馬紅 方龍寶 馬海麗 趙鳳香 柴薇薇

摘要：研究目的：甘草是一種適生于荒漠鹽漬化地區(qū)的豆科藥用植物，但不同品種甘草對鹽的適應性不同，本研究通過比較烏拉爾甘草、黃甘草在不同濃度NaCl處理下抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)黃酮含量的差異，初步分析了兩種甘草抗氧化系統(tǒng)酶及抗氧物質(zhì)在鹽處理下的變化特征。結(jié)果表明：兩種甘草均可以通過提高抗氧化酶活性和積累抗氧化物質(zhì)黃酮來適應鹽處理，在50 mmol/L NaCl處理下，兩種甘草中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性在地上和地下呈現(xiàn)出差異，烏拉爾甘草黃酮積累高于黃甘草;在200 mmol/ L NaCl處理下，烏拉爾甘草葉中SOD、POD活性、總黃酮含量均顯著高于黃甘草（P<0.05），初步推測烏拉爾甘草在高鹽條件下具有更好的抗氧化能力，并能夠更好的積累藥用活性物質(zhì)黃酮，因此更適于在鹽漬化地區(qū)推廣種植。

關鍵詞 鹽處理;烏拉爾甘草;黃甘草;SOD;POD;黃酮

中圖分類號： S567.23??? 文獻標志碼：A

隨著干旱的頻繁發(fā)生及化肥的使用和灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展，土壤的次生鹽漬化程度日趨嚴重，已經(jīng)成為限制植物栽培的重要因素之一。鹽脅迫會引起植物細胞的離子脅迫和滲透脅迫，進而導致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的過量積累。但是植物通過長期的進化，形成了復雜的抗氧化防御機制，包括酶途徑和非酶途徑，來消除過量的活性氧積累。酶途徑保護機制中主要有超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等，其中SOD可以清除超氧陰離子的超氧化物歧化酶活性增加并產(chǎn)生過氧化氫等物質(zhì)，POD可以催化過氧化氫氧化產(chǎn)生水，來降低膜內(nèi)不飽和脂肪酸的過氧化程度。非酶途徑中直接參與活性氧（ROS）清除的抗氧化物有黃酮、多糖、谷胱甘肽等，這些物質(zhì)既可以直接同ROS反應，將其還原，又可作為酶的底物在ROS的清除中發(fā)揮重要作用。

甘草為豆科多年生藥用草本植物，主要品種有烏拉爾甘草 （ Fisch.）、光果甘草（ L）、脹果甘草（Batal.）及黃甘草 Peng.）等，其烏拉爾甘草、黃甘草廣泛分布于新疆、甘肅、內(nèi)蒙古等干旱、半干旱鹽漬地區(qū)，是一種防風固沙耐鹽堿植物。研究不同品種甘草在鹽處理條件下抗氧化系統(tǒng)的響應，可以為甘草在鹽漬化地區(qū)的栽培提供理論基礎。已經(jīng)有研究表明超過200 mmol/L? NaCl對甘草造成脅迫，其體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，因此本研究選擇了低于200 mmol/L的NaCl對烏拉爾甘草和黃甘草進行鹽處理。由于甘草中蘊藏著大量的抗氧化物質(zhì)，如黃酮等，其具有抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用，但在不同品種、不同產(chǎn)地甘草中的含量差異較大。因此對甘草不產(chǎn)生脅迫的情況下，進行適度的鹽處理，將甘草抗氧化酶、甘草黃酮與鹽脅迫相關聯(lián)，比較不同品種甘草中抗氧化酶活性及抗氧化黃酮的變化特征，可以為鹽堿條件下開發(fā)利用甘草提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料培養(yǎng)

實驗所用材料烏拉爾甘草、黃甘草種子購買于甘肅酒泉，挑選飽滿充實、大小均勻、色澤飽滿的甘草種子，用98%濃硫酸消毒并進行催芽，放置在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待幼苗長出2-3片真葉后移入穴盤中，采用蛭石培養(yǎng)，每周用Hoagland營養(yǎng)液澆灌3次，在室溫中進行培養(yǎng)。

1.2 鹽處理

當出苗5周左右時，選取長勢一致的材料，以Hoagland營養(yǎng)液為對照（CK），選擇對甘草并不造成脅迫傷害的鹽濃度進行鹽處理。Hoagland營養(yǎng)液分別添加50 mmol/L ?NaCl和200 mmol/L NaCl進行處理，每2 d更換處理液，分別于處理第7 d、14 d取樣，進行酶活性指標測定，處理第60 d取樣，進行總黃酮含量測定，每處理設4次重復。

1.3 酶提取液的制備

分別準確稱取約0.1g根和葉，加入1ml提取液進行冰浴勻漿，8000 g 4℃離心10min，取上清液，置冰上待測，實驗步驟按照試劑盒說明書操作，SOD（SOD-2-Y，蘇州科銘）、POD（POD-2-Y，蘇州科銘）。

1.4 超聲波法提取甘草總黃酮

用50 mmoL/L、200 mmoL/L ?NaCl分別處理60 d后，取葉和根清洗干凈，在105℃下烘干，粉碎，過100目的篩，然后精確稱取葉、根各1.0 g，倒入錐形瓶中，料液比1：20，80%乙醇，超聲提取20 min，功率150 W，過濾、共提取2次，合并濾液，最后定容。

取適量提取液于10mL 容量瓶中，加水5mL，振蕩片刻，加5%亞硝酸鈉溶液0. 5mL，搖勻、放置 6min后加10%的硝酸鋁溶液0. 5mL，搖勻放置6min后加5%的氫氧化鈉溶液2. 5mL，放置15 min 后蒸餾水定容至10mL，試劑為空白，于510nm 處測吸光度值A，從標準曲線方程中計算出黃酮含量。

計算公式為：C（%）= （V*X）/（100*A*W）*100%

其中： X—比色液中黃酮含量（ mg/mL） V—提取液體積（ mL）; A—取樣體積（ mL）; W—甘草重量（g）

1.5 黃酮含量的測定方法

（1）紫外分光光度法：用蘆丁代替黃酮做對照標準，采用亞硝酸鈉 -硝酸鋁比色法，在510nm處測定甘草中總黃酮含量。

（2）工作曲線回歸方程：精確稱取在 105 ℃干燥恒重的蘆丁對照品10mg，用95 %的乙醇溶解，搖勻，定容至10mL，配置成為濃度1mg/mL的蘆丁標準品溶液，作為貯備液備用。精密量取上述溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 ml，分別加水3 ml，加5%的亞硝酸鈉溶液0.5 ml，放置6 min，加10%的硝酸鋁0.5 ml，搖勻，放置6min，加入5%的氫氧化鈉溶液2.5 ml，混勻，放置15 min后蒸餾水定容10 ml，用紫外分光光度計法在波長510nm 處測吸光度。

將所得數(shù)據(jù)進行一元線性回歸，得蘆丁濃度（X）-吸光度（A）方程：X =（A+0.0289）/0.1889相關系數(shù) R=0.9937。

1.6 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)采用 Excel 2010軟件，SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行處理，平均值比較采用 LSD 0.05標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD活性的變化

SOD是保護植物細胞免受自由基傷害的第1道防線，它是防御活性氧的關鍵酶。在50 mmol/L NaCl處理下，烏拉爾甘草和黃甘草中SOD活性均隨鹽處理的時間增長呈現(xiàn)不斷升高的趨勢。葉中，兩種甘草SOD活性顯著高于CK（P<0.05），處理14 d時，烏拉爾葉中SOD活性顯著高于黃甘草（P<0.05）（圖1 A）;在根中，兩種甘草SOD活性在處理7d、14d時均顯著高于CK（P<0.05），在處理14 d時，黃甘草SOD活性顯著高于烏拉爾甘草（P<0.05）（圖1 B）。

在200 mmol/L NaCl處理下，兩種甘草中SOD活性總體上都隨著鹽處理時間增加而呈現(xiàn)上升的趨勢。在葉中，兩甘草SOD活性顯著高于CK，處理14d時，烏拉爾SOD活性顯著高于黃甘草（P<0.05）（圖2 A）;在根中，當200 mmol/L NaCl 處理7d 時，兩種甘草SOD活性均顯著高于CK，繼續(xù)處理到14 d時，兩種甘草根中的SOD活性差異不顯著（P<0.05）（圖2 B）。

2.2 POD活性的變化

在50 mmol/L NaCl處理下，兩種甘草葉中POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖3 A），但黃甘草葉中的POD活性顯著高于烏拉爾甘草（P<0.05）（圖3 A）;根中烏拉爾甘草POD活性卻呈現(xiàn)出始終上升的趨勢，而黃甘草中的POD活性卻先增高后下降，處理14d時，烏拉爾POD活性顯著高于黃甘草（P<0.05）（圖3 B）。

在200 mmol/L? NaCl下，烏拉爾甘草葉中POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而在黃甘草中隨著鹽處理時間逐漸上升，在處理7 d、14 d時，烏拉爾葉中POD活性顯著高于黃甘草（P<0.05） （圖 4 A）;在根中，兩種甘草根中POD活性隨著鹽處理的時間呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，烏拉爾甘草POD活性始終高于黃甘草（P<0.05）（圖 4 B）。

2.3 黃酮含量的變化

在葉中，兩種甘草總黃酮含量呈現(xiàn)不同的變化，烏拉爾甘草總黃酮含量隨著鹽濃度增強而呈現(xiàn)上升的趨勢，而黃甘草總黃酮含量隨著鹽濃度增強逐漸下降。在200 mmol/L處理下，烏拉爾葉中總黃酮含量達1.30%，根中高達1.01%，無論是根還是葉中，烏拉爾總黃酮含量均顯著高于黃甘草（P<0.05）。說明一定的鹽處理促進了烏拉爾甘草黃酮含量的積累，但是較高濃度的鹽處理卻抑制了黃甘草黃酮的合成與積累（表1）。

3 討論

本研究表明，兩種甘草中SOD活性隨鹽處理強度增大而增大，而POD活性隨著鹽處理濃度強度先上升再下降，這與萬春陽等的研究一致，表明在一定的鹽處理下，甘草體內(nèi)積累了活性氧，SOD活性增強能有效地清除氧自由基，阻止膜的破壞及過氧化，實現(xiàn)自我調(diào)節(jié)抵御，POD能夠及時清除HO，使HO在體內(nèi)含量維持在較低水平，正是由于以上這些保護酶在鹽處理下增強，維持較高的水平，才使得甘草保持一定的耐鹽性。本研究中低濃度的鹽處理下（50 mmol/L NaCl），兩種甘草均通過保護酶活性升高來提高自身的防御性，有效地清除氧自由基、降低膜脂過氧化水平，從而減輕膜傷害程度;而在較高濃度的鹽處理下（200 mmol/L NaCl），黃甘草體內(nèi)酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性被破環(huán)，因此POD保護酶的活性不能維持較高水平，出現(xiàn)下降趨勢，而烏拉爾甘草卻能夠在200 mmol/L NaCl處理下始終保持高的POD活性，且在根中POD活性顯著高于黃甘草，根中合成POD的能力優(yōu)于黃甘草，說明烏拉爾甘草有較強的清除HO的能力。

研究表明，黃酮類化合物是具有抗氧化性和促氧化性兩種性質(zhì)的天然活性因子。 Yao等用CCl誘導肝損傷模型進行有機體實驗，證明黃酮具有抗氧化性，鄭學欽等也證實了黃酮具有清除活性氧的作用。本實驗中，烏拉爾甘草總黃酮含量隨著NaCl濃度的增加而升高，而黃甘草中出現(xiàn)了相反的特征，說明在適度鹽處理下，烏拉爾甘草相較于黃甘草能更多的積累黃酮。這與萬世杰等的研究相似，其研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的NaCl脅迫可以提高脹果甘草子葉愈傷組織的甘草黃酮含量。因此，我們推測鹽漬環(huán)境對烏拉爾甘草總黃酮含量的積累能起到一定的促進作用，但對黃甘草總黃酮含量積累起到抑制作用。

本研究從抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)總黃酮的變化特征揭示了兩種甘草對鹽的適應性，可以為兩種甘草在鹽漬化地區(qū)的推廣種植及開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。根據(jù)本研究，我們初步認為烏拉爾甘草更適合在鹽漬化地區(qū)推廣種植，且適度的鹽有利于烏拉爾甘草中的有效活性成分黃酮的開發(fā)利用。未來對于甘草在鹽漬條件下的開發(fā)利用，還需進行更加深入的研究。

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