戴楓 黃國鑫 徐忠世

摘要：目的 通過測(cè)量大鼠椎體及股骨骨密度、股骨生物應(yīng)力數(shù)據(jù)及顯微鏡下觀察股骨骨小梁微觀結(jié)構(gòu)，對(duì)比研究分析外源性 H2S?供體 GYY4137 及雙膦酸鹽類代表藥物阿侖膦酸鈉對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療效果。方法 通過切除大鼠雙側(cè)卵巢建立經(jīng)典的骨質(zhì)疏松模型，模擬圍絕經(jīng)期婦女雌激素驟減、神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂所致的骨質(zhì)疏松疾病過程，大鼠隨機(jī)分組通過腹腔注射 GYY4137 或阿侖膦酸鈉進(jìn)行干預(yù)，使用改良亞甲藍(lán)法測(cè)定血漿硫化氫濃度，使用雙能 X 射線骨密度儀測(cè)量第

4、5?腰椎椎體及股骨骨密度;通過股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)測(cè)量股骨骨折最大應(yīng)力值。所有數(shù)據(jù)由 SPSS?22.0?軟件處理分析。同時(shí)在顯微鏡下微觀定性對(duì)比觀察各組大鼠股骨 H&E ?染色切片骨小梁分布情況。結(jié)果 ?去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型下，腹腔注射

GYY4137 模擬內(nèi)源性 H2S 可提高了血漿 H2S 濃度，在顯微鏡下觀察到股骨骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的明顯改善，與阿侖膦酸鈉治療組無明顯差異，在各個(gè)時(shí)間段 GYY4137 和阿侖膦酸鈉干預(yù)組在第 4、5 腰椎骨密度及股骨最大應(yīng)力負(fù)荷測(cè)量數(shù)據(jù)上同正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別（p>0.05）。在第 12 周，大鼠第 4 腰椎骨密度和大鼠股骨骨密度在 GYY4137 干預(yù)組較 OVX 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組有增加（p<0.05）。結(jié)論 GYY4137 作為近年熱點(diǎn)研究的一種新型 H2S 緩釋供體，在實(shí)驗(yàn)中和阿侖膦酸鈉的干預(yù)效果類同，對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療有效。

關(guān)鍵詞：雌激素;骨質(zhì)疏松;H2S;骨密度;最大應(yīng)力;去卵巢

【中圖分類號(hào)】R681 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2107-2306（2019）05-005-03

骨質(zhì)疏松伴隨骨量減少和骨脆性增加，極易造成骨折和傷殘等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的身體健康和生活質(zhì)量， 甚至縮短患者壽命 [1]。骨質(zhì)疏松最常發(fā)生于絕經(jīng)后婦女， 被稱為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥 （PMOP） [2]，雌激素和多種內(nèi)源性激素在體內(nèi)調(diào)節(jié)影響著骨代謝，補(bǔ)充外源性激素進(jìn)行替代治療是目前常用的治療手段之一，但同時(shí)增加了患者生殖系統(tǒng)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn) [3]。在研究中，我們選取了去卵巢大鼠這一經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠砟M絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理過程。證實(shí)了外源性腹腔注射 GYY4137 可以提高大鼠血漿的 H2S 濃度水平，提高了大鼠腰椎及股骨骨密度數(shù)據(jù)，抵消反轉(zhuǎn)了因雌激素缺乏所致對(duì)骨代謝的相關(guān)影響，微觀上股骨 HE 染色的鏡下觀察也佐證了干預(yù)治療效果，GYY4137 干預(yù)下

OVX?大鼠股骨骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)和正常對(duì)照組及阿侖膦酸鈉干預(yù)組相差無幾。

1.1?試劑和化學(xué)物質(zhì)

GYY4137 購買于 Santa Cruz Biotechnology （SC-224013）， 使用 0.9% 的生理鹽水稀釋。

阿倫瞵酸鈉（阿拉丁，A115345），同樣使用 0.9% 的生理鹽水稀釋。

水合氯醛（Sangon Biotech， Shanghai， China）

青霉素、戊巴比妥鈉、生理鹽水等均購于正規(guī)國內(nèi)生產(chǎn)廠商。

1.2?動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料和方法

80?只 6?月齡 SPF?級(jí)雌性 SD?大鼠，體重 265±15g，購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1?周后進(jìn)行分組和骨質(zhì)疏松造模，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（sham-GYY）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 （OVX-vehicle）、GYY4137（GYY）干預(yù)組 （OVX-

GYY）?和阿倫瞵酸鈉干預(yù)組 （OVX-ALEN）。每組 20?只;其中實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、GYY4137（GYY）干預(yù)組和阿倫瞵酸鈉干預(yù)組進(jìn)行骨質(zhì)疏松造模，大鼠使用 320mg/kg?劑量水合氯醛麻醉后，腹部開口，完整摘除雙側(cè)卵巢（ovariectomy，

OVX），關(guān)腹。正常對(duì)照組大鼠進(jìn)行假手術(shù)處理：大鼠開腹后分離卵巢組織，關(guān)腹，不做卵巢切除術(shù) ， 手術(shù)過程中動(dòng)物無大出血。術(shù)后待大鼠自然清醒，青霉素（4?萬U/?只） 治療 3 天避免感染。術(shù)后，正常對(duì)照組大鼠腹腔注 100μg/ kg?GYY4137（santa?cruz，sc-224013），實(shí)驗(yàn)對(duì)照組大鼠腹

腔注射 1mg/kg?生理鹽水，阿倫瞵酸鈉干預(yù)組大鼠皮下注射 1mg/kg?阿侖膦酸鈉（?阿拉丁，A115345），GYY4137 干預(yù)組大鼠腹腔注射 100μg/kg?GYY4137（santa?cruz，sc-

224013），用藥次數(shù)均為 2?天 /?次。于給藥 2、4、8、12?周后每組各 5?只大鼠使用戊巴比妥鈉注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，分離血漿。于給藥 2、4、8、12?周后每組各處死 5?只大鼠，完整取出雙側(cè)股骨，剔除軟組織和附件。于給藥 8、

12?周后完整取出各組大鼠腰椎體，同樣剔除軟組織和附件， 僅僅保留椎體。股骨和腰椎椎體用浸透生理鹽水的紗布包裹后，分組標(biāo)記保存于-80℃冰箱中。大鼠由專人飼養(yǎng)，在溫度 23±2℃，相對(duì)濕度 55±10%?以及晝夜交替各 12?小時(shí)

的受控條件下，自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)期為 12 周，實(shí)驗(yàn)過程中沒有大鼠意外死亡。以上所有的實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按照中國科技部的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用指南》進(jìn)行。

1.3?血漿 H2S 濃度檢測(cè)

改良亞甲基藍(lán)法測(cè)定血漿硫化氫，先加過量醋酸鋅溶液使血漿中游離 H2S、HS-、S2-?形成 ZnS?沉淀; 再加入5mol/L NaOH?強(qiáng)堿溶解變性的蛋白;離心去除大量蛋白質(zhì); 再加入 0.2% N，N-?二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽溶液使 ZnS?完全溶解，用三氯乙酸沉淀剩余蛋白質(zhì)，最后用分光光度計(jì)法測(cè)定 H2S?濃度。

1.4?H&E 染 色 （Hematoxylin-eosin?staining）

在 4% 濃度的多聚甲醛固定后，股骨樣品脫鈣，然后再遞增濃度的乙醇中脫水，再二甲苯中清洗并植入組織學(xué)石蠟中，使用厚度為 5μm 切片進(jìn)行 H&E 染色。

1.5?骨密度檢測(cè)

骨密度檢測(cè)使用美國產(chǎn) Hologic 雙能 X 射線 4500W 骨密度儀（DEXA）分次測(cè)定第 4、第 5 腰椎椎體和雙側(cè)股骨骨密度（BMD）。

1.6?生物力學(xué)檢測(cè)

取股骨樣本進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)，方法為三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)， 測(cè)量股骨骨折時(shí)所承受的最大應(yīng)力。儀器為 ElectroForce 3200 Series II Test Instrument，BOSE。

1.7?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，兩組間比較采用兩樣本 t 檢驗(yàn)。P ﹤ 0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ， P ﹤ 0.01 認(rèn)為差異具有顯著性。

2.1?各組血漿 H2S 濃度的變化

和 Sham-GYY?組比較，OVX-vehicle?和 OVX-ALEN?血漿中硫化氫（H2S）含量均有下降或顯著降低，而 OVX-

GYY?組血漿中硫化氫含量變化不明顯。如圖 1。通過腹腔注射 GYY?在第 2?周和第 4?周顯著提高了的 OVX?大鼠血漿 ?H2S ??濃 ?度 ，（13.47±3.64 vs. 5.00±1.33;11.28±1.95?vs.

5.08±2.36;所有 p<0.01，如圖 1），隨著時(shí)間推移，在第

8?周和第 12?周外源性 GYY?對(duì)大鼠血漿 H2S?濃度的提升影響仍顯示有效（11.20±3.53?vs.?5.63±2.32;13.08±2.99?vs.

5.98±2.06;所以 p<0.05，如圖 1）。

組 sham-GYY?比較; # 表示 p<0.05，?與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 OVX-

vehicle 比較;## 表示 p<0.01， 與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 OVX-vehicle 比較）

2.2?股骨組織的切片 H&E 在顯微鏡下觀察

實(shí)驗(yàn)對(duì)照組在顯微鏡下可以觀察到骨小梁結(jié)構(gòu)的明顯崩塌減少稀疏，這確認(rèn) OVX 骨質(zhì)疏松造模的成功，而OVX-ALEN 和 OVX-GYY 組可以觀察到大鼠股骨骨小梁的恢復(fù)，這個(gè)結(jié)果定性顯示了補(bǔ)充外源性 H2S 和阿倫瞵酸鈉均對(duì)骨質(zhì)疏松病情的恢復(fù)和改善有治療效果（如圖 2）。

2.3?GYY4137?減緩去卵巢疏松和腰椎股骨骨密度減低于正常對(duì)照組比較，大鼠第 4、5?腰椎于去卵巢后

（OVX-vehicle）第 8 周及之后第 12 周均顯示骨質(zhì)密度減低

（0.195±0.007 vs. 0.244±0.023;0.193±0.017 vs.?0.239±0.013; 0.182±0.022 vs. 0.223±0.016;0.180±0.023 vs.?0.232±0.026;

所有 p<0.05;如圖 3）;差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)在第

12?周大鼠第 4?椎體樣本結(jié)果顯示 GYY4137?干預(yù)組 （OVX-

GYY）?反轉(zhuǎn)了去卵巢導(dǎo)致的腰椎骨密度降低（0.190±0.040 vs.?0.182±0.022;p<0.05;?如圖 3c）;?對(duì)骨質(zhì)疏松的治療效果甚至優(yōu)于同組阿倫瞵酸鈉干預(yù)組 （OVX-ALEN）。在大鼠雙側(cè)股骨骨密度測(cè)量實(shí)驗(yàn)中顯示，第 12?周實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 （OVX-vehicle）?相比正常對(duì)照組（sham-GYY）股骨密度降低（0.260±0.030?vs.?0.332±0.035;p<0.05;?如圖 4b）， 通過阿倫瞵酸鈉干預(yù)組 （OVX-ALEN）?和 GYY4137?干預(yù)組（OVX-GYY）?反轉(zhuǎn)了實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 （OVX-vehicle）?去卵巢導(dǎo)致的股骨密度減低（0.310±0.023?0.314±0.046?vs.?0.260±0.030;

p<0.05;如圖 4b），數(shù)據(jù)結(jié)果顯示阿倫瞵酸鈉和 GYY4137 對(duì)骨質(zhì)疏松治療效果基本相同。

周測(cè)量圖示。（*?表示 p<0.05，?與正常對(duì)照組 sham-GYY 比較;**?表示 p<0.01，?與正常對(duì)照組 sham-GYY?比較;

# 表示 p<0.05，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 OVX-vehicle 比較;## 表示p<0.01，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 OVX-vehicle 比較）

（*?表示 p<0.05，與正常對(duì)照組 sham-GYY?比較;**?表示

p<0.01，與正常對(duì)照組sham-GYY 比較; # 表示p<0.05，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 OVX-vehicle 比較;## 表示 p<0.01，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 OVX-vehicle 比較）

2.4?股骨骨折最大應(yīng)力測(cè)試

股骨骨折最大應(yīng)力測(cè)試，通過格拉布斯準(zhǔn)則法（Grubbs） 剔除相關(guān)異常值，結(jié)果分析表明：在 12?周時(shí)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（OVX-vehicle）?大鼠股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)所承受的最大骨折應(yīng)力數(shù)值有下降（121.59±26.56?vs.?157.79±14.83;p<0.05;如圖 5b），OVX 骨質(zhì)疏松模型改變了大鼠股骨的最大生物力學(xué)載荷，符合骨質(zhì)疏松的發(fā)生。而通過阿拉丁和 GYY4137 干預(yù)的大鼠，最大負(fù)荷應(yīng)力與正常對(duì)照組無明確統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（p>0.05）; 而阿拉丁和GYY4137 干預(yù)組之間進(jìn)行對(duì)比， 也無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（p>0.05;圖 5ab）。

圖 5 大鼠雙側(cè)股骨骨折最大應(yīng)力數(shù)值：a 第八周大鼠雙側(cè)股骨樣本骨折最大應(yīng)力圖示;b 第 12 周大鼠雙側(cè)股骨樣本骨折最大應(yīng)力圖示。（* 表示 p<0.05，與正常對(duì)照組sham-GYY 比較;** 表示 p<0.01，與正常對(duì)照組 sham-GYY 比較; # 表示p<0.05，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 OVX-vehicle 比較;## 表示 p<0.01，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 OVX-vehicle 比較）

在我們的研究中，通過實(shí)驗(yàn)大鼠去卵巢來重現(xiàn)模擬了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理過程，股骨 HE?染色的鏡下微觀骨小梁觀察、大鼠腰椎及股骨骨密度、大鼠股骨最大骨折應(yīng)

力數(shù)據(jù)均確切表明去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松這一經(jīng)典實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某闪?。通過腹腔注射外源性 H2S?供體 GYY?可以有效提高大鼠血漿的 H2S?濃度水平，改善反轉(zhuǎn)了因雌激素缺乏導(dǎo)致的大鼠腰椎骨密度和股骨最大應(yīng)力降低，多組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示阿倫瞵酸鈉干預(yù)組 （OVX-ALEN）?和 GYY4137?干預(yù)組（OVX-GYY）?對(duì)比正常對(duì)照組大鼠無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別， 在第 12?周大鼠第 4?腰椎骨密度數(shù)據(jù)顯示 GYY?甚至優(yōu)于阿倫瞵酸鈉的干預(yù)治療效果，大鼠股骨的鏡下對(duì)比觀察也證實(shí)了這一點(diǎn)，GYY?的干預(yù)下 OVX?大鼠股骨骨小梁的結(jié)構(gòu)和數(shù)目和正常對(duì)照組及阿侖膦酸鈉干預(yù)組無顯著性差別。

骨代謝在分子層面的調(diào)節(jié)同時(shí)存在多種信號(hào)通路相互影響，其對(duì)骨形成和骨吸收起著重要的作用 [4]。其中骨形成發(fā)生蛋白（BMP）/Smads?通路及 Wnt/β-?連環(huán)蛋白

（catenin）通路主要影響骨形成，而骨保護(hù)素（OPG）/?核因子 κ?B受體活化因子配體（RANKL）/?核因子 κ?B受體活化因子（RANK）通路則主要影響骨吸收。有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的H2S 可以調(diào)節(jié)成骨分化，H2S 減少缺乏可使鈣離子通道的巰基化減少，影響細(xì)胞壁 Ca2

+ 通道的內(nèi)流，進(jìn)而下調(diào) PKC/ERK?介導(dǎo)的 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)控的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。H2S?還可通過影響 BMP/Smads?通路的重要轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合蛋白（Cbfα1/?Runx2）?和 Osterix?相互作用， 促進(jìn)骨細(xì)胞的增值和分化，以及進(jìn)一步啟動(dòng)成骨細(xì)胞特異性因子（如堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原和骨鈣蛋白）的表達(dá)，從而促進(jìn)骨的形成

[6]。BMP/Smads?和 Wnt/β-catenin?信號(hào)通路存在相互調(diào)節(jié)作用 [7]，H2S?同樣也在實(shí)驗(yàn)中觀察到通過 MAPKs?途徑中的

EPK1/2 和 p38 依賴的機(jī)制對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖，減輕炎癥反應(yīng) [8]。這些報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致并相互驗(yàn)證，說明了 H2S 對(duì)骨代謝的有益作用， 具有潛在改善骨質(zhì)結(jié)果的效果。

傳統(tǒng)上硫化氫被認(rèn)為是一種劇毒臭雞蛋氣味的有害物質(zhì)，高濃度下的毒性作用主要由于其抑制線粒體中的細(xì)胞色素 C 氧化酶，對(duì)線粒體的抑制作用甚至強(qiáng)于氰化物，有報(bào)道 H2S 在人體中毒時(shí)血液硫離子濃度為 3-995μM[9]。生理濃度和最低中毒濃度較為接近，高劑量的 H2S 甚至可誘

導(dǎo)實(shí)驗(yàn)鼠脂多糖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及感染性休克患者血漿H2S 濃度同步增高 [10]。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對(duì)象，而實(shí)際上外源性 H2S 對(duì)人體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可能存在差異， 不同濃度的硫化氫、不同的給藥方式、給藥速度對(duì)骨質(zhì)疏松的影響及其長期使用對(duì)心肝腎等重要臟器功能的影響有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察確認(rèn)，總之，本研究創(chuàng)新性地對(duì)比觀察了 GYY4137 和雙膦酸鹽類藥物阿侖膦酸鈉對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥的實(shí)際治療效果。結(jié)論表明外源性給予 GYY4137 來提高血漿 H2S 濃度有益大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療，這或許是另一個(gè)人類骨質(zhì)疏松癥的治療的潛在靶點(diǎn)，對(duì)今后骨質(zhì)疏松癥的新藥開發(fā)研究具有有益的提示作用。

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oxidative stress and its acceleration by loss of sex steroids. J Biol Chem. 2007;282（37）：27285–97