杜文文 崔光芬 王繼華 段青 馬璐琳 賈文杰 王祥寧

摘 要：該研究以古林箐秋海棠（Begonia gulinqingensis）為材料，通過分析葉片形態(tài)特征、上表皮光學(xué)特性、組織結(jié)構(gòu)、葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm），探討了葉片色斑的形成原因。結(jié)果表明：（1）古林箐秋海棠葉斑發(fā)生頻率和數(shù)量無明顯規(guī)律，但發(fā)生部位相對穩(wěn)定，葉斑主要發(fā)生在正對葉柄的兩條主脈之間。（2）斑區(qū)有兩種光反射模式，點(diǎn)狀反射和多角形反射，柵欄組織細(xì)胞呈近等軸的圓形，排列疏松，與上表皮細(xì)胞間存在空隙;非斑區(qū)只有點(diǎn)狀反射模式，柵欄組織細(xì)胞為漏斗型，排列緊密，與上表皮細(xì)胞間不存在空隙。（3）斑區(qū)和非斑區(qū)葉綠體均有密集的堆積基粒和豐富的類囊體膜，斑區(qū)葉綠素a、b及總?cè)~綠素含量僅比非斑區(qū)分別低24.9%、25.2%、25.1%。（4）葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）值斑區(qū)為0.793，非斑區(qū)為0.790。雖然斑區(qū)葉綠素含量比非斑區(qū)略低，但葉綠體結(jié)構(gòu)完整，且葉綠素?zé)晒鈪?shù)與非斑區(qū)無顯著差異。斑區(qū)上表皮與柵欄組織細(xì)胞間的空隙可使光線到達(dá)綠色組織時(shí)發(fā)生二次反射，在葉片表皮細(xì)胞邊緣形成白色多邊形光反射使該區(qū)域相對周圍正常葉片區(qū)域偏白，基于上述結(jié)果可推測古林箐秋海棠的淡綠色塊斑形成與特殊的葉片結(jié)構(gòu)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：古林箐秋海棠， 表皮光學(xué)特性， 葉片結(jié)構(gòu)， 葉綠素含量，葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）

中圖分類號：Q944

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）06-0812-09

Abstract：Using Begonia gulinqingensis as experimental material， the causes of variegated leaves were discussed through analyzing leaf morphological feature， optical properties of adaxial surface， tissue structure， chlorophyll content and chlorophyll fluorescence parameter （Fv/Fm）. The results were as follows：（1） The frequency and number of the patch on a leaf had no obvious regularity. In the same plant， some leaves had patches， some had none， the variegated leaf usually had only one patch， while sometimes also had two or several ones， and the occurrence site of the patch was relatively stable， which often occured between the two main veins opposite the petiole. （2） There were two kinds of light reflection patterns in variegated areas， spotted pattern（SP） and polygonal pattern（PP）. The cells of palisade tissue were nearly equiaxed and arranged loosely， with intercellular space between the abaxial epidermis cells and palisade tissue cells. The non-variegated areas only had the spotted pattern reflection and the palisade tissue cells were funnel-shaped， arranged closely， there was no intercellular space between theabaxial epidermis cells and palisade tissue cells. （3） Chloroplasts from both variegated areas and non-variegated areas showed dense stacking of grana and stroma thylakoid membranes， chlorophyll a， b and total chlorophyll contents in the variegated areas were only 24.9%， 25.2% and 25.1% lower than those in the non-variegated areas respectively. （4） Chlorophyll fluorescence parameter （Fv/Fm） value was 0.793 in variegated areas， and non-variegated areas was 0.790. Although the contents of chlorophyll in the variegated areas were slightly lower than those in the non-variegated areas， the chloroplast structure was intact， and chlorophyll fluorescence parameter （Fv/Fm） did not differ significantly between the variegated areas and the non-variegated areas. The intercellular space between the abaxial epidermis cells and palisade tissue cells could cause secondary reflection when the light reached the green tissue， and white polygon light reflection was formed at the edge of the epidermal cell， which made this area was whiter than the surrounding normal areas. Based on the above results it can be inferred that? the pale green patch on a leaf in B. gulinqingensis is related to a special leaf structure.

Key words：Begonia gulinqingensis， adaxial surface optical properties， leaf structure， chlorophyll content， chlorophyll fluorescence parameter （Fv/Fm）

秋海棠（Begonia L.）是世界上廣為栽培的重要園藝植物，花葉兼美，其豐富的葉色在植物中不多見，15 000多種園藝品種多是斑葉類。我國有豐富的秋海棠野生資源，其中斑葉種類約占41.4%，葉斑的大小、形狀、位置、顏色多樣，一些種類就是根據(jù)斑紋而命名，如花葉秋海棠（B.cathayana）、變色秋海棠（B.versicolor）等（崔衛(wèi)華和管開云，2013）。植物葉斑（variegation）是指植物葉面上出現(xiàn)異色斑點(diǎn)或條紋（李孝輝，2010）。Hara（1957）研究了24個(gè)科的55個(gè)斑葉種，將葉斑產(chǎn)生的原因分為兩類4種：色素型（包括葉綠素型和色素型）和結(jié)構(gòu)型（包括表皮型和空隙型）。目前，研究最多的是色素型葉斑（Aluru et al.， 2001;Jiang et al.， 2004），而對結(jié)構(gòu)型葉斑研究的較少（Fooshee & Henny，1990;Tsukaya et al.， 2004）。葉片是植物進(jìn)行光合作用最重要的部位，葉片中色素含量及組織結(jié)構(gòu)的變化會引起葉色變化，同時(shí)植物光合生理指標(biāo)也會有所變化（王振興等，2016）。

葉綠素型葉斑主要是由于葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生變異（基粒片層降解、基質(zhì)片層減少、葉綠體無膜結(jié)構(gòu)、無類囊體、產(chǎn)生嗜鋨顆粒、葉綠體結(jié)構(gòu)不完整等），葉綠素合成受阻，導(dǎo)致葉片呈白色或黃色，葉斑的組織結(jié)構(gòu)與正常綠色部位無明顯差異，但葉綠素含量明顯低于正常綠色部位，葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）降低（范燕萍等，2006;常青山等，2008;王嘯晨等，2012;衛(wèi)晶晶，2013;楊海蕓，2015;李衛(wèi)星等，2016）。色素型葉斑是由于花青素的存在而使葉片成紅、紫等彩色，斑葉葉片結(jié)構(gòu)與正常綠色葉片無明顯差異，葉綠素含量偏低，花青素含量則較高（袁明等，2010;杜慶鑫等，2017）。表皮細(xì)胞變異使光線發(fā)生干涉、衍射和折射等，空隙結(jié)構(gòu)存在使光線發(fā)生二次反射，兩者都會改變?nèi)肷涔庠谌~表和葉片內(nèi)的光路， 進(jìn)而影響葉片的吸收光譜和反射光譜，最終使葉片呈現(xiàn)藍(lán)暈色、白色、銀白色、淡綠色或銀綠色，從而形成結(jié)構(gòu)型葉斑，屬于物理色（Zhang et al.， 2009;王卅等，2012;Sheue et al.， 2012）。結(jié)構(gòu)型葉斑的葉片斑區(qū)部位結(jié)構(gòu)與正常綠色部位不同，有些植物葉表皮細(xì)胞變厚（Hara，1957），有的表皮存在薄膜干涉濾器、多層薄膜結(jié)構(gòu)或暈色體等微結(jié)構(gòu)（王卅等，2012），廣西落檐、仙客來、意大利魔芋的柵欄組織細(xì)胞與上表皮存在空隙，結(jié)構(gòu)型葉斑葉綠素含量斑區(qū)部位一般比非斑區(qū)部位略低，葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）有的植物斑區(qū)比非斑區(qū)略大，也有些植物斑區(qū)比非斑區(qū)的略小，但無顯著差別（Tsukaya et al.， 2004;Konoplyova et al.， 2008;Rocca et al.， 2011;Sheue et al.， 2012）。近來有研究表明植物的葉色可以有多種機(jī)制共同起作用，如色素含量和空隙結(jié)構(gòu)共同影響獼猴桃的葉色（王振興等，2016），表皮細(xì)胞、細(xì)胞間隙、葉肉細(xì)胞、葉綠體變異和晶體共同作用強(qiáng)化柏拉木幼苗的白色斑點(diǎn)（Chen et al.， 2017）。

豐富多彩的葉斑不僅能改良植物觀賞性狀，還能提高植物觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。古林箐秋海棠（Begonia gulinqingensis）為常綠草本，葉片圓形，腹面青翠濃綠，背面略帶紅色，同株葉片或具形狀不規(guī)則的淡綠色斑塊，或無斑塊，葉斑在幼葉萌出時(shí)已有。該種為云南特有種，目前已處于瀕危狀態(tài)，其獨(dú)特的葉斑樣式，在觀葉秋海棠中并不多見，具有極高的觀賞與開發(fā)價(jià)值（馬宏等，2005）。目前，對古林箐秋海棠葉斑的研究鮮見報(bào)道，本研究以古林箐秋海棠為材料，研究葉斑的組織結(jié)構(gòu)特征、葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm），探討葉斑形成原因，為闡明葉斑的形成機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

古林箐秋海棠（Begonia gulinqingensis）種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所球宿根花卉育種基地，本研究以有斑葉片上的斑區(qū)和非斑區(qū)組織為材料。

1.2 方法

1.2.1 葉斑形態(tài)特征觀察 自2016年4月開始觀察古林箐秋海棠葉斑的發(fā)生頻率、數(shù)量、部位，并采集有斑葉片和無斑葉片進(jìn)行扦插，統(tǒng)計(jì)扦插苗葉片的斑塊發(fā)生情況。

1.2.2 葉片表皮光學(xué)特性觀察 將葉片擦拭干凈后置于濾紙上，用配有汞燈的解剖鏡于暗室內(nèi)觀察（Zhang et al.， 2009），表皮亮度和表皮細(xì)胞反射模式能夠反映葉片光學(xué)特性。

1.2.3 組織結(jié)構(gòu)觀察 半薄切片的制作參照鞏玥等（2014）的方法， 取成熟有斑葉片的斑區(qū)和非斑區(qū)部位，用刀片取1 mm × 1 mm × 1 mm的樣品，重復(fù)3次，采用2.5%戊二醛固定，0.1 mol·L-1PBS緩沖液浸洗3次， 每次15 min;1%鋨酸固定1.5～2 h，再用0.1 mol·L-1PBS緩沖液漂洗3次，每次15 min，30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇脫水各1次，每次15 min;100%乙醇二次脫水，20 min;100%丙酮脫水，20 min;包埋劑∶丙酮（1∶1）室溫下置換1 h，包埋劑∶丙酮（3∶1）室溫下置換3 h;純包埋劑過夜，之后將包埋劑移至0.5 mL離心管或包埋具中，再放樣品進(jìn)去，然后放入聚合箱中，70 ℃ 12 h或者60 ℃ 24 h兩次，切片厚度為1 μm，甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡觀察并照相。

1.2.4 超微結(jié)構(gòu)觀察 方法同半薄切片，切片厚度50～70 nm，醋酸雙氧鈾先染5～10 min，沖洗，檸檬酸鉛后染5 min，再沖洗，烘烤燈烘烤后透射電鏡觀察、拍照。

1.2.5 葉綠素含量測定 葉綠素含量測定參照李合生等（2000）方法稱取葉片（去除葉脈）0.2 g并剪碎，由于一個(gè)葉片中斑區(qū)質(zhì)量不足0.2 g，本文采用混合不同植株不同葉片斑區(qū)取樣，從10棵植株上取12片帶有斑塊的葉片，4片葉為一組，稱取0.2 g斑區(qū)和非斑區(qū)葉片，將取好的葉片置于研缽中，加入少量石英砂和碳酸鈣粉以及95%乙醇溶液2～3 mL，研磨至勻漿;經(jīng)過濾、沖洗后裝入容量瓶用乙醇溶液定容至25 mL;以分光光度計(jì)測量葉綠素溶液在665、649和470 nm處的吸光度，計(jì)算葉綠素濃度。每個(gè)樣本重復(fù)6次，濃度值取平均值。

1.2.6 葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）測定 運(yùn)用葉綠素?zé)晒獬上駜x測定古林箐秋海棠葉片非斑區(qū)和斑區(qū)的熒光參數(shù)。取古林箐秋海棠成熟帶斑葉片，錫箔紙包裹葉片暗處理20 min，測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm），包括暗適應(yīng)狀態(tài)下的最小熒光（Fo）、暗適應(yīng)狀態(tài)的最大熒光（Fm）， Fv=Fm-Fo，重復(fù)9次。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉斑形態(tài)觀察

前期觀察發(fā)現(xiàn)，古林箐秋海棠不同植株間葉斑的發(fā)生頻率和數(shù)量無明顯規(guī)律，但發(fā)生部位相對穩(wěn)定。同一植株上同時(shí)生長有斑葉片和無斑葉片，用有斑和無斑葉片分別進(jìn)行扦插，扦插苗均會長出有斑和無斑的葉片，并且有斑葉片上的葉斑數(shù)量不定， 通常為一個(gè)，也有兩個(gè)或多個(gè)。當(dāng)葉片上只有一個(gè)葉斑時(shí)，葉斑常發(fā)生在正對葉柄的兩條主脈之間（圖1：A），當(dāng)葉片上有兩個(gè)或多個(gè)葉斑時(shí)，總會有一個(gè)葉斑發(fā)生在正對葉柄的主脈間，其余葉斑則分布在其周圍的主脈間，極少有葉斑跨越主脈（圖1：B，C）。葉斑自幼葉萌發(fā)時(shí)就帶有，隨著葉片長大，葉斑面積也逐漸增加，并在葉片完全長大時(shí)葉斑大小和形狀趨于穩(wěn)定，有斑葉片的非斑區(qū)域與無斑葉片的顏色一致，腹面均呈濃綠（圖1：D），背面葉脈為紅色（圖1：E）。

2.2 葉表面光學(xué)特性

通過體視鏡觀察（圖2：A，B）發(fā)現(xiàn)，古林箐秋海棠的有斑葉片有兩種光反射模式：點(diǎn)狀反射（spotted pattern，SP）和多角形反射（polygonal pattern，PP）。斑區(qū)淡綠色部位的上表皮細(xì)胞不僅可以觀察到點(diǎn)狀反射（SP），而且還可觀察到表皮細(xì)胞周圍存在較弱的亮圈，這些亮圈在一定程度上反映了細(xì)胞的形狀。因?yàn)槎鄶?shù)細(xì)胞為不規(guī)則多邊形，所以稱這類反射為多角形反射（PP）（圖2：C，D）;非斑部位的上表皮細(xì)胞可觀察到細(xì)胞中央存在一個(gè)亮點(diǎn)，稱為點(diǎn)狀反射（SP）（圖2：C，D）。

2.3 組織結(jié)構(gòu)與超微結(jié)構(gòu)觀察

通過半薄切片觀察，淡綠色斑區(qū)上表皮細(xì)胞較扁平，偶有小突起，非斑區(qū)細(xì)胞表面有長方形突起，形態(tài)較斑區(qū)略大。斑區(qū)柵欄組織細(xì)胞較小，呈不規(guī)則圓形，排列松散，細(xì)胞內(nèi)含有少量或極少量葉綠體，柵欄組織層與表皮細(xì)胞間存在較大的空隙，形成‘氣室’，海綿組織細(xì)胞大小、形狀與柵欄組織細(xì)胞類似，兩層，排列疏松，均含有葉綠體（圖3：A）;非斑區(qū)柵欄組織細(xì)胞較大，呈圓柱形，排列緊密，內(nèi)含大量葉綠體，與表皮細(xì)胞之間無空隙，海綿組織細(xì)胞兩層，排列緊密，呈不規(guī)則圓形，靠近柵欄組織的一層較小，含有葉綠體，下面一層較大，無葉綠體（圖3：B）。斑區(qū)和非斑區(qū)均由5層細(xì)胞組成，斑區(qū)細(xì)胞大小不均勻，排列不整齊，非斑區(qū)細(xì)胞分層排列，大小均勻且整齊緊密，非斑區(qū)細(xì)胞略大，所以斑區(qū)厚度與非斑區(qū)厚度差別不大。

通過超薄切片觀察到斑區(qū)葉綠體形狀呈橢圓形，含有淀粉粒（圖4：A，B），非斑區(qū)葉綠體細(xì)長呈橢圓形，基粒片層清晰（圖4：C，D）;兩部分的葉綠體超微形態(tài)雖然不一致，但結(jié)構(gòu)均完整，含有豐富的類囊體膜和密集的堆積基粒。

2.4 葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）測定通過葉綠素含量測定發(fā)現(xiàn)斑區(qū)葉綠素a、b及總?cè)~綠素含量均低于非斑區(qū)（表1，圖5：A，B，C），斑區(qū)葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量分別比非斑區(qū)低24.9%、25.2%和25.1%。結(jié)合半薄切片觀察，斑區(qū)柵欄組織細(xì)胞內(nèi)所含的葉綠體明顯少于非斑區(qū)，但其海綿組織細(xì)胞中含有較多的葉綠體，彌補(bǔ)了綠色組織細(xì)胞內(nèi)葉綠體的含量。

離體條件下檢測斑區(qū)和非斑區(qū)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）值，斑區(qū)為0.793，非斑區(qū)為0.790，二者并無顯著差別（圖5：D），F(xiàn)v/Fm代表PSⅡ的最大光化學(xué)效率，反映了當(dāng)所有的光系統(tǒng)域（PSⅡ）反應(yīng)中心均處于開放態(tài)時(shí)的量子產(chǎn)量，可直接作為原初光化學(xué)效率的指標(biāo)。斑區(qū)的葉綠體超微結(jié)構(gòu)完整，雖其總?cè)~綠體含量比非斑區(qū)低25.1%，但斑區(qū)功能性葉綠體能夠充分吸收光能，提高葉片光能利用率，最大光化學(xué)效率與非斑區(qū)相似，因此古林箐秋海棠在擁有色斑的同時(shí)仍能保證正常的光合作用，加上古林箐秋海棠生長在熱帶雨林中的低層樹林下，這種葉色樣式是其為適應(yīng)低光照環(huán)境而長期進(jìn)化的結(jié)果。

3 討論與結(jié)論

在前人研究中已有8種秋海棠被發(fā)現(xiàn)斑葉中由于空隙結(jié)構(gòu)存在而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)型葉斑。大王秋海棠（Begonia rex）、水鴨腳秋海棠（B. formosana）、掌葉秋海棠（B. hemsleyana）、變色秋海棠（B. versicolor）、B. chlorosticta、B. diadema、B. pustulata和Begonia ‘K030960’。7種秋海棠葉斑的空隙結(jié)構(gòu)存在于柵欄組織細(xì)胞與上表皮細(xì)胞間，栽培種Begonia ‘K030960’斑葉上表皮下方的儲水組織細(xì)胞與柵欄組織細(xì)胞間存在空隙結(jié)構(gòu)（Zhang et al.， 2009;Sheue et al.， 2012）。本研究觀測到的古林箐秋海棠斑葉空隙結(jié)構(gòu)存在于上表皮細(xì)胞和柵欄組織細(xì)胞間，且斑區(qū)的上表皮細(xì)胞比非斑區(qū)略小。Zhang et al.（2009）和Sheue et al.（2012）在大王秋海棠、掌葉秋海棠、變色秋海棠、B. chlorosticta、B. pustulata和Begonia‘K030960’中未發(fā)現(xiàn)斑區(qū)和非斑區(qū)的表皮細(xì)胞存在差異，而Sheue et al.（2012）在水鴨腳秋海棠和B. diadema的斑葉掃描中觀察到斑區(qū)上表皮細(xì)胞比非斑區(qū)的略小，說明秋海棠屬植物在斑區(qū)和非斑區(qū)的表皮細(xì)胞大小上并沒有絕對的特征屬性。

古林箐秋海棠斑區(qū)的柵欄組織細(xì)胞呈圓形，含有較少的葉綠體，非斑區(qū)柵欄組織細(xì)胞呈漏斗狀，含有大量的葉綠體，與Zhang et al.（2009）、Sheue et al.（2012）所述的其他8種斑葉具空隙結(jié)構(gòu)的秋海棠類似，此外，這8種秋海棠非斑區(qū)海綿組織細(xì)胞排列疏松，與斑區(qū)海綿組織細(xì)胞大小、形態(tài)類似，而在古林箐秋海棠中發(fā)現(xiàn)非斑區(qū)海綿組織細(xì)胞排列緊密，形態(tài)、大小與斑區(qū)均有明顯差異。超微結(jié)構(gòu)顯示古林箐秋海棠斑區(qū)和非斑區(qū)葉綠體結(jié)構(gòu)形狀雖然不一致，但均含有豐富的類囊體膜和密集的堆積基粒，而且在斑區(qū)還觀察到淀粉粒，這與前人的研究一致（Zhang et al.， 2009;Sheue et al.， 2012;Chen et al.， 2017）。

在葉綠素含量方面，古林箐秋海棠斑區(qū)葉綠素含量比非斑區(qū)略低，但不足以影響葉片的顏色，斑區(qū)葉片仍呈現(xiàn)綠色，僅顏色變淺。王振興等（2016）在狗棗獼猴桃白色葉中也發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象。本研究古林箐秋海棠斑區(qū)葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）與非斑區(qū)相差不大，水鴨腳秋海棠、B. diadema和 B. pustulata 3種秋海棠也被報(bào)道斑區(qū)和非斑區(qū)的Fv/Fm值無顯著差異（Sheue et al.， 2012）。Rocca et al.（2011）通過研究意大利魔芋光系統(tǒng)Ⅱ （PSⅡ） 的活性發(fā)現(xiàn)不同顏色的葉片在最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）上無顯著差異;Chen et al.（2017）在柏拉木中發(fā)現(xiàn)斑區(qū)和非斑區(qū)的Fv/Fm無顯著差異，但有斑葉片非斑區(qū)的Fv/Fm值比無斑葉片大。

綜上所述，古林箐秋海棠葉斑屬于空隙結(jié)構(gòu)型葉斑，由于空隙結(jié)構(gòu)的存在使光線到達(dá)綠色組織時(shí)發(fā)生二次反射，在葉片表面表皮細(xì)胞邊緣形成白色多邊形的光反射而不是普通葉片表皮細(xì)胞中央形成的白色點(diǎn)狀光反射，使該區(qū)域相對周圍的正常葉片偏白，從而形成葉斑（Hara，1957;Zhang et al.， 2009）。這與前期的葉片表皮光學(xué)特征觀察相符，且在大王秋海棠中也有類似發(fā)現(xiàn)（Zhang et al.， 2009）。另外，Sheue et al.（2012）發(fā)現(xiàn)具有空隙結(jié)構(gòu)葉斑的B. chlorosticta葉片邊緣呈綠色，葉背紅色，腹面暗綠色，葉斑呈淡綠色，這被認(rèn)為是由于葉背面紅色與綠色相結(jié)合而使葉腹面呈現(xiàn)深綠色，深綠色在有空隙結(jié)構(gòu)存在的情況下會呈現(xiàn)淺綠色， 而不是白色。古林箐秋海棠幼葉剛萌出時(shí)呈紅色，之后葉色逐漸轉(zhuǎn)綠，但葉背的葉脈一直為紅色，并且其葉斑同樣為空隙型結(jié)構(gòu)葉斑，因此推測其淡綠色葉斑顯色機(jī)理與B. chlorosticta葉斑的顯色機(jī)理相同。

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