李健 章璟 洪天宇 胡傳義 姜寧 張鶴

摘要：目的：探討纖維連接蛋白（FN）基因多態(tài)性及蛋白表達與草酸鈣腎結石的關系，為治療和預防結石的復發(fā)提供一個理想的靶點。方法：通過經(jīng)皮腎通道，運用腔內(nèi)腎乳頭活檢技術，對草酸鈣腎結石組及健康對照組的腎組織進行FN蛋白的檢測。用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增FN基因rs10202709 位點及rs35343655位點的基因型，探討其基因型與草酸鈣腎結石的關系。結果：FN蛋白在腎結石組的表達明顯高于對照組。FN中C/T型表達與草酸鈣腎結石的發(fā)病率正相關（P < 0.05）。結論：FN蛋白表達的差異與草酸鈣結石的形成具有相關性。FN基因多態(tài)性與草酸鈣腎結石的風險具有相關性，F(xiàn)N的C/T型可作為危險因素的標準。

關鍵詞：纖維連接蛋白;基因型多態(tài)性;草酸鈣;腎結石

【中圖分類號】R-3 ???【文獻標識碼】A ???【文章編號】2107-2306（2019）06-009-02

Correlation between protein expression of fibronectin gene （FN） and calcium oxalate kidney stones

Li Jian， Zhang Jing， Hong Tian Yu， Hu Chuan Yi，Jiang ning，zhang he

Department of urology， Gongli Hospital， Naval Military Medical University， Shanghai 200135

Abstract objective：Tto investigate the relationship between the expression of fibronectin gene （FN） protein and calcium oxalate kidney stones， and to provide an ideal target for the treatment and prevention of stone recurrence. Methods： The FN protein in renal tissue of calcium oxalate nephrolithiasis group and healthy control group was detected by percutaneous renal access and intraluminal renal papillary biopsy. The genotypes of FN gene rs10202709 and rs35343655 were amplified by PCR， and the relationship between the genotypes and calcium oxalate nephrolithiasis was discussed. Results： The expression of FN protein in the kidney stone group was significantly higher than that in the control group. The expression of C / T type in FN was positively correlated with the incidence of calcium oxalate nephrolithiasis （P < 0.05）. Conclusion： The difference of FN protein expression is related to the formation of calcium oxalate stone. The polymorphism of FN gene is related to the risk of calcium oxalate nephrolithiasis. The C / T type of FN can be used as the standard of risk factors.

[key words] fibronectin; Genotype polymorphism; Calcium oxalate; Kidney stones

基因與尿路結石形成的相關性已成為研究的熱點，然而具體的相關機制尚不明確。草酸鈣結石形成的過程中會刺激細胞產(chǎn)生骨橋蛋白、降鈣素受體、纖維連接蛋白（FN）等一系列抑制因子，但是FN與草酸鈣結石的關系并不明確。FN 第2內(nèi)含子基因位點及第 26 內(nèi)含子基因位點存在著等位基因多態(tài)性，其可能對FN的表達水平等產(chǎn)生一定的差異，從而導致抑石的效能發(fā)生改變。本研究通過對患者全血行FN基因型檢測，以及運用腔內(nèi)腎乳頭活檢技術，對Randall鈣斑周圍的腎組織進行FN蛋白的檢測，以期找出與草酸鈣結石相關的分子生物學基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年8月—2019年8月在本院接受經(jīng)皮腎鏡技術（ PCNL） 及開放手術治療的30例草酸鈣腎結石患者作為病例組。另選取其他非腎結石原因（ 腎臟外傷性破裂、腎臟腫瘤、無功能積水腎） 接受腎臟切除的30例患者作為對照組。對所有患者腎臟進行腎乳頭活檢。所有入選者均知情同意，且本研究通過醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2方法

FN蛋白的檢測：新鮮標本用液氮冰凍后，-80℃保存，采用兔抗人 FN 多克隆抗體和 SP 試劑盒，免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白 - 過氧化酶連接法進行檢測，每例均以PBS 液代替一抗作為陰性對照，以正常腎皮質組織作為陽性對照。光鏡下（400倍）隨即觀察3個高倍視野，根據(jù)著色強度的多少進行評分，陰性（-），弱陽性（+），中等陽性（2+），強陽性（3+）。

FN基因型檢測：1、FN基因rs35343655位點的引物序列為上游5'-TACACTTACAGGATAGAAACACAGA-3';下 游 5'- CTCGGGATGATGGCGGAT-3'。FN基因rs10202709位點的引物序列為上游5'-TATGGCCTTTTCCTAAGAGCCTGA-3';下游5'- GGGCAAACCTCAAAGTTCGGA-3'，由上海生工生物公司合成。2、DNA提?。翰杉庵莒o脈血4ml，采用睿玻生物生產(chǎn)的基因組提取試劑盒提取。3、PCR擴增目的基因片段：FN基因rs35343655位點的多態(tài)性反應體系總體積20ml，PCR擴增條件為：94°C預變性2min，98°C變性30s，55°C退火30s，68°C延伸30s，40個循環(huán);68°C再延伸5min。4、測序：PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用ABI 3730 XL測序儀測序分析。?

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間兩兩比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究對象基本情況

草酸鈣結石患者30例，其中男18例，女12例，年齡22～70歲，平均年齡49.6。對照組患者30例，其中男17例，女13例，年齡20～73歲，平均年齡43.8。草酸鈣結石組與對照組的年齡、性別構成比、體質量、身高等差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2草酸鈣腎結石患者和對照組的 FN 基因型基因頻率分布見表1。

FN基因rs35343655位點攜帶有雜合型（）C/T的人群結石發(fā)病率風險明顯高于攜帶野生型（C/C）和突變型（T/T）的人群（P<0.05）。

2.3 兩組患者腎乳頭周圍組織FN蛋白免疫組化結果圖 見圖1。

3 討論

腎結石是一種世界范圍的常見病、多發(fā)病，其發(fā)生與生活習慣、自然環(huán)境、遺傳等因素密切相關，且有明顯的地區(qū)差異和種族差異，因此研究腎結石形成的相關基因或蛋白的表達與尿石的關系已成為研究尿石癥遺傳因素的重要內(nèi)容。目前結石形成主要有三種學說：炎癥反應、Ca2+代謝、成石抑制物異常。

草酸鈣是腎結石的主要無機成分，草酸鈣及含草酸鈣的泌尿系結石約占85%，可導致腎細胞損傷，從而促進草酸鈣晶體與腎表面的黏附，可刺激腎表皮細胞產(chǎn)生纖維連接蛋白（FN）、骨橋蛋白、和酸性黏多糖等大分子蛋白物質，在晶體的成核、生長、聚集過程中起到重要作用。研究顯示草酸鈣結石可能是由于基因變異與其他因素綜合作用而形成的最常見的結石。FN是一種單基因編碼組成的多功能糖蛋白，分子量230 KD，其基因定位于人類染色體2q34 ～36，Patel 證明約有50 個外顯子。研究表明FN可以起到抑制結石形成的作用，主要由成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞合成和分泌，也可由血漿FN轉化而來。當腎小管上皮受損時晶體易在其表面成核和生長，可能是草酸鈣結石最初成核部位。體外研究表明，F(xiàn)N可以結合到草酸鈣晶體表面，通過抑制草酸鈣晶體的內(nèi)吞和草酸鈣晶體對腎小管上皮細胞的黏附作用，從而抑制草酸鈣結石的形成，因此被認為是尿液中草酸鈣結石的主要抑制因子之一。國外學者也曾發(fā)現(xiàn)在不活動的復發(fā)性結石患者中，草酸鈣結晶可以刺激腎小管過度分泌FN，且作用強度與FN的量有關。在草酸鈣晶體的刺激下腎小管上皮細胞的不同基因可能變異，這些基因的變異可能導致蛋白質的表達發(fā)生改變。

本研究通過采用經(jīng)皮腎腔內(nèi)活檢技術，對草酸鈣患者及非結石患者腎乳頭周圍腎組織進行活檢，運用免疫組化（S-P）技術，觀察FN蛋白的表達情況，研究顯示，結石組腎組織中FN的表達較對照組明顯增高，說明草酸鈣晶體有可能刺激FN的表達。雖然FN 具有抑制結石形成的作用，但晶體形成過多時，F(xiàn)N可能失去了抑制草酸鈣晶體的作用。

有研究表明，F(xiàn)N 第2內(nèi)含子基因位點及第 26 內(nèi)含子基因位點存在著等位基因多態(tài)性，這種多態(tài)性可能對FN的表達及腎結石的形成有一定的相關性。本研究發(fā)現(xiàn)FN基因rs35343655位點攜帶有雜合型（C/T）的人群結石發(fā)病率風險明顯高于攜帶野生型（C/C）和突變型（T/T）的人群，而兩組患者rs10202709位點均為發(fā)生突變。我們分析草酸鈣結石的形成與rs35343655位點的雜合突變具有相關性。

綜上所述，對FN基因的深入研究也許可以找到與草酸鈣腎結石相關的分子機制，為篩選治療的靶點基因提供依據(jù)。

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基金項目：浦東新區(qū)公利醫(yī)院青年英才人才培養(yǎng)計劃（GLRq2019-01）;浦東新區(qū)衛(wèi)計委青年科技項目（PW2016B-10）。