楊署光　趙悅　陳月異　李言　張世鑫　田維敏

摘 要：割膠促進(jìn)橡膠樹合成天然橡膠與激活乳管細(xì)胞的茉莉酸信號(hào)途徑密切相關(guān)，但茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵環(huán)節(jié)的基因表達(dá)水平與干膠產(chǎn)量的相關(guān)性尚不清楚。為了找到與產(chǎn)量相關(guān)的分子標(biāo)記，該研究采用qPCR技術(shù)，分析了割膠條件下茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵環(huán)節(jié)的9個(gè)相關(guān)基因在5個(gè)橡膠樹魏克漢種質(zhì)和5個(gè)1981’IRRDB種質(zhì)乳管細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明：大多魏克漢種質(zhì)的株次干膠產(chǎn)量顯著高于1981’IRRDB種質(zhì)。在9個(gè)基因中，除了HbMYC4和HbMYC5，其余7個(gè)基因在大多橡膠樹魏克漢種質(zhì)中的表達(dá)量均顯著高于1981’IRRDB種質(zhì)，尤其是HbMYC3基因表達(dá)差異性好，與干膠產(chǎn)量相關(guān)性高，有望作為橡膠樹產(chǎn)量育種的一個(gè)分子標(biāo)記。這對(duì)育種周期長(zhǎng)的橡膠樹產(chǎn)量育種具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞： 巴西橡膠樹， 割膠， 橡膠生物合成， 茉莉酸信號(hào)途徑， HbCOI1， HbJAZs， HbMYCs， 基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q943.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）05-0641-09

Correlation between expression level of genes relatedto jasmonate signalling and rubber yield

YANG Shuguang1， ZHAO Yue2， CHEN Yueyi1， LI Yan1， ZHANG Shixin1， TIAN Weimin1*

（ 1. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Key Laboratory of Rubber Biology and Genetic Resources of RubberTree， Minstry of Agriculture and Rural Affoirs， P. R. China/State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops，Danzhou 571737， Hainan， China; 2.College of Agronomy and Biotechnology， China Agricultural University， Beijing 10093， China ）

Abstract：Tapping-enhanced rubber biosynthesis is closely related to the activation of jasmonate signaling in laticifer cells of rubber tree. The relationship between the expression level of the genes involved in jasmonate signaling and dry rubber yield remains not elucidated. In the present study， the expression of nine genes related to jasmonate signaling was analyzed by qPCR in the laticifer cells of five Wichham germplasms and 5 1981’IRRDB germplasms upon tapping with S/2 d/3 tapping system. The rubber yield per tapping of most Wichham germplasms was significantly higher than that of 1981’IRRDB germplasms. Except for HbMYC4and HbMYC5， the expression level of the other seven genes in most of Wichham germplasms was significantly higher than that of 1981’IRRDB germplasms. It was noted that the expression of HbMYC3was highly different and closely related to the rubber yield， which may be used as a candidate marker for rubber yield-breeding of rubber tree.

Key words： Hevea brasiliensis， tapping， rubber biosynthesis， jasmonate signaling， HbCOI1， HbJAZs， HbMYCs， gene expression

茉莉酸是植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的關(guān)鍵信號(hào)分子（Qi et al.， 2011），其信號(hào)傳導(dǎo)的三個(gè)核心環(huán)節(jié)是COI1、JAZ和MYC（Chini et al.， 2009）。在缺乏JA-Ile（活性形式JA）（Fonseca et al.，2009）時(shí)，JAZ蛋白與MYC2互作，抑制MYC2對(duì)JA響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄激活。例如，在擬南芥中，AtJAZ1和AtJAZ3蛋白通過抑制AtMYC2、AtMYC3和AtMYC4轉(zhuǎn)錄因子，影響硫代葡萄糖苷（glucosinolate）的合成（Schweizer et al.，2013）。AtJAZ1和AtJAZ3蛋白與WD-Repeat/bHLH/MYB復(fù)合體相互作用，抑制花青素的合成（Qi et al.，2011）。但是，在JA-Ile存在的條件下，JAZ與COI1結(jié)合，進(jìn)而通過26S蛋白酶體被降解，使MYC2轉(zhuǎn)錄激活JA響應(yīng)基因（Donnell et al.，1996;Chini et al.，2007;Qi et al.，2011）。發(fā)生在橡膠樹乳管細(xì)胞中的橡膠生物合成是一種典型的植物類異戊二烯代謝。最近研究表明，割膠樹的乳管細(xì)胞茉莉酸含量顯著高于未開割樹，割膠促進(jìn)天然橡膠生物合成與激活乳管細(xì)胞中的茉莉酸信號(hào)途徑密切相關(guān)（Deng et al.，2018）。但是，茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵環(huán)節(jié)的相關(guān)基因表達(dá)與橡膠產(chǎn)量的相關(guān)性尚不清楚。本研究通過分析茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵環(huán)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)與橡膠產(chǎn)量的相關(guān)性，旨在找到與產(chǎn)量相關(guān)的分子標(biāo)記，對(duì)于育種周期長(zhǎng)的橡膠樹產(chǎn)量育種具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料為割齡10 a的巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）的5份魏克漢種質(zhì)和5份1981’IRRDB種質(zhì)。其中，5份魏克漢種質(zhì)是經(jīng)過人工選育的橡膠樹品種PR107、RRIM600、熱墾628、熱墾525和熱墾523;5份1981’IRRDB種質(zhì)是未經(jīng)人工選育的，種質(zhì)編號(hào)為RO/CM/10 44/160、MT/IT/13 29/8、RO/C/8 24/104、RO/I/103 107、RO/CM/10 44/454。均種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)場(chǎng)。DNaseⅠ購自天根公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit購自Ferments公司;qPCR試劑SYBR Ppermix Ex TaqTMⅡ（2×）（Tli RNaseH Plus）購自大連寶生物公司（TaKaRa Japan）;其他生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭Ｒ锖铣捎蒊nvitrogen公司完成。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 每個(gè)種質(zhì)選3株，在生產(chǎn)中正常割膠（S/2D d3：二分之一樹圍，陽刀，每三天割一刀）的第10刀，收集前10 min流出的膠乳，每個(gè)種質(zhì)均取3株的等體積混合樣，用于提取膠乳總RNA。

1.2.2 干膠產(chǎn)量測(cè)定方法 該研究中的干膠產(chǎn)量測(cè)定參照曾霞等（2006）的方法進(jìn)行。

1.2.3 總RNA的提取與cDNA的合成 膠乳總RNA提取參照曾日中等（2003）的方法。cDNA第一鏈的合成根據(jù)試劑盒的操作步驟進(jìn)行：取1 μg膠乳總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，稀釋10倍后作為qPCR分析的模板。

1.2.4 基因表達(dá)分析

1.2.4.1 qPCR反應(yīng) qPCR反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR Ppermix Ex TaqTMⅡ（2×）10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL（引物濃度為10 μmol·L<SUP>-1</SUP>，每條引物終濃度均為0.2 μmol·L<SUP>-1</SUP>）、cDNA模板1 μL、ddH2O 8.2 μL。qPCR反應(yīng)在LightCyclerCapillaries（20 μl，Roche）毛細(xì)管中完成，在Roche Diagnostics公司的LightCycler Real Time PCR擴(kuò)增儀中運(yùn)行，操作按儀器使用說明書進(jìn)行。qPCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行溶解曲線分析（60～95 ℃，0.2 ℃·S-1），運(yùn)行結(jié)束后冷卻至40 ℃。每個(gè)樣品做2次技術(shù)性重復(fù)，Cq標(biāo)準(zhǔn)差控制在0.2以內(nèi)。利用LightCycler Software 4.05軟件采集qPCR反應(yīng)的Cq值。

1.2.4.2 qPCR引物篩選 根據(jù)GenBank登錄的基因的cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)qPCR引物。以10倍梯度稀釋的cDNA為摸板制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得目的基因qPCR引物的擴(kuò)增效率，選擇擴(kuò)增效率在85%以上的引物對(duì)開展實(shí)驗(yàn);通過溶解曲線峰的數(shù)目判斷引物的特異性，選擇具有單一的溶解曲線峰的引物對(duì)開展實(shí)驗(yàn);獲得的qPCR產(chǎn)物通過測(cè)序印證。本研究所用引物見表1。

1.2.4.3 基因表達(dá)分析 根據(jù)“Q=2△Cq=2min Cq-Sample Cq”計(jì)算基因的表達(dá)值（Q），以Hb18S作為內(nèi)參基因，根據(jù)“E=Q目的基因/Q內(nèi)參基因”分析目的基因的相對(duì)表達(dá)值（E）。樣本間相對(duì)基因表達(dá)倍數(shù)（Bénédicte et al.，2002;Silvia et al.，2012;Yuki et al.，2015）可直觀的反映出彼此間表達(dá)差異的大小，根據(jù)“F=EA÷EB”分析樣本A對(duì)樣本B的基因相對(duì)表達(dá)倍數(shù)（folds，F(xiàn)）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003作圖，用SPSS軟件的Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析：標(biāo)有不同大寫字母表示組間差異極顯著（P<0.01），標(biāo)有不同小寫字母表示組間差異顯著（P<0.05），而標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不顯著（P>0.05）。用Excel TTEST（Array 1，Array 2，Tails 1，Type 1）進(jìn)行成對(duì)比較分析：P<0.01表示組間差異極顯著，P<0.05表示組間差異顯著。用SPSS軟件分析基因表達(dá)和干膠產(chǎn)量的Pearson相關(guān)性，P<0.01表示極顯著相關(guān)，P<0.05表示顯著相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹種質(zhì)間株次干膠產(chǎn)量比較

橡膠樹不同種質(zhì)間的株次干膠產(chǎn)量存在明顯差異（圖1）。熱墾523最高，RO/C/8 24/104最低。總體上，大多魏克漢種質(zhì)的株次干膠產(chǎn)量顯著高于1981’IRRDB種質(zhì);RO/I/103/107在1981’IRRDB種質(zhì)中最高，但僅達(dá)到在魏克漢種質(zhì)中最低的PR107的水平，且顯著低于其他魏克漢種質(zhì);其余4份1981’IRRDB種質(zhì)的株次干膠產(chǎn)量均極顯著低于魏克漢種質(zhì)，且四者差異不顯著。

魏克漢種質(zhì)與1981’IRRDB種質(zhì)間株次干膠產(chǎn)量的倍數(shù)變化（表2）表明，魏克漢種質(zhì)的株次干膠產(chǎn)量是1981’IRRDB種質(zhì)的0.81～17.39倍，平均是6.81倍，不同種質(zhì)間的表達(dá)倍數(shù)有明顯差異，變異系數(shù)為63.66%。

2.2 基因表達(dá)分析

2.2.1 qPCR引物篩選 以10倍梯度稀釋的cDNA為摸板制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得目的基因qPCR引物的擴(kuò)增效率在87%～100%之間（圖2：A）;溶解曲線分析表明，各個(gè)基因的引物均獲得單一的溶解曲線峰，表明獲得特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，無模板對(duì)照（NTC）無擴(kuò)增產(chǎn)物表明反應(yīng)體系無污染（圖2：B）。

2.2.2 橡膠樹種質(zhì)間茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵環(huán)節(jié)基因的表達(dá)分析

qPCR分析表明，HbCOI1（圖3：A）和HbMYC2（3：F）僅在1個(gè)（20%）1981’IRRDB種質(zhì)中達(dá)到魏克漢種質(zhì)的表達(dá)水平;HbJAZ2（圖3：C）和HbJAZ3（圖3：D）僅在1（20%）個(gè)魏克漢種質(zhì)中低至1981’IRRDB種質(zhì)的表達(dá)水平;HbJAZ1（圖3：B）有2個(gè)（40%）魏克漢種質(zhì)低至1981’IRRDB種質(zhì)的表達(dá)水平;HbMYC4（圖3：H）和HbMYC5（圖3：I）在魏克漢種質(zhì)和1981’IRRDB種質(zhì)中表達(dá)水平相當(dāng)?shù)恼?0%;值得注意的是，HbMYC1（圖3：E）和HbMYC3（圖3：G）在所有魏克漢種質(zhì)中的表達(dá)量均顯著高于1981’IRRDB種質(zhì)。統(tǒng)計(jì)分析表明，HbMYC1和HbMYC3在魏克漢種質(zhì)組的表達(dá)量極顯著高于1981’IRRDB種質(zhì)組，HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3和HbMYC2的表達(dá)量顯著高于1981’IRRDB種質(zhì)組，但HbMYC4和HbMYC5在兩組間的表達(dá)差異不顯著（圖3：J）。

魏克漢種質(zhì)分別對(duì)1981’IRRDB種質(zhì)的基因表達(dá)倍數(shù)的結(jié)果表明（表2），優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因是HbJAZ2、HbJAZ3、HbMYC1和HbMYC3，表達(dá)倍數(shù)分別為5.30、8.96、5.09和27.79倍。但是，同一基因在不同種質(zhì)間的表達(dá)倍數(shù)有明顯差異，變異系數(shù)分別為47.66%（HbCOI1）、63.01%（HbJAZ1）、72.60%（HbJAZ2）、76.41%（HbJAZ3）、32.83%（HbMYC1）、48.45%（HbMYC2）、45.77%（HbMYC3）、81.17%（HbMYC4）、58.16%（HbMYC5）。值得注意的是，除了Re ken 628 對(duì) RO/I/103 107的表達(dá)倍數(shù)為8.74倍（0.04%），HbMYC3在5個(gè)魏克漢種質(zhì)對(duì)1981’IRRDB種質(zhì)的表達(dá)倍數(shù)均在10倍以上（96%）。

統(tǒng)計(jì)分析表明，HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3、HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3這7個(gè)基因在魏克漢種質(zhì)中的表達(dá)平均值均顯著高于1981’IRRDB種質(zhì)，其中80%達(dá)到極顯著水平（圖4）。Pearson相關(guān)性分析（表3）表明，HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ3、HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3基因表達(dá)與干膠產(chǎn)量的相關(guān)性均達(dá)到0.05的顯著水平;其中，HbCOI1、HbJAZ1、HbMYC2、HbMYC3達(dá)到0.01的顯著水平， 值得注意的是 HbMYC2基因表達(dá)與干膠產(chǎn)量的相關(guān)性最高。

3 討論與結(jié)論

割膠促進(jìn)橡膠樹合成天然橡膠，2次割膠之間的橡膠再生涉及到橡膠合成酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控（Deng et al.， 2018; 趙悅， 2011）。割膠促進(jìn)天然橡膠生物合成與激活乳管細(xì)胞中的茉莉酸信號(hào)途徑密切相關(guān)（Deng et al.，2018）。茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)的核心環(huán)節(jié)是COI1、JAZ和MYC（Chini et al.，2009）;HbMYC1和HbMYC3的基因表達(dá)水平與橡膠樹種質(zhì)的干膠產(chǎn)量正相關(guān)（盧世香，2010;何鑫，2013）。因此，可通過研究橡膠樹“HbCOI1-HbJAZs-HbMYCs”在不同干膠產(chǎn)量種質(zhì)中的表達(dá)差異來篩選產(chǎn)量相關(guān)的分子標(biāo)記。

變異幅度大于2倍的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因（Bénédicte et al.，2002），高產(chǎn)組種質(zhì)膠乳中HbCOI1、HbJAZ1、HbJAZ2、HbJAZ3、HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3基因的表達(dá)水平是低產(chǎn)組種質(zhì)的2倍以上，表明這7個(gè)基因的表達(dá)水平與干膠產(chǎn)量正相關(guān)。其中HbMYC3基因的表達(dá)差異最大，與橡膠樹種質(zhì)的干膠產(chǎn)量相關(guān)性最高，有望作為橡膠樹產(chǎn)量育種的一個(gè)的分子標(biāo)記。下一步將擴(kuò)大研究群體來印證該推測(cè)。

5個(gè)HbMYC家族成員中，HbMYC1、HbMYC2、HbMYC3在膠乳中特異表達(dá)，而HbMYC4和HbMYC5主要在花中表達(dá)（趙悅，2011）。HbMYC4和HbMYC5的基因表達(dá)水平與橡膠樹種質(zhì)的干膠產(chǎn)量不相關(guān)，推測(cè)參與橡膠合成調(diào)控的HbMYCs成員主要是HbMYC1、HbMYC2和HbMYC3。個(gè)別的，RO/C/8 24/104中HbMYC5的基因表達(dá)水平均極顯著高于其他種質(zhì)，是其他種質(zhì)的4.34～9.67倍，平均是6.96倍，變異系數(shù)僅為29.15%;HbMYC5在橡膠樹中的功能尚不完全清楚，RO/C/8 24/104有望成為研究HbMYC5功能的優(yōu)良材料。

“HbCOI1-HbJAZs-HbMYCs”彼此間以及家族成員間的相互作用（趙悅，2011;劉偉，2011;何鑫， 2013;包杰，2014;肖華，2015;王靖等，2016;姚笛，2016）表明他們?cè)谡{(diào)控橡膠生物合成過程中具有協(xié)同作用。盡管個(gè)別基因在個(gè)別低產(chǎn)種質(zhì)中已達(dá)到高產(chǎn)種質(zhì)的表達(dá)水平，但高產(chǎn)種質(zhì)中與干膠產(chǎn)量相關(guān)的7個(gè)基因的整體平均表達(dá)水平均顯著并且80%極顯著高于低產(chǎn)種質(zhì)，進(jìn)一步證實(shí)了他們之間的協(xié)同作用。

韌皮部中次生乳管的分化能力（盧世香， 2010; Chen et al.， 2016）、兩次割膠之間橡膠的再生能力（Deng et al.， 2018）和排膠能力（王冬冬等， 2016; 蔡甫格， 2011; 李言等， 2015）是影響橡膠產(chǎn)量的3個(gè)主要因素。該研究在橡膠再生能力調(diào)控層面獲得了一些有價(jià)值的結(jié)果。非刺激割膠條件下PR107的排膠時(shí)間短以及乙烯利刺激能顯著延長(zhǎng)其排膠時(shí)間（王冬冬等， 2016; 蔡甫格， 2011）和增加排膠量（李言等， 2015），說明其具有一定的乳管分化能力，并且排膠能力可能是限制PR107橡膠產(chǎn)量的主要原因之一;PR107中與干膠產(chǎn)量相關(guān)的7個(gè)基因均具有較高的表達(dá)水平說明其橡膠再生能力強(qiáng)，而其干膠產(chǎn)量（非刺激）相對(duì)偏低進(jìn)一步證實(shí)該推測(cè)。RO/I/103/107的干膠產(chǎn)量在低產(chǎn)種質(zhì)中最高，已達(dá)到PR107的水平;而與干膠產(chǎn)量相關(guān)的7個(gè)基因中有6個(gè)的表達(dá)水平均比較低，僅HbMYC2的表達(dá)水平與PR107相當(dāng);推測(cè)其橡膠再生能力弱，但具有一定的乳管分化能力和/或排膠能力，同時(shí)也說明單個(gè)基因?qū)ο鹉z產(chǎn)量的貢獻(xiàn)不大，也證實(shí)了這些基因在調(diào)控橡膠再生中的協(xié)同（增效）作用。深入研究這3個(gè)因素對(duì)不同橡膠樹種質(zhì)干膠產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率，是一個(gè)有意義的課題。

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