韓真真 邵長森 張元元 王紹花 劉莉 林桂濤 盛華剛

摘 要 目的：建立同時測定桂枝加芍藥湯中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為235 nm（0～35 min，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷）、280 nm（35～65 min，甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚），柱溫為25 ℃，進樣量為20 μL。結(jié)果：芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.125～34.000 μg/mL（r=0.999 9）、28.700～459.200 μg/mL（r=0.999 7）、3.675～58.800 μg/mL（r=0.999 7）、1.235～19.760 μg/mL（r=0.999 8）、2.300～36.800 μg/mL（r=0.999 8）、0.955～15.280 μg/mL（r=0.999 7）、36.000～576.000 μg/mL（r=0.999 7）、1.500～24.000 μg/mL（r=0.999 7）；定量限分別為0.135、0.102、0.096、0.033、0.013、0.023、0.663、0.198 μg/mL，檢測限分別為0.041、0.031、0.029、0.010、0.004、0.007、0.201、0.059 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均小于3%（n=6）；加樣回收率分別為97.47%～100.76%（RSD=1.33%，n=6）、98.15%～103.50%（RSD=1.82%，n=6）、95.65%～100.84%（RSD=2.38%，n=6）、96.75%～100.32%（RSD=1.31%，n=6）、95.88%～102.75%（RSD=2.52%，n=6）、95.63%～100.63%（RSD=2.00%，n=6）、96.78%～100.45%（RSD=1.35%，n=6）、95.71%～100.48%（RSD=1.80%，n=6）。結(jié)論：該方法準確、可靠，專屬性好，可用于同時測定桂枝加芍藥湯中8種成分的含量。

關(guān)鍵詞 桂枝加芍藥湯；高效液相色譜法；含量測定；芍藥內(nèi)酯苷；芍藥苷；甘草苷；甘草素；肉桂酸；桂皮醛；甘草酸銨；6-姜酚

Simultaneous Determination of 8 Ingredients in Guizhijiashaoyao Decoction by HPLC

HAN Zhenzhen，SHAO Changsen，ZHANG Yuanyuan，WANG Shaohua，LIU Li， LIN Guitao，SHENG Huagang（College of Pharmacy， Shandong University of TCM， Jinan 250355， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of albiflorin， paeoniflorin， liquiritin， liquiritigenin， cinnamic acid， cinnamaldehyde， ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol in Guizhijiashaoyao decoction. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were 235 nm（0-35 min，albiflorin， paeoniflorin， liquiritin）、280 nm（35-65 min，liquiritigenin， cinnamic acid， cinnamaldehyde， ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol）. The column temperature was 25 ℃， and the sample size was 20 μL. RESULTS： The linear range of albiflorin， paeoniflorin， liquiritin， liquiritigenin， cinnamic acid， cinnamaldehyde， ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol were 2.125-34.000 μg/mL（r=0.999 9）， 28.700-459.200 μg/mL（r=0.999 7）， 3.675-58.800 μg/mL（r=0.999 7）， 1.235-19.760 μg/mL（r=0.999 8）， 2.300-36.800 μg/mL（r=0.999 8）， 0.955-15.280 μg/mL（r=0.999 7）， 36.000-576.000 μg/mL（r=0.999 7） and 1.500-24.000 μg/mL（r=0.999 7）， respectively. The quantitative limits were 0.135， 0.102， 0.096， 0.033， 0.013， 0.023， 0.663， 0.198 μg/mL； the detection limits were 0.041， 0.031， 0.029， 0.010， 0.004， 0.007， 0.201， 0.059 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 3% （n=6）. The recovery rates were 97.47%-100.76%（RSD=1.33%，n=6）， 98.15%-103.50%（RSD=1.82%，n=6）， 95.65%-100.84%（RSD=2.38%，n=6）， 96.75%-100.32%（RSD=1.31%，n=6）， 95.88%-102.75%（RSD=2.52%，n=6）， 95.63%-100.63%（RSD=2.00%，n=6）， 96.78%-100.45%（RSD=1.35%，n=6）， 95.71%-100.48%（RSD=1.80%，n=6）. CONCLUSIONS： The method is accurate， reliable and exclusive， and suitable for simultaneous determination of 8 ingredients in Guizhijiashaoyao decoction.

KEYWORDS Guizhijiashaoyao decoction； HPLC； Content determination； Albiflorin； Paeoniflorin； Liquiritin； Liquiritigenin； Cinnamic acid； Cinnamaldehyde； Ammonium glycyrrhetate； 6-ginger phenol

桂枝加芍藥湯出自《傷寒論》：“本太陽病，醫(yī)反下之，因爾腹?jié)M時痛者，屬太陰也”。桂枝加芍藥湯由桂枝、赤芍、炙甘草、生姜、大棗等5味中藥組成，具有調(diào)和營衛(wèi)、理脾和中、緩急止痛的功效[1]，臨床常用于治療月經(jīng)痛、胃痛、腹痛、胃腸痙攣、慢性痢疾等癥[2-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，桂枝湯中的桂皮醛、肉桂酸、芍藥苷、甘草酸等均具有抗炎、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛的作用[6-7]。桂皮醛是桂枝中主要的揮發(fā)油成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用；肉桂酸是桂枝中主要的有機酸類成分，具有殺菌、止血、抗腫瘤等作用[8]。芍藥苷為赤芍的主要成分，芍藥內(nèi)酯苷為芍藥苷的同分異構(gòu)體，均具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解痙及免疫調(diào)節(jié)的作用[9]。炙甘草中的甘草苷可用于治療咽炎、急、慢性咳嗽，具有抗抑郁、神經(jīng)保護等作用； 甘草素是炙甘草中含量較高的黃酮類成分之一，為甘草苷的苷元，具有保肝的作用；甘草酸是炙甘草的主要成分，可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為甘草次酸，進而發(fā)揮抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)痛等作用[10]，其以甘草酸銨為指標成分進行含量測定。6-姜酚是生姜中主要的揮發(fā)油成分，具有抗炎、止痛、強心、抗血小板聚集、抗氧化、抗腫瘤等作用[11]。目前，關(guān)于桂枝加芍藥湯的研究多為在中醫(yī)辨證論治方面，而對于化學成分的定量分析鮮有報道。為此，本研究建立了同時測定桂枝加芍藥湯中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚含量的高效液相色譜法（HPLC），旨在為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G1311C型四元梯度泵、G1315D型可變波長掃描紫外檢測器、G1316A型柱溫箱、OpenLABC.01.07[27]色譜工作站（美國Agilent公司）；MS105DU型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler -Toledo公司）；KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

芍藥苷對照品（批號：110736-201741，純度：95.7%）、甘草苷對照品（批號：111610-201607，純度：93.1%）、肉桂酸對照品（批號：110786-201604，純度：98.8%）、桂皮醛對照品（批號：110710-201720，純度：98.0%）、甘草酸銨對照品（批號：110731-201619，純度：93.0%）、6-姜酚對照品（批號：111833-201303，純度：98.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；芍藥內(nèi)酯苷對照品（批號：713A022，純度：98.0%）購自北京索萊寶科技有限公司；甘草素對照品（批號：Z20J8X40265，純度：98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

桂枝飲片（批號：17050502）、赤芍飲片（批號：170201）、炙甘草飲片（批號：170507）均購自山東省中醫(yī)院，大棗飲片（批號：E2017100901）購自濟南東方大藥店，生姜購自濟南市某超市；經(jīng)山東中醫(yī)藥大學徐凌川教授鑒定分別為樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥嫩枝、毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根、豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根（經(jīng)蜜烘制后得到）、鼠李科植物棗（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果實、姜科植物姜（Zingiber officinale Rosc.）的新鮮根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：235 nm（0～35 min，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷）、280 nm（35～65 min，甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚）；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 桂枝加芍藥湯標準煎液的制備

稱取桂枝9 g、赤芍18 g、炙甘草6 g、生姜9 g、大棗12枚，加水1 400 mL，武火煎煮，煮沸后調(diào)文火保持微沸煎煮，煎煮至藥液約600 mL，8層紗布濾過，濾液加水定容至600 mL，即得。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液 取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加75%甲醇溶解并定容，搖勻，得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚質(zhì)量濃度分別為340、1 148、98、494、610、382、1 400、800 μg/mL的單一對照品貯備液。分別精密吸取上述各單一對照品貯備液適量，置于5 mL量瓶中，加75%甲醇定容，搖勻，得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚質(zhì)量濃度分別為42.5、574.0、73.5、24.7、46.0、19.1、720.0、30.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 取“2.2”項下標準煎液25 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，密閉，稱定質(zhì)量，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理10 min，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液 按“2.2”項下方法分別制備缺桂枝、赤芍、炙甘草、生姜、大棗的陰性標準煎液，再按“2.3.2”項下方法制備缺桂枝、缺赤芍、缺甘草、缺生姜、缺大棗的陰性樣品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.3”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，理論板數(shù)按芍藥內(nèi)酯苷峰計應不低于7 000，分離度均大于1.5，陰性樣品對測定無干擾。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取“2.3.1”項下混合對照品溶液0.25、0.50、1.0、2.0、4.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加75%甲醇定容，搖勻，得系列線性關(guān)系工作溶液。精密量取上述系列線性關(guān)系工作溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，各待測成分回歸方程與線性范圍見表2。

2.6 定量限與檢測限考察

精密量取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚的定量限分別為0.135、0.102、0.096、0.033、0.013、0.023、0.663、0.198 μg/mL，檢測限分別為0.041、0.031、0.029、0.010、0.004、0.007、0.201、0.059 μg/mL。

2.7 精密度試驗

取“2.3.1”項下混合對照品溶液1 mL，置于5 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚峰面積的RSD分別為0.25%、0.45%、1.43%、0.64%、0.32%、1.34%、2.01%、0.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取“2.3.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚峰面積的RSD分別為0.45%、0.87%、1.22%、0.65%、1.34%、2.65%、1.43%、0.69%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復性試驗

取“2.2”項下標準煎液適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚的平均含量分別為0.24、7.35、0.74、0.10、0.15、0.05、1.97、0.07 mg/g，RSD分別為0.62%、0.31%、1.28%、1.12%、1.56%、1.98%、2.73%、0.34%（n= 6），表明本方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

精密吸取已知含量的標準煎液，共6份，每份2.5 mL，分別加入一定量的單一對照品貯備液，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.11 耐用性試驗

2.11.1 流動相考察 取“2.2”項下標準煎液適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件（流動相中磷酸溶液體積分數(shù)分別為0.15%、0.10%、0.05%）進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，當流動相發(fā)生一定程度波動時，本法能滿足試驗要求，提示其耐用性良好。

2.11.2 流速考察 取“2.2”項下標準煎液適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件（流速分別為0.9、1.0、1.1 mL/min）進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，當流速發(fā)生一定程度波動時，本法能滿足試驗要求，提示其耐用性良好。

2.11.3 柱溫考察 取“2.2”項下標準煎液適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件（柱溫分別為20、25、30 ℃）進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，當柱溫發(fā)生一定程度波動時，本法能滿足試驗要求，提示其耐用性良好。

2.12 樣品含量測定

取“2.2”項下標準煎液25 mL，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表5。

對中藥復方制劑進行質(zhì)量控制時需要同時測定多個成分，而各成分的紫外吸收最大波長不同，因此采用多波長含量測定方法[12]。袁鵬飛等[13]采用HPLC法測定桂枝湯中9種成分的含量，在230 nm波長處檢測芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷，在254 nm波長處檢測桂皮醛和甘草酸，在280 nm波長處檢測沒食子酸、香豆素、桂皮酸及2-甲氧基桂皮醛。采用紫外檢測器進行含量測定時，一般會選擇某種成分的最大吸收波長。在前期試驗中，筆者采用二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)對8個待測成分進行光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚的最大吸收波長分別為230、230、240、275、285、290、255、282 nm；研究各成分的光譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷在235 nm波長處均有較大吸收，甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚在280 nm波長處均有較大吸收；綜合考慮各成分峰的出峰時間，選擇于235 nm（0～35 min）波長處檢測芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷，于280 nm（35～65 min）波長處檢測甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸銨、6-姜酚。

本試驗對甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸等不同流動相進行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-水、甲醇-磷酸為流動相時，20 min附近處有2個峰分不開，以乙腈-水為流動相時，峰形不好，故選擇以乙腈-磷酸為流動相；在此基礎上，對流動相的濃度和比例進行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相行梯度洗脫時分離效果最好，出峰穩(wěn)定且峰形尖銳，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫。

桂皮醛和6-姜酚分別為桂枝和生姜中的主要成分，但二者均為揮發(fā)性成分，在煎煮過程中易揮發(fā)，故標準煎液中的含量相對較低，但考慮到二者對湯劑整體藥效的發(fā)揮具有促進作用[14]，故將二者作為指標成分 。

綜上所述，本研究所建方法準確、可靠，專屬性好，可用于同時測定桂枝加芍藥湯中8種成分的含量。

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（收稿日期：2018-08-20 修回日期：2018-12-09）

（編輯：陳 宏）