李艷春 林忠寧 陸烝 劉明香

摘 要：【目的】探討茶園間作靈芝對(duì)土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，為茶菌間作模式的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。【方法】應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)分析比較了間作靈芝茶園與單作茶園之間土壤細(xì)菌群落變化?！窘Y(jié)果】與單作茶園（CK）相比，間作靈芝茶園土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮和有效磷含量顯著提高，速效鉀含量和pH顯著降低，而全磷和全鉀含量變化不顯著。間作靈芝茶園處理的土壤細(xì)菌群落豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)與單作茶園相比無(wú)顯著性差異。與單作茶園相比，間作靈芝茶園土壤的變形菌門(mén)相對(duì)豐度顯著提高21.18%，而酸桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低15.09%和53.52%，其他細(xì)菌門(mén)類變化不顯著。在屬水平上，間作靈芝處理顯著提高了土壤有益微生物菌群伯克氏菌屬Burkholderia、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas和戴氏菌屬Dyella的相對(duì)豐度。相關(guān)性分析表明，土壤pH、全氮、全磷和速效鉀對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落的影響較大?！窘Y(jié)論】茶園間作靈芝改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)并提高了土壤中有益微生物菌群的相對(duì)豐度，但對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響不明顯。

關(guān)鍵詞：間作;細(xì)菌多樣性;細(xì)菌群落結(jié)構(gòu);茶園;高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：S 154文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）06-690-07

Abstract： 【Objective】 Effects of intercropping Ganoderma lucidum among tea bushes on the microbial diversity and community structure in the soil were investigated. 【Method】The microbial communities in the monoculture （CK） and tea bush-G. lucidum intercropping soils were compared using the high-throughput sequencing technology. 【Result】Compared with CK， the intercropping significantly increased the organic matters， total nitrogen， alkali-hydrolyzed nitrogen， and available phosphorus and significantly reduced the available potassium and pH with no significant effect on the total phosphorus and total potassium in the soil. No significant differences were observed on the richness and diversity indices between them. Furthermore， the relative abundance of Proteobacteria in the intercropping soil significantly increased by 21.18% over CK， while that of Acidobacteria declined by 15.09% and that of Gemmatimonadetes by 53.52%， as none found on those of other bacterial phyla. On genus level， the intercropping significantly increased the relative abundance of beneficial microorganisms， such as， Burkholderia， Sphingomonas and Dyella， in the soil. A correlation analysis showed that the pH， total nitrogen， total phosphorus， and available potassium in soil exerted a greater effect on the dominant than the minor bacterial communities. 【Conclusion】 By intercropping G. lucidum among tea bushes， the structure of microbial community in the soil was altered with an increased abundance of beneficial microbial species without significant changes on diversity.

Key words： intercropping; microbial diversity; microbial community structure; tea orchard; high-throughput sequencing

0 引言

【研究意義】茶樹(shù)是我國(guó)重要的特色經(jīng)濟(jì)作物。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2014年我國(guó)茶園總面積274.1萬(wàn) hm2，占全球種茶面積的50%以上;干毛茶總產(chǎn)量達(dá)209.2萬(wàn)t，占全球茶葉總產(chǎn)量的41.6%;茶葉出口30.1萬(wàn)t，出口金額達(dá)12.7億美元[1]。我國(guó)大部分茶園為山地茶園，在茶葉生產(chǎn)過(guò)程中，生產(chǎn)者往往為追求單位面積產(chǎn)量而不斷進(jìn)行茶園清雜，極易造成山地水土流失，破壞山地原有植被和生物多樣性，導(dǎo)致茶園生態(tài)系統(tǒng)脆弱，病蟲(chóng)害頻發(fā)等生態(tài)問(wèn)題。另外，由于茶樹(shù)自身喜酸富鋁的生物學(xué)特性，茶園土壤正面臨著土壤侵蝕、酸化、微生物退化等各種環(huán)境問(wèn)題[2]。隨著茶樹(shù)種植年限的增加，土壤微生物量減少、群落多樣性降低、一些對(duì)植物生長(zhǎng)有益的細(xì)菌屬急劇減少，而某些病原真菌數(shù)量卻不斷增多，根際土壤環(huán)境質(zhì)量出現(xiàn)整體下降趨勢(shì)[3-4]。茶園間作作為一項(xiàng)生態(tài)栽培措施對(duì)豐富茶園生物多樣性、改善與優(yōu)化生態(tài)系統(tǒng)具有重要作用。茶園間作食用菌可充分利用茶園內(nèi)的空間環(huán)境和光熱水資源，在茶園內(nèi)進(jìn)行復(fù)合種植的食用菌屬于仿生態(tài)野生栽培[5]。土壤微生物作為土壤的重要組成部分，其群落結(jié)構(gòu)多樣性及變化在一定程度上反映了土壤的質(zhì)量和穩(wěn)定性。探討茶菌間作對(duì)土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，可為茶菌間作模式的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究發(fā)現(xiàn)[6]，在幼齡茶園冬季間作大球蓋菇能明顯提升茶園土壤有機(jī)質(zhì)含量，減緩?fù)寥浪峄M(jìn)程，增加全氮和速效氮含量，減小土壤容重，改善土壤結(jié)構(gòu)。蔣玉蘭等研究發(fā)現(xiàn)[7]，茶園間作長(zhǎng)根菇可明顯提高茶葉中茶多糖含量，提高土壤速效氮、磷、鉀含量，對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)和pH影響不明顯。楊洪姣等[8]發(fā)現(xiàn)茶菌間作時(shí)間越長(zhǎng)，茶園產(chǎn)量越高，并且能改善茶園土壤環(huán)境。此外，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)和食用菌間作模式下，土壤微生物中細(xì)菌和放線菌數(shù)量的變化均為單作茶園最高，間作兩年茶園次之，間作一年的最低[9]?，F(xiàn)有的研究大多集中在茶園間作食用菌對(duì)土壤理化性質(zhì)、茶園產(chǎn)量的影響方面，對(duì)茶園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性方面的研究相對(duì)較少。【本研究切入點(diǎn)】前期研究發(fā)現(xiàn)，在成齡茶園間作靈芝，不僅可提高靈芝的品質(zhì)，同時(shí)還可改善土壤肥力，提高茶葉產(chǎn)量與品質(zhì)，促進(jìn)茶園增產(chǎn)增收[10]，但間作靈芝對(duì)茶園土壤微生態(tài)方面的影響還有待進(jìn)一步分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】目前，高通量測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序通量高、實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)化、速度快、準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)，比傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)能更全面反應(yīng)環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)[11-12]，已被廣泛應(yīng)用于土壤微生物生態(tài)學(xué)研究。因此，本研究通過(guò)應(yīng)用Illmina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)間作靈芝茶園和單作茶園的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性等方面進(jìn)行研究，分析比較間作靈芝對(duì)茶園土壤細(xì)菌群落的影響，以期為茶園間作靈芝模式的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于福建省白水巖茶業(yè)有限公司山地茶園（119°4′ E，26°55′ N，海拔982 m）。該地區(qū)為亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫16.8℃，年均降水量 1 842 mm。供試土壤為紅壤土。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)耕層土壤基本理化性質(zhì)為：pH 4.93、有機(jī)質(zhì)含量27.97 g·kg-1、全氮1.13 g·kg-1、堿解氮 132.31 mg·kg-1、有效磷10.17 mg·kg-1、速效鉀145.20 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2016年4月5日，設(shè)置2個(gè)處理：茶園單作（CK）和茶園間作靈芝，分別選取面積不小于50 m2的標(biāo)準(zhǔn)樣地各4塊。設(shè)沒(méi)有間作靈芝的純茶園作為對(duì)照處理。茶園間作靈芝處理：在茶齡10年的福云6號(hào)茶樹(shù)行間間作靈芝，茶行間距為1.2 m，靈芝品種為赤芝Ganoderma lucidum，編號(hào)：韓芝8號(hào);靈芝培養(yǎng)基配方：雜木屑45%，五節(jié)芒粉40%，麩皮10%，紅糖2%，石膏粉2%，過(guò)磷酸鈣1%;在茶樹(shù)的同一側(cè)滴水線內(nèi)，距離茶樹(shù)樹(shù)干25～30 cm開(kāi)條溝將菌棒埋入土中，每行茶樹(shù)間種1行靈芝，采用開(kāi)溝（深20 cm左右、寬20 cm左右）豎栽，菌棒間距5 cm，覆土3～5 cm，按常規(guī)靈芝覆土脫袋栽培方法及茶園正常管理方法進(jìn)行靈芝栽培管理。

1.3 土壤樣品采集與分析

于2016年7月8日，按五點(diǎn)采樣法采集茶園內(nèi)間作靈芝行內(nèi)以及單作茶園中距離茶樹(shù)樹(shù)干25～30 cm處的耕層土壤（5～20 cm），去除根系等雜質(zhì)，過(guò)篩后的土壤一部分存于-20℃冰箱于1周內(nèi)進(jìn)行土壤細(xì)菌多樣性分析;一部分經(jīng)風(fēng)干后測(cè)定土壤理化性質(zhì)。土壤pH采用電位法（水土比1.0∶2.5）;有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法;總氮采用半微量凱氏法、總磷采用Na2CO3熔融法、總鉀采用NaOH水解法、速效氮采用堿解擴(kuò)散法;有效磷采用浸提鉬銻抗比色法;速效鉀的測(cè)定采用火焰光度法[13]。

1.4 土壤DNA提取及高通量測(cè)序

稱取0.5 g土壤樣品，采用CTAB方法提取土壤DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和純度，將提取的DNA稀釋至1 ng·μL-1。以稀釋后的DNA為模板，用帶Barcode的特異引物515F：5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′和806R：5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′，對(duì)細(xì)菌16S V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR采用30 μL反應(yīng)體系，程序?yàn)?8℃預(yù)變性1 min;30個(gè)循環(huán)（98℃變性10 s;50℃退火30 s;72℃延伸30 s）;然后72℃延伸5 min（所用儀器為Bio-rad T100梯度PCR儀）。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒（Qiagen公司）對(duì)PCR產(chǎn)物回收。使用TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit （Illumina公司）建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，經(jīng)過(guò)Qubit和q-PCR定量檢測(cè)文庫(kù)，合格后使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序（委托北京諾禾致源科技股份有限公司測(cè)定）。

1.5 生物信息學(xué)分析和數(shù)據(jù)處理

將測(cè)序后的序列截去Barcode和引物序列后使用FLASH（v1.2.7）對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到原始Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags），經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的過(guò)濾處理、質(zhì)量控制和去除嵌合體序列后，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。利用Uparse軟件將全部Effective Tags以97%的一致性進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋獲得分類學(xué)信息。

利用Qiime軟件（Version 1.7.0）計(jì)算物種數(shù)（Observed-species）、辛普森多樣性指數(shù)（Simpson）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（Shannon）、豐富度指數(shù)（Chao1、ACE）以及覆蓋率指數(shù)（Goods-coverage）。利用R軟件（Version 3.4）進(jìn)行細(xì)菌群落間差異分析（主坐標(biāo)分析和Anosim分析）。采用Excel 2007和MATLAB 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)

間作靈芝對(duì)茶園土壤性質(zhì)的影響見(jiàn)表1。與茶園單作相比，間作靈芝處理顯著增加了土壤有機(jī)質(zhì)（92.27%）、全氮（70.60%）、堿解氮（52.69%）和有效磷（379.68%）含量， 顯著降低了速效鉀含量（36.65%）和pH（0.67個(gè)單位），而對(duì)全磷和全鉀的影響不顯著。

2.2 細(xì)菌群落豐度與多樣性

高通量測(cè)序后共獲得476 012條有效序列，茶園單作和間作靈芝處理的平均有效序列分別為59 005和59 998。經(jīng)過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋后，共獲得19 528個(gè)OTU（基本分類單元），茶園單作和間作靈芝處理的平均OTU數(shù)為2 377和2 505。通過(guò)隨機(jī)抽樣方法，以抽到的序列數(shù)與它們所代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線可直接反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性以及間接反映物種的豐富程度，隨著序列數(shù)的增大，兩個(gè)處理的細(xì)菌稀釋曲線均基本趨于平緩（圖1），說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種（OTUs）。樣本文庫(kù)的覆蓋率指數(shù)在99.2%以上，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果能夠代表土壤中細(xì)菌種群的真實(shí)情況（表2）。間作靈芝處理的土壤細(xì)菌群落豐度指數(shù)（物種數(shù)、Chao1、ACE）和多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異，說(shuō)明間作靈芝并未顯著改變細(xì)菌群落豐度及多樣性。

2.3 細(xì)菌群落組成與群落結(jié)構(gòu)

在門(mén)水平上，單作和間作靈芝茶園土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群（相對(duì)豐度 > 5%）均為變形菌門(mén)Proteobacteria、酸桿菌門(mén)Acidobacteria和放線菌門(mén)Actinobacteria，其總的相對(duì)豐度分別為74.85%和78.95%（圖2）。另外，綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、疣微菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、WD272的相對(duì)豐度比較低（0.65%～4.74%）。與單作相比，間作靈芝茶園土壤的變形菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著提高21.18%（P<0.05），而酸桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低15.09%和53.52%（P< 0.05），其他細(xì)菌門(mén)類變化不顯著。變形菌門(mén)由α-變形菌綱、γ-變形菌綱、β-變形菌綱和δ-變形菌綱組成，與單作相比，間作靈芝茶園土壤的β-變形菌綱的相對(duì)豐度顯著提高121.29%（P<0.05），而α-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱變化不顯著（圖3）。

單作和間作靈芝茶園處理相對(duì)豐度 >0.5%的屬分別占總細(xì)菌屬的22.43%和30.36%（圖4）。單作茶園處理的優(yōu)勢(shì)屬（相對(duì)豐度 > 2%）為不動(dòng)桿菌屬Acidibacter、熱酸菌屬Acidothermus、Candidatus Solibacter;間作靈芝處理的優(yōu)勢(shì)屬為伯克氏菌屬Burkholderia、氣單胞菌屬Aeromonas、不動(dòng)桿菌屬Acidibacter、Candidatus Solibacter。與單作茶園相比，間作靈芝處理顯著增加了伯克氏菌屬Burkholderia、根微桿菌屬Rhizomicrobium、北里孢菌屬Kitasatospora、Chthoniobacter、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、戴氏菌屬Dyella的相對(duì)豐度，顯著降低了熱酸菌屬Acidothermus、堆囊菌屬Sorangium、柯克斯體屬Aquicella的相對(duì)豐度。

排序分析（圖5）和Anosim分析（P=0.032）表明，單作和間作靈芝處理之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，說(shuō)明套種靈芝后改變了土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性

表3顯示，變形菌門(mén)與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān)，與全氮呈顯著正相關(guān)。酸桿菌門(mén)與全氮呈顯著負(fù)相關(guān)，與速效鉀呈顯著正相關(guān)。疣微菌門(mén)與全磷呈顯著負(fù)相關(guān)。其他細(xì)菌群落與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性不顯著。

3 討論與結(jié)論

在茶園間作食用菌，從外界投入了大量的栽培料，菌體生長(zhǎng)的過(guò)程中會(huì)形成新的菌絲殘?bào)w，菌體采收后的菌渣中含有蛋白質(zhì)、菌體蛋白、氨基酸、酶等各種成分，這些都可能轉(zhuǎn)變成土壤的有機(jī)無(wú)機(jī)肥源。茶園間作大球蓋菇明顯增加了土壤全氮、速效氮和速效鉀的含量[6];茶園間作長(zhǎng)根菇也明顯提升了速效氮、有效磷、速效鉀的含量[7]。與此相似，本研究中間作靈芝處理顯著增加了土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮和有效磷含量（表1）。茶樹(shù)作為葉用植物，對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)的需求高，茶園間作靈芝對(duì)土壤養(yǎng)分的增效有利于茶樹(shù)的生長(zhǎng)。此外，茶園間作大球蓋菇和長(zhǎng)根菇不會(huì)降低土壤pH[6-7]，但間作靈芝后會(huì)使土壤pH顯著下降。靈芝是常見(jiàn)的木腐菌，適宜菌絲生長(zhǎng)的環(huán)境pH為5.0左右。在靈芝菌絲生長(zhǎng)、子實(shí)體出芝和出芝后的菌棒腐解過(guò)程中，菌棒pH還會(huì)進(jìn)一步降低0.5～0.8個(gè)單位。因此，在茶園間作靈芝過(guò)程中必須注意土壤pH下降的問(wèn)題，可以通過(guò)補(bǔ)施生石灰和草木灰等來(lái)解決該問(wèn)題。

一些研究者提出富營(yíng)養(yǎng)和寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌的概念，并指出β-變形菌綱是富營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌，多存在于營(yíng)養(yǎng)較高的環(huán)境中[14-15];而酸桿菌門(mén)是寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌，多存在于營(yíng)養(yǎng)貧瘠的土壤環(huán)境中[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與單作茶園相比，間作靈芝處理土壤中的酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低，而變形菌門(mén)，尤其是β-變形菌綱的相對(duì)豐度顯著增加（圖3），這可能與間作靈芝提高了土壤養(yǎng)分含量相關(guān)。據(jù)報(bào)道，伯克氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬以及戴氏菌屬均是農(nóng)田土壤中的有益微生物種群，具有促生、拮抗病原菌的作用 [4，17-19]。另外，伯克氏菌是植物根際主要微生物，與植物生長(zhǎng)關(guān)系密切[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，間作靈芝后伯克氏菌屬成為最優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌屬，并且鞘氨醇單胞菌屬和戴氏菌屬的相對(duì)豐度也顯著提高?？梢?jiàn)，間作靈芝后可有效誘導(dǎo)有益細(xì)菌種群在土壤中定殖，改善茶園土壤環(huán)境，有利于增強(qiáng)茶樹(shù)的抗病抗逆能力。

細(xì)菌是土壤中多樣性最豐富的微生物類群，易受土壤養(yǎng)分、pH 值等外界條件變化的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，酸桿菌門(mén)是嗜酸性細(xì)菌，在酸性土壤中生長(zhǎng)較好[21]，但本研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌門(mén)與pH之間的相關(guān)性不顯著，與全氮呈顯著負(fù)相關(guān)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門(mén)與全氮呈顯著正相關(guān)。其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)氮肥影響了土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成，隨著氮肥濃度的增加，富養(yǎng)性的分類群落變形菌門(mén)豐度增加[22]，與本研究結(jié)果一致?？梢?jiàn)，間作靈芝處理下氮素養(yǎng)分含量變化對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較大。 與單作相比，茶園間作靈芝可顯著增加土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮和有效磷含量。茶園間作靈芝對(duì)土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性的影響不明顯，但改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)并促進(jìn)土壤有益微生物群落生長(zhǎng)。因此，茶園間作靈芝有利于改善土壤微生物生態(tài)環(huán)境。

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（責(zé)任編輯：林海清）