劉雨 丁煒東 曹哲明 邴旭文 徐暢 楊帆 張晨光 谷心池 孫阿君

摘要：【目的】從抗氧化酶活性和炎癥反應相關(guān)基因表達水平揭示氨氮脅迫對翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）幼魚機體的毒性效應機制，為其健康養(yǎng)殖與水質(zhì)調(diào)控管理提供科學依據(jù)?！痉椒ā刻暨x規(guī)格整齊、體表無損傷的翹嘴鱖幼魚進行96 h急性氨氮脅迫試驗，在獲得半致死濃度（LC50）的基礎上，將翹嘴鱖幼魚暴露于48.65 mg/L的水體氨氮下，以完全曝氣的自來水（氨氮實測值為0.05 mg/L）為對照組，分別于脅迫0、6、12、24、48和96 h后測定抗氧化酶活性及炎癥反應相關(guān)基因的相對表達量?！窘Y(jié)果】翹嘴鱖幼魚的96 h-LC50為48.65 mg/L（非離子氨0.47 mg/L）。翹嘴鱖幼魚在96 h的急性氨氮脅迫過程中，其肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和谷胱甘肽（GSH）含量均呈先升高后降低的變化趨勢;脂質(zhì)過氧化物（LPO）在肝臟中的累積量隨脅迫時間的延長逐漸增加，至脅迫96 h時達最高值（0.50 μmol/g），顯著高于對照組（P<0.05，下同）。與對照組翹嘴鱖幼魚相比，經(jīng)氨氮脅迫后翹嘴鱖幼魚肝臟IL-1β和IL-8基因的相對表達量均呈升高—降低—升高的變化趨勢，于脅迫6 h起顯著上調(diào)，分別于脅迫12和96 h時達最高值;TNF-α基因的相對表達量整體上呈先降低后升高的變化趨勢，在脅迫6 h時顯著低于對照組，但至脅迫96 h時其相對表達量達最高值;IL-1β、IL-8和TNF-α基因的相對表達量在脅迫96 h時均顯著高于對照組;HSP90α基因的相對表達量呈先升高后降低的變化趨勢，至脅迫96 h時，其相對表達量顯著低于對照組。【結(jié)論】氨氮脅迫初期，翹嘴鱖幼魚抗氧化系統(tǒng)被誘導激活，炎癥反應相關(guān)基因表達上調(diào);至脅迫后期，翹嘴鱖幼魚抗氧化功能受抑制，而炎癥反應相關(guān)基因表達持續(xù)上調(diào)。說明持續(xù)炎癥反應及抗氧化系統(tǒng)功能受抑制是翹嘴鱖氨氮中毒死亡的主要原因。

關(guān)鍵詞： 翹嘴鱖;氨氮脅迫;抗氧化酶;炎癥反應相關(guān)基因;96 h半致死濃度（96 h-LC50）

中圖分類號： S965.127? ? ? ? ? ? &nbsp; ? ? ? &nbsp; ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）08-1860-09

Effects of acute ammonia nitrogen stress on antioxidant enzymes activity and gene expression involved in inflammation

of juvenile Siniperca chuatsi

LIU Yu1， DING Wei-dong2， CAO Zhe-ming2， BING Xu-wen2*， XU Chang1，2，

YANG Fan1，2， ZHANG Chen-guang1，2， GU Xin-chi1， SUN A-jun2

（1Wuxi Fisheries College，Nanjing Agricultural University，Wuxi， Jiangsu? 214081，China; 2Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuxi， Jiangsu? 214081， China）

Abstract：【Objective】In this study， antioxidant enzyme activity and expression level of genes involved in inflammation were studied to reveal the toxicity mechanism of juvenile Siniperca chuatsi under ammonia nitrogen stress to provide scientific basis for healthy breeding and water quality control management. 【Method】Undamaged juvenile S. chuatsi similar to each other in size were selected for 96 h acute ammonia nitrogen stress experiments. Using the obtained half lethal concentration（LC50） of ammonia-nitrogen in S. chuatsi as a basic concentration，the juvenile S. chuatsi were exposed to 48.65 mg/L concentration of ammonia nitrogen in water for 96 h. Fully aerated tap water（measured ammonia nitrogen value was 0.05 mg/L） was as control group. The activity of antioxidant enzymes and the expression of genes involved in inflammation were measured at 0， 6， 12， 24， 48? and 96 h respectively after stress. 【Result】The 96 h-LC50 of juvenile S. chuatsi was 48.65 mg/L（nonionic ammonia 0.47 mg/L）. In this study， the superoxide dismutase（SOD） activity， catalase （CAT） activity and glutathione（GSH） content in the liver of the experimental group have a tendency of increasing first and then decreasing. The accumulation of lipid peroxide（LPO） in liver increased gradually with the prolongation of stress time， and reached the maximum value at 96 h（0.50 μmol/g）， which was significantly higher than the control group（P<0.05， the same below）. Compared with control group， the relative expression of IL-1β and IL-8 genes in the liver of juvenile S. chuatsi presented up-down-up trend after ammonia nitrogen stress， and was significantly increased after 6 h stress， and peaked at 12 and 96 h after stress. The relative expression of TNF-α gene presented down-up trend as a whole， and was significantly lower than control after 6 h of stress， and reached the peak at 96 h. At 96 h of stress effect， the relative expressions of IL-1β and IL-8， TNF-α genes were all significantly higher than that of the control group. There was a tendency of increasing first then decreasing in the relative expression of HSP90α gene. After 96 h of stress effect， the relative expression of HSP90α gene was significantly lower than that of the control group. 【Conclusion】In the early stage of stress， the antioxidant system of juvenile S. chuatsi is induced to activation and the relative expression of inflammation-related genes up-regulates. However， in the late stage of stress， antioxidant function is inhibited and the relative expression of inflammation-related genes continue up-regulating. It is suggested that continuous inflammatory reaction and inhibition of antioxidant system may lead to the death of S. chuatsi exposed to ammonia nitrogen.

Key words： Siniperca chuatsi; ammonia nitrogen stress; antioxidant enzymes; inflammation-related genes; 96 h half lethal concentration（96 h-LC50）

0 引言

【研究意義】水體中的氨氮構(gòu)成主要包括離子氨（NH4+）和非離子氨（NH3）兩種形式，且主要來源于食物殘渣、動植物生長代謝及死亡個體分解等（徐楊等，2015）。氨氮主要是以NH3的形式經(jīng)魚鰓、表皮和腸黏膜等組織進入魚體，氨氮中毒會導致魚類生長速度遲緩、免疫水平低下，同時伴有氧化應激和炎癥反應的發(fā)生，進一步誘發(fā)各種疾?。ㄕ颅偟?，2015;付瑩和趙玉蓉，2018）。因此，探究氨氮對魚類的毒性效應與耐受限度，分析氨氮脅迫下魚類的生理生化指標及相關(guān)基因的表達變化規(guī)律，對揭示氨氮脅迫對魚類的毒性作用機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】隨著生物體內(nèi)氨氮含量的升高，不僅導致腦腫脹，還能誘導生成具有神經(jīng)毒性的NO（Veauvy et al.，2005）。NO促使機體產(chǎn)生氧化應激，同時生成對機體危害性更強的NO2，進而引發(fā)機體細胞呼吸障礙，誘導細胞凋亡（Rodrigo et al.，2009;Braissant et al.，2013）。黃云（2013）、劉永波和王雅倩（2016）研究表明，氨氮脅迫下魚類出現(xiàn)生長停滯、免疫水平低下甚至大批量死亡現(xiàn)象。Zhang等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）在氨氮中毒的情況下其肝臟抗氧化與炎癥反應相關(guān)基因表達水平均顯著上調(diào)。此外，大量研究表明暴露于高濃度氨氮環(huán)境中的魚類出現(xiàn)不同程度肝臟細胞腫大或空泡化等損傷壞死現(xiàn)象（Sitp-Bobadilla and Alvarez-Pellitero，2009;張武肖等，2015），嚴重影響肝臟的生理機能。在羅非魚（Oreochroms mossambcus）（強俊等，2011）、鯉魚（Cyprinus carpio）（姜會民，2012）、草魚（Grass carp）（周鑫等，2013）、斑馬魚（Danio rerio）（周瑩等，2016）、尖吻鱸（Latescal carifer）（劉亞娟等，2018）的相關(guān)研究中均發(fā)現(xiàn)氨氮脅迫能誘導抗氧化相關(guān)酶活性呈規(guī)律性變化，整體上表現(xiàn)為低濃度誘導、高濃度抑制。【本研究切入點】翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）隸屬于鱸形目（Perciformes）真鱸科（Percichthyidae）鱖屬（Siniperca），為兇猛的肉食性魚類，具有肉質(zhì)鮮美、高蛋白低脂肪等特點，是營養(yǎng)價值極高的特種水產(chǎn)經(jīng)濟動物（吳斌等，2015;顏元杰等，2019）。近年來，翹嘴鱖野生資源銳減與優(yōu)質(zhì)魚類蛋白需求劇增間的矛盾不斷擴大，促使翹嘴鱖規(guī)?；B(yǎng)殖得到快速發(fā)展，因此如何科學調(diào)控翹嘴鱖養(yǎng)殖水體氨氮水平已成為健康養(yǎng)殖管理的重點內(nèi)容之一?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究急性氨氮脅迫下翹嘴鱖幼魚的抗氧化酶活性及炎癥反應相關(guān)基因的表達變化規(guī)律，從酶活性和基因表達水平揭示氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚機體的毒性效應機制，為其健康養(yǎng)殖與水質(zhì)調(diào)控管理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗用魚

翹嘴鱖幼魚取自南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院南泉養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)于室內(nèi)控溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（400 L/桶）。選取體表無損傷、規(guī)格整齊的翹嘴鱖幼魚300尾，試驗開始前在室內(nèi)控溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)14 d，暫養(yǎng)期間保持自然光照周期，暫養(yǎng)水體條件：溶氧≥6 mg/L、氨氮≤0.05 mg/L、水溫（22±0.5）℃、pH 7.8±0.5。暫養(yǎng)期間以1～2 g/尾的鳊魚幼魚為餌料，每2 d投放1次，投喂量為翹嘴鱖體重的2倍。

1. 2 氨氮脅迫96 h半致死濃度（96 h-LC50）測試

于室內(nèi)控溫循環(huán)水系統(tǒng)暫養(yǎng)14 d后，選取規(guī)格整齊的翹嘴鱖幼魚120尾（13.55±0.69 g/尾）進行半致死濃度（LC50）測試。設0、30、60和90 mg/L NH4Cl四個梯度濃度，每組濃度3個平行，每個平行放10尾幼魚。在96 h觀測期間保持水體靜止，停止進食，持續(xù)充氧[溶解氧（DO）=6.28±0.10 mg/L]，水溫（22±0.5）℃，pH 7.6±0.3，每隔8 h使用W-1型多參數(shù)水質(zhì)分析儀（杭州陸恒生物科技有限公司）檢測水體氨氮濃度，以10 g/L NH4Cl母液調(diào)整至試驗設計的氨氮濃度，每隔24 h換水1/4。觀測翹嘴鱖幼魚的活動變化情況，計數(shù)并撈出死亡個體（魚體側(cè)翻且鰓蓋停止扇動視為死亡）。

1. 3 試驗設計與樣品采集

暫養(yǎng)結(jié)束后，依據(jù)96 h-LC50設對照組（0 mg/L）和試驗組（48.65 mg/L），選取體質(zhì)量相近、活性良好的翹嘴鱖幼魚180尾（13.31±0.49 g/尾）隨機平均放入6個400 L養(yǎng)殖桶中（試驗組和對照組各設3個平行），每桶30尾魚。對照組為完全曝氣的自來水（氨氮實測值為0.05 mg/L）。氨氮脅迫時長為96 h，期間保持水體靜止，停止進食，持續(xù)充氧（DO=6.13±0.12 mg/L），水溫（22±0.5）℃，pH 7.7±0.5，每隔8 h使用W-1型多參數(shù)水質(zhì)分析儀檢測水體氨氮濃度，以10 g/L NH4Cl母液調(diào)整至試驗設計的氨氮濃度，每隔24 h換水1/4。在氨氮脅迫0、6、12、24、48和96 h時，每桶分別隨機選擇3尾翹嘴鱖并用50 mg/L MS-222進行輕度麻醉，采集幼魚活體的肝臟用生理鹽水漂洗，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 總RNA提取與實時熒光定量PCR檢測

采用宋美澤等（2018）的方法提取肝臟總RNA，即采用北京康為世紀生物科技有限公司提供的RNApure Tissue Kit試劑盒進行提取，然后使用HIFIscript cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；贜CBI數(shù)據(jù)庫獲得的IL-1β、IL-8、HSP90α和TNF-α基因開放閱讀框序列，以β-actin為管家基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫的Primer-BLAST程序中完成引物設計，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。實時熒光定量PCR反應體系20.0 μL：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，上、下游各0.4 μL，cDNA模板0.8 μL，ddH2O 8.4 μL。擴增程序：95 ℃預變性10 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，進行39個循環(huán);60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

1. 5 抗氧化酶活性檢測

過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、脂質(zhì)過氧化物（LPO）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。取0.1 g肝臟樣品加入9倍體積的預冷生理鹽水，研磨成組織勻漿，4 ℃下3000 r/min離心10 min，制備待測樣本，然后按試劑盒說明進行操作，以BioTek EonTM微孔板分光光度計進行檢測讀數(shù)。

1. 6 統(tǒng)計分析

翹嘴鱖幼魚96 h-LC50分析采用直線內(nèi)插法，以SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，包括單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 翹嘴鱖幼魚96 h-LC50測定結(jié)果

翹嘴鱖幼魚暴露于不同氨氮梯度濃度水體后均出現(xiàn)躁動不安、四處游動的應激反應，且應激反應時間及程度隨氨氮濃度的升高而加劇。氨氮脅迫后期，翹嘴鱖幼魚尾鰭不同程度地向內(nèi)側(cè)弓起，尤其在90 mg/L NH4Cl試驗組中尾鰭與身體幾乎成直角，魚體游動遲緩，對應的死亡率（96.67%）（表2）也顯著高于其他處理組（P<0.05，下同）。氨氮脅迫96 h后統(tǒng)計死亡的翹嘴鱖幼魚個體，通過直線內(nèi)插法計算得出翹嘴鱖幼魚的96 h-LC50為48.65 mg/L（非離子氨0.47 mg/L）。

2. 2 急性氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚肝臟抗氧化相關(guān)酶活性的影響

2. 2. 1 SOD活性 如圖1所示，對照組翹嘴鱖幼魚肝臟SOD活性無顯著變化（P>0.05，下同），試驗組翹嘴鱖幼魚在96 h的急性氨氮脅迫過程中其肝臟SOD活性呈先升高后降低的變化趨勢。氨氮脅迫6 h時，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟SOD活性顯著升高，至脅迫12 h時肝臟SOD活性達最高值（396.00 U/mg），是對照組翹嘴鱖幼魚的1.34倍，隨后呈明顯的下降趨勢，至脅迫96 h時已顯著低于對照組。

2. 2. 2 CAT活性 如圖2所示，對照組翹嘴鱖幼魚肝臟CAT活性無顯著變化，試驗組翹嘴鱖幼魚在96 h的急性氨氮脅迫過程中其肝臟CAT活性呈降低—升高—降低的變化趨勢。氨氮脅迫6 h時，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟CAT活性與對照組無顯著差異，但脅迫12 h時試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟CAT活性顯著高于對照組，且呈持續(xù)升高趨勢;至脅迫48 h時肝臟CAT活性達最高值（77.09 U/mg），是對照組的1.75倍，隨后開始下降，至脅迫96 h時試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟CAT活性仍顯著高于對照組。

2. 2. 3 GSH含量 如圖3所示，對照組翹嘴鱖幼魚肝臟GSH含量無顯著變化，試驗組翹嘴鱖幼魚在96 h的急性氨氮脅迫過程中其肝臟GSH含量變化趨勢與CAT活性相似。氨氮脅迫12 h時，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟GSH含量顯著高于對照組，且呈持續(xù)升高趨勢;脅迫至24 h時肝臟GSH含量達最高值（88.84 μmol/g），是對照組的1.57倍，隨后開始下降，至脅迫96 h時試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟GSH含量顯著低于對照組。

2. 2. 4 LPO含量 如圖4所示，對照組翹嘴鱖幼魚肝臟LPO含量無顯著變化，試驗組翹嘴鱖幼魚在96 h的急性氨氮脅迫過程中其肝臟LPO含量整體上呈逐漸升高趨勢。氨氮脅迫12 h時，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟LPO含量顯著高于對照組，隨后肝臟LPO含量持續(xù)升高，至脅迫96 h時達最大值（0.50 μmol/g），是對照組的3.77倍。

2. 3 急性氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚炎癥反應相關(guān)基因表達的影響

2. 3. 1 IL-1β基因 在96 h的急性氨氮脅迫過程中，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟IL-1β基因的相對表達量呈升高—降低—升高的變化趨勢（圖5）。氨氮脅迫12 h時，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟IL-1β基因的相對表達量達最高值，隨后呈下降趨勢，至脅迫96 h時肝臟IL-1β基因的相對表達量再次上調(diào);從氨氮脅迫6 h起，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟IL-1β基因的相對表達量均顯著高于對照組。

2. 3. 2 IL-8基因 如圖6所示，對照組翹嘴鱖幼魚肝臟IL-8基因的相對表達量無顯著變化，而試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟IL-8基因的相對表達量在急性氨氮脅迫過程中呈明顯升高—降低—升高的變化趨勢。氨氮脅迫12 h時，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟IL-8基因的相對表達量出現(xiàn)第一個峰值，但至脅迫24 h時肝臟IL-8基因的相對表達量降至最低值，顯著低于對照組，隨后再次上調(diào)，至脅迫96 h時肝臟IL-8基因的相對表達量上調(diào)至最高值，是對照組的1.71倍。

2. 3. 3 TNF-α基因 在96 h的急性氨氮脅迫過程中，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟TNF-α基因的相對表達量整體上呈先降低后升高的變化趨勢（圖7）。氨氮脅迫6 h時，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟TNF-α基因的相對表達量下調(diào)，顯著低于對照組，隨后肝臟TNF-α基因的相對表達量呈逐漸上調(diào)趨勢，至脅迫96 h時其相對表達量上調(diào)至最高值，是對照組的1.63倍。

2. 3. 4 HSP90α基因 在96 h的急性氨氮脅迫過程中，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟HSP90α基因的相對表達量呈先升高后降低的變化趨勢（圖8）。氨氮脅迫6 h時，試驗組翹嘴鱖幼魚肝臟HSP90α基因的相對表達量顯著上調(diào)，至脅迫12 h時其相對表達量上調(diào)至最高值，是對照組的4.08倍;隨后開始逐漸下調(diào)，至脅迫96 h時翹嘴鱖幼魚肝臟HSP90α基因的相對表達量顯著低于對照組。

3 討論

3. 1 急性氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚的毒性效應

氨氮是養(yǎng)殖水質(zhì)檢測的重要指標之一，氨氮水平升高會對養(yǎng)殖魚類造成生長抑制、代謝紊亂、組織損傷及免疫力低下等不良影響，甚至造成魚類死亡（付瑩和趙玉蓉，2018）。不同魚類對氨氮暴露脅迫的耐受上限存在明顯差異，斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）幼魚的96 h-LC50為5.13 mg/L（鄭樂云，2012），大黃魚（Pseudosciaena crocea）幼魚的96 h-LC50為1.25 mg/L（阮成旭等，2014），團頭魴幼魚的96 h-LC50為56.49 mg/L（張武肖等，2015），鯽魚幼魚的96 h-LC50為0.73 mg/L（Wang et al.，2017），大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）幼魚的96 h-LC50為8.99 mg/L（宋美澤等，2018）。本研究結(jié)果表明，翹嘴鱖幼魚的96 h-LC50為48.65 mg/L（非離子氨0.47 mg/L），與團頭魴幼魚（張武肖等，2015）相近，但高于斜帶石斑魚（鄭樂云，2012）、大黃魚（阮成旭等，2014）、鯽魚（Wang et al.，2017）和大彈涂魚（宋美澤等，2018）的幼魚。翹嘴鱖幼魚的氨氮耐受程度較高，可能與其肉食性且棲于水體底層的生活習性有關(guān)。魚體規(guī)格差異也可能導致其氨氮耐受限度不同。劉建魁等（2014）、李之鄉(xiāng)等（2017）在史氏鱘（Acipenser schrencki）幼魚和大菱鲆（Scophthalmus maximus）幼魚的氨氮毒性研究中發(fā)現(xiàn)，96 h-LC50與幼魚的體質(zhì)量呈正相關(guān)。本研究檢測的翹嘴鱖幼魚體質(zhì)量為13.55±0.69 g/尾，可能是導致其96 h-LC50較高的原因之一，但具體原因尚有待進一步探究。

3. 2 急性氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚肝臟抗氧化相關(guān)酶活性的影響

在良好的水質(zhì)環(huán)境中，魚類體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)可有效清除生理代謝活動生成的活性氧自由基（ROS）。當水體中氨氮濃度升高時，魚體內(nèi)發(fā)生一系列應激反應而產(chǎn)生大量ROS，當ROS含量超出抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)閾值時，機體即出現(xiàn)氧化損傷，甚至死亡（胡靜等，2016）。SOD、CAT和GSH等是機體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，抗氧化系統(tǒng)通過三者的協(xié)同作用以降低氧化應激所造成的損傷（陶易凡等，2016）。本研究結(jié)果表明，抗氧化酶SOD、CAT活性和抗氧化物質(zhì)GSH含量在急性氨氮脅迫過程中均呈先升高后降低的變化趨勢。氨氮脅迫12 h時，翹嘴鱖幼魚肝臟SOD和CAT活性及GSH含量升高，且均顯著高于對照組，說明氨氮脅迫初期水質(zhì)環(huán)境中其含量變化引起翹嘴鱖幼魚體內(nèi)的ROS含量增加，誘導SOD、CAT活性和GSH含量升高，提高機體的抗氧化防御能力而及時清除過多的ROS，以維持代謝平衡;脅迫24 h后，翹嘴鱖幼魚肝臟SOD活性和GSH含量出現(xiàn)下降趨勢，脅迫48 h后CAT活性也開始回落，至脅迫96 h時翹嘴鱖幼魚肝臟SOD活性和GSH含量均顯著低于對照組，可能是隨著氨氮脅迫時間的延長，魚體內(nèi)ROS含量已超出抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)閾值，肝臟組織受到氨氮毒性影響，而抑制抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)合成，抗氧化功能被削弱，與胡毅等（2012）、Jia等（2017）的研究報道一致。在本研究中，SOD、CAT和GSH三者具有協(xié)同作用，但對急性氨氮脅迫的應激響應速度并未同步，可能與三者在氧化應激防御體系中所承擔的功能不同有關(guān)。

LPO是ROS作用于脂質(zhì)過氧化反應中產(chǎn)生的細胞毒性物質(zhì)，其含量能反映機體脂質(zhì)過氧化水平和細胞損傷程度，同時間接反映機體的ROS含量（何吉祥等，2016;祁紅學等，2017）。本研究結(jié)果表明，氨氮脅迫6 h時，翹嘴鱖幼魚肝臟LPO含量與對照組無顯著差異，說明在氨氮脅迫初期，SOD、CAT活性和GSH含量顯著上升，機體內(nèi)的氧化自由基能被及時清除;氨氮脅迫48 h后，翹嘴鱖幼魚肝臟LPO含量急劇上升，說明隨著氨氮脅迫時間的延長，魚體內(nèi)ROS含量急劇上升，同時SOD活性與GSH含量顯著低于對照組，即抗氧化系統(tǒng)受到嚴重損傷，導致LPO含量急劇增加。

3. 3 急性氨氮脅迫對翹嘴鱖幼魚肝臟炎癥反應相關(guān)基因表達的影響

隨著機體內(nèi)氨氮濃度不斷升高，魚類常出現(xiàn)生長遲緩、肝臟病變及免疫水平降低等不良反應;同時，高濃度氨氮能突破血腦屏障，導致神經(jīng)膠質(zhì)細胞腫大，激活N-甲基-D天冬氨酸受體而誘發(fā)氧化應激、炎癥反應及細胞凋亡（Zhang et al.，2018）。Qi等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，長期低濃度的氨氮脅迫可誘導鯉魚炎癥反應相關(guān)基因（TNF-α和IL-1β）的表達。本研究結(jié)果表明，氨氮脅迫6 h后，翹嘴鱖幼魚肝臟IL-1β和IL-8基因的相對表達量顯著上調(diào)，說明脅迫初期在外源性氨氮的毒性作用下，魚體代謝平衡受到干擾并產(chǎn)生毒性興奮效應，在機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制啟動抗氧化防御及一系列修復機制的同時，上調(diào)炎癥反應相關(guān)基因表達（Xing et al.，2016）;但脅迫12～24 h期間，翹嘴鱖幼魚肝臟IL-1β、IL-8和TNF-α基因的相對表達量均呈下調(diào)趨勢，說明炎癥反應相關(guān)基因大量表達并招募白細胞以應對脅迫時，為避免持續(xù)的炎癥反應錯誤破壞正常組織器官生理代謝平衡，魚體能適時調(diào)控炎癥反應相關(guān)基因的表達（Li et al.，2016），與宋美澤等（2018）的研究結(jié)論一致;但脅迫48 h后，翹嘴鱖幼魚肝臟IL-1β、IL-8和TNF-α基因的相對表達量再次顯著上調(diào)，可能與過度氨氮暴露導致的ROS與炎癥因子累積有關(guān)，與Cheng等（2015）的研究報道一致。Chandra等（2000）研究指出，雖然機體生理調(diào)節(jié)機制能修復應激損傷，但應激水平超過調(diào)節(jié)閾值時，將誘發(fā)代謝紊亂及細胞凋亡等不良反應。持續(xù)氨氮脅迫導致氧化應激產(chǎn)生的大量ROS不僅誘導細胞凋亡，還能引發(fā)炎癥反應，激活NF-κB信號通路，誘導表達一系列炎癥反應相關(guān)基因，誘發(fā)線粒體自噬與細胞凋亡進而應激致死（Ai et al.，2011;Jia et al.，2014）。

熱休克蛋白（HSPs）是生物體在應激條件下產(chǎn)生具有抗逆性的應激蛋白（金曄等，2018），其中，HSP90α在多種脅迫條件下均能誘導表達，因此常作為評估生物應激水平的生物標志物（劉童，2015;賈利興，2016）。本研究結(jié)果表明，氨氮脅迫6 h時，翹嘴鱖幼魚肝臟HSP90α基因的相對表達量顯著上調(diào)，提示機體的氧化應激和炎癥反應水平不斷升高，而誘導HSP90α基因表達上調(diào)以修復受損細胞與變性蛋白;至脅迫12 h時其相對表達量上調(diào)至最高值，隨后HSP90α基因的相對表達量持續(xù)下調(diào)，可能與機體的氧化應激和炎癥反應進一步加劇且超出機體調(diào)節(jié)閾值有關(guān)。過度的氧化應激與炎癥因子積累可能導致機體免疫水平下降及新陳代謝紊亂，進而導致HSP90α基因的相對表達量下調(diào)，機體自我修復功能下降，與王蕓等（2013）的研究結(jié)論一致。

4 結(jié)論

氨氮脅迫初期，翹嘴鱖幼魚抗氧化系統(tǒng)被誘導激活，炎癥反應相關(guān)基因表達上調(diào);至脅迫后期，翹嘴鱖幼魚抗氧化功能受抑制，而炎癥反應相關(guān)基因表達持續(xù)上調(diào)。說明持續(xù)炎癥反應及抗氧化系統(tǒng)功能受抑制是翹嘴鱖氨氮中毒死亡的主要原因。

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（責任編輯 蘭宗寶）