徐萌 楊召陽 李夏云 路宜男 陳依帆 邢翔

摘?要：目的：研究紋藤壺附生菌的分離鑒定及蛋白酶菌株的產(chǎn)酶性質(zhì)。方法：黃渤海潮間帶海域紋藤壺中分離到54株菌株，經(jīng)酪蛋白酶實(shí)驗(yàn)，篩選得到4株高產(chǎn)蛋白酶的菌株，并對其進(jìn)行菌種鑒定、產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件優(yōu)化及產(chǎn)酶活性測定。結(jié)果：經(jīng)篩選，得到4株高產(chǎn)蛋白酶的菌株，編號分別為X8、X18、X21、X48。通過16S rDNA序列分析，結(jié)合透射電鏡及形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測試結(jié)果，初步鑒定X8為河豚毒素假交替單胞菌、X18為喬治亞海桿菌、X21為殺魚假交替單胞菌、X48為康氏菌。通過測定菌株的生長曲線，確定菌株X8發(fā)酵量最高的培養(yǎng)時(shí)間為18h、確定菌株X18發(fā)酵量最高的培養(yǎng)時(shí)間為18h、確定菌株X21發(fā)酵量最高的培養(yǎng)時(shí)間為21h、確定菌株X48發(fā)酵量最高的培養(yǎng)時(shí)間為18 h。在最適培養(yǎng)時(shí)間的基礎(chǔ)上，通過單因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可得產(chǎn)蛋白酶菌株X8的最佳發(fā)酵條件：可溶性淀粉5.0‰、初始pH 7.0、培養(yǎng)基鹽度10‰、培養(yǎng)溫度25℃;X18最佳發(fā)酵條件：可溶性淀粉5.0‰、初始pH 7.0、培養(yǎng)基鹽度15‰、培養(yǎng)溫度30℃;X21最佳發(fā)酵條件：蔗糖5.0‰、初始pH 7.0～8.0、培養(yǎng)基鹽度15‰、培養(yǎng)溫度25℃;X48最佳發(fā)酵條件：可溶性淀粉5.0‰、初始pH 7.0、培養(yǎng)基鹽度15‰、培養(yǎng)溫度25℃。結(jié)論：在優(yōu)化發(fā)酵條件下，X8、X18、X21、X48菌株產(chǎn)蛋白酶酶活力分別達(dá)到707.06、240.00、441.18、328.22 U/mL。該研究為探索潛在的高產(chǎn)蛋白酶菌株提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：分離鑒定;發(fā)酵條件優(yōu)化;蛋白酶

由于微生物培養(yǎng)簡單方便，微生物蛋白酶易大量發(fā)酵生產(chǎn)，因此，微生物蛋白酶日漸成為主要的工業(yè)生產(chǎn)酶制劑來源[1-3]。本試驗(yàn)以黃渤海潮間帶海域的紋藤壺作為研究對象，對藤壺附生菌進(jìn)行菌種的分離鑒定，對部分酪蛋白水解圈與菌落直徑的比值較大的菌株進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化、產(chǎn)酶活性測定，得到高產(chǎn)蛋白酶的菌株及其最適的生長條件，對于探索海洋微生物資源、將有機(jī)廢棄物資源化等具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

1.1.1?材料?紋藤壺，山東省威海市黃海沿海潮間帶（北緯37°31′59″，東經(jīng)122°3′43″）;河豚毒素假交替單胞菌、喬治亞海桿菌、殺魚假交替單胞菌、康氏菌，篩選自紋藤壺樣品。

1.1.2?試劑?福林試劑，美國Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3?培養(yǎng)基?菌種富集液體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、菌種發(fā)酵液體培養(yǎng)基：2216E液體培養(yǎng)基;平板分離固體培養(yǎng)基：2216E固體培養(yǎng)基;酪蛋白酶培養(yǎng)基。

1.2?方法

1.2.1?樣品的采集?于威海黃海污染海域岸邊礁石上，對樣品采用無菌采集。

1.2.2?樣品的處理?將紋藤壺機(jī)體剝離，均質(zhì)30s，接種在富集培養(yǎng)液。置28℃、110 r/min震蕩培養(yǎng)，分別于第0、7、12、24、36 d涂布展開。

1.2.3?紋藤壺附生菌的分離純化?富集培養(yǎng)液進(jìn)行10-1～10-n梯度稀釋，分別將菌液用涂布棒涂布于分離固體培養(yǎng)基平板上，28℃下恒溫培養(yǎng)48h，依菌落形態(tài)篩選目標(biāo)菌。

1.2.4?高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選?制備純化菌株的菌懸液，將20μL菌液加入到已點(diǎn)孔的含有1%的酪蛋白酶培養(yǎng)基平板上，酶為陽性對照、pH 7.2的緩沖液為陰性對照。測量蛋白酶水解圈直徑。

1.2.5?高產(chǎn)蛋白酶菌株的透射電鏡超薄切片觀察及鑒定?菌株的透射電鏡超薄切片觀察：由于光學(xué)顯微鏡的分辨率僅為0.2 μm[4]，借助光學(xué)顯微鏡觀察菌株體內(nèi)的情況[5]時(shí)，無法清晰觀測菌株體內(nèi)直徑在0.2 μm 以下的物質(zhì)顆粒，而電子顯微鏡的分辨率可達(dá)到1～2nm[6]。所以，應(yīng)用高放大倍數(shù)的透射電鏡[7]來對菌體進(jìn)行精準(zhǔn)觀察[8]。由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡室拍攝。參照文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行菌株形態(tài)學(xué)、生理生化測試及分子生物學(xué)鑒定。PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳驗(yàn)證后，送至華大基因科技測序。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對。

1.2.6?高產(chǎn)蛋白酶菌株生長曲線的測定?（1）菌種的復(fù)蘇和發(fā)酵培養(yǎng)：由1.2.3中分離并保存的單個(gè)菌落分離純化。（2）生長曲線測定：取1mL種子培養(yǎng)液接種到50mL菌種發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，于 28℃、110r/min的搖床中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)的0、3、6、9、12、15、18、21h測定OD600值，每個(gè)時(shí)間重復(fù)測定3次。以4株菌菌液培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、所測菌液的平均OD600值為縱坐標(biāo)，繪制出4株菌的生長曲線。

1.2.7?高產(chǎn)蛋白酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化?在各菌株發(fā)酵量達(dá)到最大的培養(yǎng)時(shí)間下，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件，考察碳源、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)鹽度、培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響。在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上考察不同碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉）對菌株生長的影響，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值，考察培養(yǎng)基初始pH值（4、5、6、7、8、9、10）對菌株生長的影響，考察不同培養(yǎng)基鹽度（5‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰）對菌株生長的影響，考察不同培養(yǎng)溫度（15、20、25、30、35、40℃）對菌株生長的影響。最后在上述最適條件下培養(yǎng)該菌株，確定蛋白酶活力。

1.2.8?蛋白酶活力的測定?酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制采用GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》法。以酪氨酸濃度c為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。粗酶液的制備參照文獻(xiàn)[11]、蛋白酶活力以X表示，按式（1）計(jì)算：

X=c×4×N1×10（1）

式（1）中，c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣品最終稀釋液的活力（μg/mL）;4為反應(yīng)試劑的總體積（mL）;N為樣品的稀釋倍數(shù);1為參與反應(yīng)的酶量（mL）;10為反應(yīng)時(shí)間（min）。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌株的分離、篩選和鑒定

2.1.1?紋藤壺附生菌的分離純化?經(jīng)多次分離純化，從紋藤壺中共獲得54種菌株，編號X1～X54。

2.1.2?高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選結(jié)果?從紋藤壺附生菌中篩選獲得多株產(chǎn)蛋白酶的菌株，通過比較這幾株菌的水解圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出4株高產(chǎn)蛋白酶菌株，分別為X8、X18、X21、X48（圖1）。

2.1.3?透射電鏡觀察?由圖2可知，X8為球狀菌，有鞭毛;X18為桿狀菌，有鞭毛;X21為桿狀菌，有鞭毛;X48為桿狀菌，無鞭毛。

2.1.4?形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果?依據(jù)菌株的形態(tài)及生理生化檢測結(jié)果，進(jìn)行菌種的初步歸屬[12-13]。X8菌落呈米白色，表面光滑，濕潤，邊緣不規(guī)則。X18菌產(chǎn)橙色菌落，表面光滑，邊緣不規(guī)則。X21菌產(chǎn)米黃色菌落，表面光滑，邊緣不規(guī)則。X48菌落呈白色，表面光滑，邊緣整齊。各菌株的生理生化特征見附表。

2.1.5?分子生物學(xué)鑒定?經(jīng)PCR擴(kuò)增、測序后獲得基因序列，比對可知，X8菌株序列與河豚毒素假交替單胞菌的16S rDNA序列同源性為99%。結(jié)合透射電鏡及形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征測試結(jié)果，鑒定菌株X8為河豚毒素假交替單胞菌。X18菌株序列與喬治亞海桿菌的16S rDNA序列同源性高達(dá)99%。結(jié)合透射電鏡及形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征測試結(jié)果，鑒定菌株X18為喬治亞海桿菌。X21菌株序列與殺魚假交替單胞菌的16S rDNA序列同源性高達(dá)99%。結(jié)合透射電鏡及形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征測試結(jié)果，鑒定菌株X21為殺魚假交替單胞菌。X48菌株序列與康氏菌的16S rDNA序列同源性高達(dá)99%。結(jié)合透射電鏡及形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征測試結(jié)果，鑒定菌株X48為康氏菌。

2.2?高產(chǎn)蛋白酶菌株的生長曲線

在振蕩培養(yǎng)的條件下，測得4株菌培養(yǎng)0、3、6、9、12、15、18、21h的OD600值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測定3次，取其平均值。細(xì)菌的生長是指細(xì)菌有規(guī)律的增長[14]，在生產(chǎn)中，培養(yǎng)條件的差異直接對細(xì)菌生長規(guī)律、產(chǎn)物的量和生產(chǎn)效率造成影響[15]。菌液的濃度與渾濁度呈正比，渾濁度越大，所測得的OD600值越大，菌液的濃度越大，細(xì)菌數(shù)量越多。從圖3～6中可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，4株菌的OD600值經(jīng)歷了先增大后又逐漸減少的過程，說明4株菌的細(xì)菌數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加經(jīng)歷了先增多后減少的過程。由圖3可知，河豚毒素假交替單胞菌X8在接種后很快開始呈指數(shù)增長。0～15h為對數(shù)生長期、15～18h為平臺(tái)期、18h以后為衰亡期，因此，對這種細(xì)菌進(jìn)行研究時(shí)，選定18h為最佳培養(yǎng)時(shí)間。由圖4可知，喬治亞海桿菌X18在0～3h為生長延遲期、3～15h為對數(shù)生長期、15～18h為平臺(tái)期、18h以后為衰亡期。因此，對這種細(xì)菌進(jìn)行研究時(shí)，選定18h為最佳培養(yǎng)時(shí)間。由圖5可知，殺魚假交替單胞菌X21在0～9h為對數(shù)生長期、9～21h為平臺(tái)期、21h以后為衰亡期。因此，對這種細(xì)菌進(jìn)行研究時(shí)，選定21h為最佳培養(yǎng)時(shí)間。由圖6可知，康氏菌X48在0～12h為對數(shù)生長期、12～18h為平臺(tái)期、18h以后為衰亡期。因此，對這種細(xì)菌進(jìn)行研究時(shí)，選定18h為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.3?高產(chǎn)蛋白酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1?碳源對菌株生長的影響?由圖7、8、10可知，可溶性淀粉作為碳源時(shí)，河豚毒素假交替單胞菌X8、喬治亞海桿菌X18、康氏菌X48可以獲得最大培養(yǎng)密度。蔗糖、麥芽糖等次之。由圖9可知，蔗糖作為碳源時(shí)，殺魚假交替單胞菌X21可以獲得最大培養(yǎng)密度，可溶性淀粉、葡萄糖次之。

2.3.2?培養(yǎng)基初始pH值對菌株生長的影響?由圖11～12可知，隨著初始pH值升高，河豚毒素假交替單胞菌X8、喬治亞海桿菌X18菌液的密度逐漸增大;當(dāng)初始pH值>6時(shí)，菌液濃度下降。由圖13可知，隨著初始pH值升高，殺魚假交替單胞菌X21菌液的濃度逐漸增大;當(dāng)初始pH值>8時(shí)，濃度下降明顯。由圖14可知，隨著初始pH值升高，康氏菌X48菌液濃度增大;當(dāng)初始pH值>7時(shí)，菌液濃度下降。

2.3.3?培養(yǎng)基鹽度對菌株生長的影響?由圖15可知，隨著鹽度的升高，河豚毒素假交替單胞菌X8菌液濃度逐漸增大，細(xì)菌數(shù)量增多;當(dāng)鹽度>10‰時(shí)，細(xì)菌濃度下降。由圖16可知，隨著鹽度的升高，喬治亞海桿菌X18菌液的濃度逐漸增大;當(dāng)鹽度>15‰時(shí)，細(xì)菌濃度下降。由圖17可知，隨著鹽度的升高，殺魚假交替單胞菌X21菌液的濃度逐漸增大;當(dāng)鹽度>15‰時(shí)，細(xì)菌濃度下降。由圖18可知，隨著鹽度的升高，康氏菌X48菌液的濃度逐漸增大;當(dāng)鹽度>15‰時(shí)，細(xì)菌濃度開始下降。

2.3.4?培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響?由圖19、21、22可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，河豚毒素假交替單胞菌X8、殺魚假交替單胞菌X21、康氏菌X48菌液的濃度逐漸增大;當(dāng)溫度>25℃時(shí)，菌液濃度開始下降。故25℃為發(fā)酵的最適溫度。由圖20可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，喬治亞海桿菌X18菌液的密度逐漸增大，細(xì)菌數(shù)量增多;當(dāng)溫度>30℃時(shí)，菌液渾濁度開始下降，細(xì)菌數(shù)量開始下降。故30℃為發(fā)酵的最適溫度。

2.4?蛋白酶活力的測定

2.4.1?酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線?按照前面蛋白酶活力的測定中的操作方法，得到酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（圖23）。該曲線擬合度較好，精密度較高。

2.4.2?福林法測定蛋白酶活力?依據(jù)1.2.8蛋白酶活性的測定方法，在優(yōu)化后發(fā)酵條件下，經(jīng)計(jì)算，X8、X18、X21、X48菌株產(chǎn)蛋白酶酶活力分別達(dá)到707.06、240.00、441.18、328.22U/mL。

3?結(jié)論

本研究從山東沿海污染海域的紋藤壺中篩選得到4株高產(chǎn)蛋白酶的菌株，編號分別為X8、X18、X21、X48，分別鑒定X8為河豚毒素假交替單胞菌（Pseudoalteromonas tetraodonis）、X18為喬治亞海桿菌（Marinobacterium georgiense）、X21為殺魚假交替單胞菌（Pseudoalteromonas piscicida）、X48為康氏菌（Kangiella japonica）。通過測定菌株的生長曲線，確定菌株X8、X18、X21、X48發(fā)酵量最高的培養(yǎng)時(shí)間分別為18、18、21、18h。在最適培養(yǎng)時(shí)間的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化，確定X8菌株產(chǎn)蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵條件：可溶性淀粉5.0‰、初始pH 7.0、培養(yǎng)基鹽度10‰、培養(yǎng)溫度25℃;X18菌株產(chǎn)蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵條件：可溶性淀粉5.0‰、初始pH 7.0、培養(yǎng)基鹽度15‰、培養(yǎng)溫度30℃;X21菌株產(chǎn)蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵條件：蔗糖5.0‰、初始pH 7.0～8.0、培養(yǎng)基鹽度15‰、培養(yǎng)溫度25℃;X48菌株產(chǎn)蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵條件：可溶性淀粉5.0‰、初始pH 7.0、培養(yǎng)基鹽度15‰、培養(yǎng)溫度25℃。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，X8、X18、X21、X48菌株產(chǎn)蛋白酶酶活力分別達(dá)到了707.06、240.00、441.18、328.22U/mL。

4?討論

藤壺食物來源中含大量蛋白類物質(zhì)，猜想藤壺附生菌中存在產(chǎn)蛋白酶菌株，以幫助其消化、利用食物。本試驗(yàn)以山東沿海污染海域的紋藤壺作為研究對象，對紋藤壺的附生菌進(jìn)行了分離鑒定，篩選及研究了其中4種高產(chǎn)蛋白酶菌株的發(fā)酵條件，在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下，X8、X18、X21、X48菌株產(chǎn)蛋白酶酶活力分別達(dá)到了707.06、240.00、441.18、328.22U/mL。蛋白酶活力均高于趙海霞等[16，20]從土壤中篩選出的1株蛋白酶酶活性為21.19U/mL的粘質(zhì)沙雷氏菌，超出約10倍以上;均高于馮愛娟等[17]從腐乳中篩選出的蛋白酶酶活性為97.1U/mL的消瘦芽孢桿菌[20]，超出約3倍以上;均高于張力元[18]從海洋中篩選出的蛋白酶活力為218.87U/mL的短小芽孢桿菌;X8、X21菌株的酶活高于袁艷超[19]從芝麻粕中篩選出的酶活為363.57U/mL的淀粉芽孢桿菌。因此，本研究篩選出的4株高產(chǎn)蛋白酶菌株的蛋白酶活力均為較高水平。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究這4株高產(chǎn)蛋白酶菌株的產(chǎn)酶特性以及在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，對于探索海洋微生物資源、將有機(jī)廢棄物資源化等具有重要意義。

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Isolation and Identification of Epiphytic Bacteria from Barnacle and Enzymatic Properties of Protease-producing Strains

XU Meng，YANG Zhao-yang，LI Xia-yun，LU Yi-nan，CHEN Yi-fan，XING Xiang

（Marine College of Shandong University，Weihai 264209，China）

Abstract：Objective To study isolate and identify epiphytic bacteria from barnacle and enzymatic properties of protease-producing strains.Method Totally 54 strains were isolated from barnacles in the contaminated coastal waters of Shandong province.Result Totally 4 strains with high protease production were screened by casein test.The strains were identified，the fermentation conditions of protease production were optimized and the enzyme activity was tested.Totally 4 strains of protease-producing strains were screened and identified as X8，X18，X21 and X48，respectively.X8 was identified as Pseudoalteromonas tetraodonis，X18 as Marinobacterium georgiense，X21 as Pseudoalteromonas piscicida and X48 as Kangiella japonica by 16S rDNA sequence analysis，transmission electron microscopy，morphological observation and physiological and biochemical characteristics test.By measuring the growth curve of the strain，it was determined that the highest fermentation time of strain X8 was 18 hours，the highest fermentation time of strain X18 was 18 hours，the highest fermentation time of strain X21 was 21 hours，and the highest fermentation time of strain X48 was 18 hours.On the basis of optimum fermentation time and single factor experiment，the optimum fermentation conditions of protease production by X8 strain were soluble starch 5.0‰，initial pH 7.0，medium salinity 10‰ and culture temperature 25℃.The optimum fermentation conditions of protease production by X18 strain were soluble starch 5.0‰，initial pH 7.0，medium salinity 15‰ and culture temperature 30℃.The optimum fermentation conditions of protease production by X21 strain were sucrose 5.0‰，initial pH 7.0～8.0，medium salinity 15‰ and culture temperature 25℃.The optimum fermentation conditions of protease production by X48 strain were soluble starch 5.0‰，initial pH 7.0，medium salinity 15‰ and culture temperature 25℃.Conclusion Under the optimum fermentation conditions，the protease activity of strains X8，X18，X21 and X48 reached 707.06 U/mL，240.00 U/mL，441.18 U/mL and 328.22 U/mL，respectively.This study provided a preliminary basis for exploring potential protease-producing strains.

Keywords：isolation and identification;fermentation condition optimization;protease

（責(zé)任編輯?唐建敏）