表明：NtCCHC與中國蓮遺傳距離最近?！窘Y論】克隆了中國水仙NtCCHC基因序列，并成功誘導表達。

關鍵詞：中國水仙;鋅指蛋白;基因克隆;蛋白表達

中圖分類號：S 682文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）08-889-05

Abstract：【Objective】 Based on the information in the SSH Library on Narcissus tazetta var.chinensis，the zinc finger gene was cloned and prokaryotic expressed for future studies. 【Method】 Total RNA of N.tazetta var. chinensis from the paclobutrazol-treated leaves was extracted using the Trizol method. After reverse transcription into cDNA， gene cloning and homology analysis were carried out on it with primers designed according to the known sequence of CCHC. A prokaryotic expression vector was constructed to induce expression. 【Result】 The 810?bp sequence encoding 269 amino acids was cloned. The cloned gene showed high homologies with the CCHC genes of many species and was named NtCCHC， which could be successfully induced and expressed in pGEX-4T-3.?The phylogenetic tree constructed by MEGA 6.0 indicated that the closest genetic distance of NtCCHC lied with Nelunbo nucifera. 【Conclusion】This study successfully cloned and expressed the NtCCHC gene sequence of N. chinensis.

Key words：Narcissus tazetta var. chinensis; zinc finger protein; gene cloning; protein expression

0?引言

【研究意義】鋅指蛋白（zinc finger protein）是一類通過結合鋅離子折疊成手指狀結構域的蛋白，主要由半胱氨酸（Csy）和組氨酸（His）組成，通過鋅離子形成“指”狀四面體結構[1]。其中CCHC型鋅指蛋白既能結合單鏈DNA也能結合RNA，廣泛地參與細胞生長過程的轉錄調(diào)控、3′順式剪接位點選擇、多順反子RNA切割、多聚腺苷酸化和同源重組[2-3]。鋅指蛋白基因是逆境響應的調(diào)節(jié)物，中國水仙Narcissus tazetta var.chinensis為石蒜科水仙屬植物，是中國傳統(tǒng)名花之一。研究中國水仙CCHC型鋅指蛋白基因的克隆與原核表達情況，對提高中國水仙的抗性水平具有十分重要意義。【前人研究進展】鄭恒等[4]從日本晴中克隆已知基因OsC2HC （AK103785），其含有1個C2HC型鋅指結構域，研究表明過表達OsC2HC-1∷GFP的擬南芥比野生型優(yōu)勢生長，表現(xiàn)出較強的抗鹽堿性和抗氧化性，說明OsC2HC-1基因與抗鹽堿性及抗氧化性有關。在大豆疫霉的基因組，鋅指蛋白CCHC類的含量特別高，約為1.9%，比高等植物高出近4倍，說明這類轉錄因子有可能在大豆疫霉的生理功能中起著重要的作用。從水稻中克隆的含CCHC結構域的OsZFP6基因，經(jīng)NaCl、 NaHCO3、 H2O2 處理后，表達量增加;將基因轉到酵母菌中，經(jīng)NaHCO3處理后與對照相比表達量具有明顯的增加，說明含CCHC基因的OsZFP6，可提高植株對堿和H2O2的抗性[5]。目前對中國水仙的基因克隆研究主要集中在花色相關基因[6]、MADS-box基因[7]、幾丁質(zhì)酶基因[8]和STK類抗病基因[9]的研究，本課題組前期建立的多效唑誘導中國水仙的SSH文庫為基礎，克隆了中國水仙植物AT富集序列鋅結合蛋白基因（NtPLATZl）[10]，并篩選獲得一個全新的中國水仙NtCCHC鋅指基因的cDNA序列，經(jīng)同源性分析，構建了中國水仙鋅指基因與其他物種的系統(tǒng)進化關系，以期為深入研究NtCCHC鋅指基因在中國水仙中的功能奠定基礎?！颈狙芯壳腥朦c】NtCCHC與其他物種的同源性及原核表達情況，是研究中國水仙在多效唑處理后在分子水平上如何調(diào)控基因的表達的前提條件?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用建立的多效唑誘導中國水仙的SSH文庫，克隆了中國水仙NtCCHC鋅指基因的cDNA序列，進行原核表達，為深入研究NtCCHC鋅指基因在中國水仙中的功能奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

供試材料為中國水仙“金盞銀臺”品種，種球來源于實驗室保存，水仙花種球水養(yǎng)16 d后，每天用150 mg·L-1的多效唑噴霧1次，連續(xù)噴霧10次，取成長期葉片，用液氮凍結后，置于-70℃冰箱中保存?zhèn)?。RNase Inhibitor、dNTP Mixture、pMD19-T、限制性內(nèi)切酶等購自TaKaRa（大連） 生物有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。HB101、BL21菌株為本研究室保存。

1.2?試驗方法

1.2.1?中國水仙NtCCHC基因克隆?采用Trizol法進行總RNA的提取，用超微量紫外可見光分光光度計（ND-1000）測260 nm和280 nm下的吸光值，計算RNA純度和濃度。以RNA為模板，合成cDNA第一鏈。根據(jù)已獲得的中國水仙含CCHC保守結構域鋅指蛋白基因的cDNA核苷酸序列設計5′和3′端擴增引物，通過5′-RACE和3′-RACE的方法，獲得中國水仙含CCHC保守結構域鋅指蛋白基因的全長 cDNA。

根據(jù)已獲得的cDNA片段設計引物，CC1：5′-CCC GAA TTC ATG TCT AGC AAG AAT GAA GAA-3′（含EcoRI酶切位點）， CC2：5′-TGC GGC CGC TCA ACA TCT CCG ACC GTG CCT-3′（含NotI酶切位點）。PCR擴增程序為：95℃預變性5 min，然后95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的片斷，檢驗產(chǎn)物膠回收情況。將PCR膠回收產(chǎn)物連接到pMD19-T上，轉化大腸桿菌HB101，挑選單菌落擴繁， PCR驗證，送上海生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.2?序列的生物信息學分析?Blast搜索NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫，進行序列相似分析。利用MEGA6.0軟件，構建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

1.2.3?NtCCHC基因原核表達載體構建與蛋白表達分析?用EcoR I、Not I雙酶切pMD-NtCCHC和pGEX-4T-3，膠回收、連接、轉化，挑選單菌落擴繁后提取質(zhì)粒，酶切鑒定后，送上海生工測序。

陽性重組克隆子轉化表達宿主菌Esherichia coli BL21（DE3），加入1 mmol·L-1 IPTG， 在37℃下以250 r·min-1過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用50 mL 50mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH8.0）懸浮沉淀;加等體積2×凝膠上樣緩沖液，混勻，100℃水浴變性處理10 min;誘導前、后的菌樣各取10 μL經(jīng)SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍染色檢測蛋白表達情況。

2?結果與分析

2.1?中國水仙NtCCHC基因ORF的克隆

以反轉錄后cDNA模板，用特異性引物CC1和CC2擴增特異性目標條帶（圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉化大腸桿菌，菌液PCR檢測獲得陽性克隆。測序結果表明目的片段大小為810 bp。將獲得的核苷酸序列應用DNAMAN軟件進行分析和預測，編碼了269個氨基酸（圖2）。

2.2?基因的同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構建

將測序結果應用NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nhn.nih.gov/）Blast軟件進行序列同源性比對分析。分析結果表明，獲得的中國水仙NtCCHC基因編碼區(qū)與多個物種含CCHC結構域基因核苷酸序列同源，其中與中國蓮Nelunbo nucifera（XP-010259317）、棉花Gossypium arboretum（KHG03978.1）、葡萄Vitis vinifera（XP002276973.1）等植物一致性達80%以上。

系統(tǒng)進化樹是物種的進化史，通過構建系統(tǒng)進化樹可以根據(jù)這些物種的祖先描述它們的進化關系。利用MEGA 6.0軟件對日本水稻Oryza sativa Japonica（AK103785.1）、小麥Aegilops tauschii（EMT31466）、梅花Prunus mume（XP_008223318.1）、擬南芥Arabidopsis thaliana（AAD22698）、水稻Oryza brachyantha（XP_006662806）、 中國蓮Nelunbo nucifera（XP_010259317）、葡萄Vitis vinifera（XP_002276973.1）、棉花Gossypium arboretum（KHG03978.1）、桑樹Morus notabilis（XP_010097953）、巴旦木Prunus persica（XP_0072237776.1）和中國水仙NtCCHC等11個物種含CCHC結構域基因的核苷酸序列構建系統(tǒng)進化樹。從圖3看出，從遺傳距離上看，這些植物的基因的親緣關系都比較接近，聚為兩大類，一類是擬南芥和小麥，其余9種植物聚為一類，NtCCHC與中國蓮遺傳距離最近。

2.3?NtCCHC基因的原核蛋白表達分析

2.3.1?原核表達載體的酶切鑒定

對重組質(zhì)粒pGEX-NtCCHC以EcoR I、Not I雙酶切鑒定（圖4），分別獲得載體片段約4 900 bp和810 bp目的片段兩個條帶，表明目的片段已成功插入表達載體。

2.3.2?融合蛋白的誘導表達

由pGEX-NtCCHC表達得到的融合蛋白前半部為質(zhì)粒本身的谷胱甘肽轉移酶（GST），后半部為NtCCHC基因編碼的蛋白。GST蛋白分子量為26 kDa，而從插入的NtCCHC基因片段的核苷酸序列推導出蛋白分子量為30.046 8 kDa，故融合蛋白的分子量應為56.046 8 kDa。融合蛋白經(jīng)IPTG誘導后，進行SDS-PAGE跑膠驗證（圖5），表明目的蛋白已誘導表達，其分子量約為56 kDa與目的基因片段（30.046 kDa）和GST標簽蛋白大小之和基本對等。

3?討論與結論

鋅指結構蛋白基因，具有指狀結構特征，根據(jù)蛋白結構中半胱氨酸和組氨酸殘基的數(shù)目和順序有 C2H2， CCHC 和 C2C2 等結構類型，主要通過與核酸的相互作用如促進轉錄、抑制轉錄、單鏈DNA/RNA 結合等進而影響整個生命過程，多數(shù)鋅指蛋白是逆境響應的正調(diào)節(jié)物[12]。

本試驗以前期建立的多效唑誘導中國水仙的SSH文庫為基礎，克隆了中國水仙NtCCHC基因，其推導的氨基酸序列具有一個CHCC鋅指結構域。多效唑是一種廣譜型的植物生長延緩劑，在中國水仙盆栽水養(yǎng)的過程中施用可讓水仙植株矮化，株形緊湊，提高觀賞價值[13-14]，致矮化的原理為噴施后水仙的根、葉生長降低、葉綠素含量增加、光合速率、光合/呼吸比率提高，同時提高水仙葉片IAA 氧化酶活性，從而降低體內(nèi) IAA 含量，致使水仙的矮化[15-16]。NtCHCC基因在噴施多效唑后，水仙植株矮化后的表達情況需進一步的進行試驗，另外中國水仙在多效唑處理后，在分子水平上如何調(diào)控NtCHCC這些基因的表達，從而達到矮化及改善株型的作用，還未見有相關的研究報道。因此，鋅指結構蛋白基因在多效唑矮化中國水仙的過程中在激發(fā)抗性方面起的作用還需進一步研究。

參考文獻：

[1]BENJAMIN L. Gene Ⅶ[M]. Oxford University Press， 2000：654-656.

[2] FRANK F，GU THRIE C. An essential splicing factor， SLU7， mediates 3′splice site choice iIl yeast[J]. Genes Dev，?1992，6（11）：2112-2124.

[3] HENDRIKS E. F，ABDUL-RAZAK A， MATTHEWS K R. TbCPSF30 depletion by RNA interference disrupts polycistronic RNA processing in Trypanosoma brucei[J].J Bio1 Chem， 2003， 278（29）：26870-26878.

[4]王子迎，王朝霞，沈潔.一個編碼鋅指蛋白的大豆疫霉基因Ps-zfA1的克隆與轉錄分析[J].激光生物學報，2009，18（4）：504-508.

WANG Z Y，WANG Z X，SHEN J. Cloning and Transcription of Ps-zfA 1，an Encoding Putative Zn-finger Protein Gene from Phytophthora sojae [J].ACTA LASER BIOLOGY SINICA， 2009， 18（4）：504-508（in Chinese）

[5] GUAN Q J， WANG L F， BU Q Y， et al. The rice gene OsZFP6 functions in multiple stress tolerance responses in yeast and Arabidopsis[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2014， 82（9）：1-8.

[6] 鐘淮欽，黃敏玲，樊榮輝，等.中國水仙花色相關基因的克隆與分析[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2011，42（11）：1311-1315.

ZHONG H Q，HUANG M L，F(xiàn)AN R H，et al.Cloning and sequence analysis of flower color genes in Narcissus tazetta var.chinensis Roem[J].Journal of Southern Agriculture，2011，42（11）：1311-1315. （in Chinese）

[7] 吳菁華，吳少華，楊超，等.中國水仙NtSTK基因的克隆、序列和組織表達分析[J].熱帶作物學報，2015，36（10）：1820-1824.

WU J H，WU S H，YANG C，et al.cDNA Cloning， Sequence Analysis and Tissue Expression of NtSTK in Narcissus tazetta var.chinensis[J].Chinese Journal of Tropical Crops，2015，36（10）：1820-1824（in Chinese）

[8]林曉紅，潘鶴立，潘東明.中國水仙幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達分析[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2014，42（12）：173-178.

LIN X H，PAN H L，PAN D M.Cloning and expression analysis of chitinase gene from Narcissus tazetta var.chinensis[J]Journal of Northwest A&F University（Natural Science Edition），2014，42（12）：173-178. （in Chinese）

[9]吳菁華，吳少華，楊超.中國水仙STK類抗病基因同源序列的克隆與分析[J].熱帶作物學報，2011，32（5）：866-869.

WU J H，WU S H，YANG C.Cloning and Analysis of RGAs Genes Coding Serine/Threonine Protein Kinase-like Proteins from Narcissus tazetta var.chinensis Roem[J].Chinese Journal of Tropical Crops，2011，32（5）：866-869. （in Chinese）

[10]林江波，王偉英，李海明，等.中國水仙鋅指蛋白NtPLATZ1的克隆與表達分析[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2016，44（10）：165-170.

LIN J B，WANG W Y，LI H M，et al.Cloning and expression analysis of NtPLATZ1 gene from Narcissus tazetta var.chinensis[J]Journal of Northwest A&F University（Natural Science Edition），2016，44（10）：165-170. （in Chinese）

[11]TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al.MEGA6：Molecular evolutionary genetics analysis Version 6.0[J].Mol Biol Evol，2013，30：2725-2729.

[12] 李賀，韓藝娟， 林藝娟，等.水稻鋅指蛋白基因OsZFP1的功能分析[J].中國水稻科學，2015，29（2）： 135-140.

LI H，HAN Y J，LIN Y J，et al.Functional Analysis of Zinc Finger Protein Gene OsZFP1 in Rice[J]. Chin J Rice Sci ，2015，29（2）： 135-140 （in Chinese）

[13]賈洪濤，黨金鼎，劉風蓮.植物生長延緩劑多效唑的生理作用機理及應用[J].安微農(nóng)業(yè)科學，2003，31（2）：323-324.

JIA H T，DANG J D，LIU F L.Physiological Function Mechanism and Application of Multi-effect Triazole[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences ，2003，31（2）：323-324.（in Chinese）

[14] 關愛農(nóng)，劉曄，王志忠.不同濃度多效唑處理對水仙生長開花的影響[J].中國農(nóng)學通報， 2009，25（13）：146-149.

GUAN A N，LIU Y，WANG Z Z，et al.Effects of Paclobutrazol of Different Concentration on Growth and Florescence of Narcissus[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2009，25（13）：146-149.（in Chinese）

[15] 凌征柱，趙維合，覃文流.等多效唑?qū)Μm菲亞的葉綠素含量、抗逆性及活性成分的影響[J].廣西植物，2009，29（6）：788-791.

LING Z Z，ZHAO W H，QIN W L，et al.Effect of paclobutrazol on chlorophyll content，stress resistance and bioactive compounds of Pfaf fia[J].Guihaia，2009，29（6）：788-791.（in Chinese）

[16] 孫敬爽，湯志敏，陶霞娟，等.多效唑?qū)厥遗杌ㄔ录旧L及品質(zhì)的影響[J].北方園藝2011， （13）：88-90.

SUN J S，TANG Z M，TAO X J，et al.Effects of Paclobutrazol on Growth and Flower Quality in Potted-rose[J]. Northern Horticulture， 2011（13）：88-90.（in Chinese）

（責任編輯：林海清）