溫思思 徐云飛 鄒真瑤 趙偉春

摘要：目的：通過檢測(cè)浙貝母黑斑病病原真菌對(duì)常用殺菌劑的敏感性，篩選抑菌效果好的藥劑用于田間防治。方法：采用菌絲生長(zhǎng)速率法和抑菌圈法測(cè)定鏈格孢菌Alternaria alternata和細(xì)極鏈格孢菌Alternaria tenuissima的菌絲和孢子對(duì)咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲的敏感性。結(jié)果：經(jīng)生長(zhǎng)速率法檢測(cè)，咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲對(duì)鏈格孢菌菌絲的 EC50（concentration for 50% of maximal effect，半最大效應(yīng)濃度）分別為0.798μg/mL、1.023 μg/mL和0.015 μg/mL，對(duì)細(xì)極鏈格孢菌的 EC50分別為0.976 μg/mL、0.948 μg/mL和0.014 μg/mL。經(jīng)抑菌圈法檢測(cè)，兩種致病菌孢子對(duì)咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和異菌脲的最低敏感濃度分別為3.75μg/mL、2.50μg/mL和31.25μg/mL。結(jié)論：異菌脲對(duì)鏈格孢菌和細(xì)極鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)︽咦用劝l(fā)的抑制率較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：浙貝母;黑斑病;鏈格孢菌;細(xì)極鏈格孢菌;藥物敏感性

中圖分類號(hào)：S435.67 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-2177（2019）08-0121-04

浙貝母黑斑病是危害浙貝母的真菌性病害，受害植株提早枯死，地下鱗莖瘦小，造成嚴(yán)重減產(chǎn)，多雨年份發(fā)病尤其嚴(yán)重[1]。生產(chǎn)上主要以化學(xué)防治為主，輔以生物及生態(tài)防治[2]。然而目前還未有防治浙貝母黑斑病的登記藥劑，生產(chǎn)中盲目用藥的現(xiàn)象十分普遍[3， 4]。因此，急需篩選出有效的針對(duì)浙貝母黑斑病的高效藥劑。通過對(duì)磐安縣浙貝母種植區(qū)的田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲是目前常用的3種殺菌劑。本實(shí)驗(yàn)采用生長(zhǎng)速率法[5]和抑菌圈法[6-7]對(duì)浙貝母黑斑病病原真菌鏈格孢菌和細(xì)極鏈格孢菌與咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲3種殺菌劑的藥物敏感性進(jìn)行研究，為浙貝母黑斑病防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鏈格孢菌和細(xì)極鏈格孢菌均由本實(shí)驗(yàn)室提供。45%咪鮮胺水乳劑：斯特貝爾作物保護(hù)有限公司，批號(hào)：HNP37295-C1827;10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑：山東貴合生物科技有限公司，批號(hào)：SNA8C00115;500g/L異菌脲懸浮劑：蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司，批號(hào)：HNP32126-D4092。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌懸液制備

將鏈格孢菌、細(xì)極鏈格孢菌分別接種于PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5d。用無菌的PBS洗滌培養(yǎng)基上的菌絲和孢子，收集于50mL離心管中，收集孢子時(shí)先用無菌紗布過濾，再用無菌的PBS洗滌離心兩次后計(jì)數(shù)，備用。

1.2.2 藥物敏感性檢測(cè)

（1）生長(zhǎng)速率法：用無菌水將3種試驗(yàn)藥液配制成7個(gè)不同濃度，隨后將PDA培養(yǎng)基冷卻至60℃，并按照藥液：培養(yǎng)基=1：9的配比，配置出新的含藥培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加等量無菌水的培養(yǎng)基。用無菌打孔器（直徑為9 mm）從生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落邊緣打下菌餅，將菌餅的菌絲面朝下接種到各含藥液及空白對(duì)照培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3～4d。十字交叉法測(cè)量各菌落的直徑，每處理重復(fù)6次，取平均值（mm），計(jì)算菌絲的生長(zhǎng)抑制率和EC50（SPSS軟件計(jì)算）。

生長(zhǎng)抑制率（%）=[（1-（處理菌落直徑-菌餅直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）] ×100

（2）抑菌圈法：吸取孢子懸液100μL，均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，使用無菌打孔器在平板上打直徑6mm的孔5個(gè)，用無菌針頭挑出孔內(nèi)瓊脂。向孔內(nèi)加入100μL一定濃度的藥液（濃度見表1），以無菌水作為空白對(duì)照，28℃培養(yǎng)3-4天后觀察抑菌圈大小，每處理重復(fù)4次，求平均值（mm）。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

結(jié)果見圖1-圖3。當(dāng)咪鮮胺濃度在0.012～12μg/mL時(shí)，對(duì)鏈格孢菌和細(xì)極鏈格孢菌菌絲的抑制率分別為 4.56%～90.01%和5.00%～85.70%，EC50分別為 0.798和0.976μg/mL;當(dāng)苯甲醚環(huán)唑濃度在 0.0002～200μg/mL時(shí)，其對(duì)兩種真菌的抑制率分別為3.45%～81.92%和4.12%～82.82%，EC50分別為1.023和0.948μg/mL;當(dāng)異菌脲濃度在0.00005～50μg/mL時(shí)，其對(duì)兩種真菌的抑制率分別為15.71%～94.83%和16.19%～94.76%，EC50分別為0.015和0.014μg/mL。3種藥劑對(duì)鏈格孢菌的毒力回歸方程的斜率分別為0.9724、0.4602和0.4194，對(duì)細(xì)極鏈格孢菌的毒力回歸方程的斜率分別為0.9092、0.4679和0.4155。表明異菌脲對(duì)鏈格孢菌的毒力活性最強(qiáng)，鏈格孢菌對(duì)咪鮮胺的敏感性最好，其次為苯醚甲環(huán)唑。

2.2 抑菌圈法測(cè)定不同藥劑對(duì)真菌孢子的抑制作用

結(jié)果見表1。咪鮮胺在3.75～120μg/mL時(shí)，對(duì)鏈格孢菌和細(xì)極鏈格孢菌的抑菌圈分別為5.25～21.25和5.00～23.25mm，抑制程度均從不敏到極敏;苯醚甲環(huán)唑在2.5～80μg/mL時(shí)，對(duì)兩種真菌的抑菌圈分別為8.00～26.00和8.50～27.25mm，抑制程度均從低敏到極敏;異菌脲在31.25～1000μg/mL時(shí)，抑菌圈分別為9.75～24.25和9.75～23.25mm，抑制程度均從低敏到極敏。因此，苯醚甲環(huán)唑?qū)︽湼矜呔图?xì)極鏈格孢菌的抑制作用最強(qiáng)，其次為咪鮮胺。

3 討論

從生長(zhǎng)速率法和抑菌圈法所測(cè)的結(jié)果可知，咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲等三種藥劑對(duì)浙貝母黑斑病病原真菌鏈格孢菌與細(xì)極鏈格孢菌的菌絲生長(zhǎng)速率與孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用。其中兩種病原真菌對(duì)同一種殺菌劑的敏感性差別不大，田間用藥時(shí)不必考慮該病的真菌種類。

在生長(zhǎng)速率法測(cè)定中，EC50值大小為衡量藥劑毒力大小的重要指標(biāo)，其值越與藥劑的毒力成反比。殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定中EC50值越小、斜率越大，則說明病原菌對(duì)藥劑的反應(yīng)靈敏度越高，即隨著濃度的增加，抑制率明顯增大[8]。本實(shí)驗(yàn)中，就不同殺菌劑而言，異菌脲的EC50小、斜率大，對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的抑制率最強(qiáng)。

在抑菌圈法的結(jié)果中，咪鮮胺與苯醚甲環(huán)唑?qū)︽咦用劝l(fā)的抑制率明顯優(yōu)于異菌脲，此種情況與3種藥劑不同的作用機(jī)制有關(guān)。咪鮮胺通過抑制麥角甾醇的生物合成，從而使菌體細(xì)胞膜功能受破壞而起作用，在植物體內(nèi)有一定的內(nèi)吸傳導(dǎo)作用。苯醚甲環(huán)唑具有保護(hù)、治療和內(nèi)吸活性，是甾醇脫甲基化抑制劑，抑制細(xì)胞壁甾醇的生物合成，阻止真菌的生長(zhǎng)。異菌脲能抑制蛋白激酶，控制許多細(xì)胞功能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，包括碳水化合物結(jié)合進(jìn)入真菌細(xì)胞組分的干擾作用[9-11]。因此可以嘗試將咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑用于鏈格孢屬菌引起的浙貝母黑斑病的預(yù)防和早期防治，并建 議在生產(chǎn)中可交替使用苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺，以便更好地控制病害的發(fā)生，減少抗藥性的產(chǎn)生;異菌脲則用于黑斑病的中晚期，以便控制菌絲大量生長(zhǎng)。同時(shí)3種藥劑毒力回歸方程的斜率都低于1，病原真菌是否已經(jīng)產(chǎn)生一定的抗藥性，田間生產(chǎn)是否可以考慮敏感性更高的藥劑用于鏈格孢屬引發(fā)的浙貝母黑斑病的防治。由于藥劑的劑型不同，考慮的溶解度、濾紙片吸附性、操作便捷等因素，并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此次抑菌實(shí)驗(yàn)擯棄濾紙片法和牛津杯法，而是采用平皿打孔法技術(shù)[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅為室內(nèi)測(cè)定結(jié)果，只能說明咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和異菌脲3種藥劑在離體條件下對(duì)病原真菌的直接作用，并不能準(zhǔn)確反映其在田間的防治效果，因此，有待進(jìn)一步的田間試驗(yàn)，以便在生產(chǎn)上更好的推廣和使用。

此外本次實(shí)驗(yàn)我們實(shí)驗(yàn)室只采用三種黑斑病防治常用藥劑，文獻(xiàn)表明，腐霉利、三唑酮、啶菌惡唑、嘧菌酯等藥劑對(duì)黑斑病病原菌也有抑制作用，若想對(duì)浙貝母黑斑病進(jìn)行有效防治，應(yīng)結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)，對(duì)其他藥劑綜合研究。

參考文獻(xiàn)

[1]寧榮彬，孫海峰.貝母類中藥材病害防治研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，43（05）：34-37.

[2]呂先真，鄭永利，潘蘭蘭，等.浙貝母主要病害及其綜合防治[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，12（2）：85-86.

[3]Yadav L B， Negi M S. A new leaf spot caused by Alternaria alternata on Swertia spp.[J]. International Journal of Plant Protection， 2016，9（1）：362-364.

[4]鄭玉光，鄧國興，劉翠艷. 河北安國引種新疆產(chǎn)貝母黑斑病發(fā)病規(guī)律研究[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2004，19（2）：27-28.

[5]胡秀榮，鹿連明，蒲占湑等.7種殺菌劑對(duì)柑橘炭疽病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（11）：272-275.

[6]譚才鄧，朱美娟，杜淑霞等.抑菌試驗(yàn)中抑菌圈法的比較研究[J].食品工業(yè)，2016（11）：122-125.

[7]Traub W H， Spohr M， Bauer D. Tentative inhibition zone criteria （Bauer-Kirby agar disk diffusion method） for rifampin against staphylococci[J].Chemotherapy， 2009，33（6）：412-418.

[8]徐建強(qiáng)，平忠良，李慧凱，等.河南省小麥紋枯病菌對(duì)氟環(huán)唑及烯唑醇的敏感性[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，47（1）：36-41.

[9]曹學(xué)仁，車海彥，楊毅，等.2014年海南省橡膠炭疽病菌對(duì)多菌靈和咪鮮胺的敏感性測(cè)定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2015，45（6）：626-631.

[10]華乃震.殺菌劑苯醚甲環(huán)唑的進(jìn)展和應(yīng)用[J].世界農(nóng)藥，2013，35（6）：7-12.

[11]時(shí)春喜，張銳，胡文淵等.6種殺菌劑對(duì)蘋果褐斑病的防治效果[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，27（6）：904-907.