巴桑珠扎　李斌　劉柳　姜南

摘要：選取10頭西藏黃牛，對黃牛瘤胃微生物進行研究，分析瘤胃液物質(zhì)特征值，對黃牛瘤胃中可溶性糖含量及N源進行測定，選取培養(yǎng)基對真菌、細菌進行分離、改良、培養(yǎng)，進而得出瘤胃內(nèi)可溶性糖及不同N均處于動態(tài)變化的過程，其中微生物含量和黃牛瘤胃中的養(yǎng)分以及食物在瘤胃內(nèi)停留的時間有關(guān)，此外，還對黃牛瘤胃內(nèi)纖毛蟲的數(shù)量及變化趨勢進行鑒定。

關(guān)鍵詞：黃牛;瘤胃微生物;瘤胃液物質(zhì)

中圖分類號：S823

文獻標識碼：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.05.004

0引言

黃牛在西藏畜牧業(yè)中占很大的比例，目前，對于西藏黃牛瘤胃內(nèi)微生物、瘤胃液物質(zhì)特征值進行的研究較少，但對于黃牛瘤胃內(nèi)微生物數(shù)量、種類、變化規(guī)律進行掌控，便于更好對草牧資源進行利用。未來極有可能利用各種基因工程，對纖維素分解菌進行體外篩選及培養(yǎng)，對纖維素進行開發(fā)，使其可在體外對飼料進行有效分解，提升草牧的使用價值。

1材料與方法

1.1材料

選取西藏地區(qū)的10頭黃牛，對黃牛瘤胃微生物進行檢測，選取4頭黃牛對其進行瘤胃瘺管手術(shù)，4頭黃牛中公母各2頭，且屬于成年黃牛，年齡2-4歲。

1.2藥品及儀器

選取百泰克生物公司研制的RNA提取的純化試劑盒、日本Mit-subishi公司研制的氧氣指示劑、微需氧氣生產(chǎn)袋、密封培養(yǎng)管7.0L、厭氧產(chǎn)氣袋、SIGMA公司研制的DEPC、法瑪西亞公司研制的尼龍膜、北京江晨生物研究中心研制的其他藥品。上海生物技術(shù)有限公司研制的地高辛標記引物[1]。

1.3飼料

依照西藏農(nóng)牧業(yè)現(xiàn)有飼料特點和西藏當?shù)攸S牛營養(yǎng)代謝情況，對于飼料配方進行確定，飼料由蘭州大學(xué)負責配置，分別于每天上午9：00、下午6：00對黃牛進行喂養(yǎng)，除喂養(yǎng)飼料外，還需進行水、添加劑的喂養(yǎng)，飼料配方中粗飼料占絕大部分比例，并且在夜間不再進行喂養(yǎng)。選取的試驗黃牛根據(jù)其體重進行喂草，將精料依據(jù)配方比均勻拌至水中，除上午9：00、下午6：00外，其余時間均以草料為主。

1.4測定可溶性糖及不同態(tài)N

選取蒽酮法對可溶性糖進行測定，選取半微量凱氏定氮法對不同態(tài)N進行測定，不同態(tài)N包括全N、N03--N、NH4+-N。

1.5細菌培養(yǎng)基

厭氧細菌培養(yǎng)基經(jīng)過分離并改良后，培養(yǎng)基涵蓋0.5g酵母膏、0.1g濃度為1%的刃天青溶液、0.2g肉膏、1g胰蛋白胨、1.5g瓊脂，滅菌瘤胃液與無菌水的比例為1：1，劑量為78mL，把以上物質(zhì)均勻溶于混合液中，隨后加入2g葡萄糖、5mL濃度為8%Na2CO3、1g濃度為0.07%氯高鐵血紅素、pH值為7.0、1mL濃度為3%鹽酸半胱氨酸，并向混合液中加入CO2。

選取厭氧袋進行厭氧培養(yǎng)，羧菌選取的培養(yǎng)基經(jīng)過篩選并改良后，培養(yǎng)基涵蓋1g淀粉、1.5g酵母膏、5g醋酸鈉、10g蛋白質(zhì)、10g牛肉膏、1g葡萄糖、15g瓊脂、0.5gL-半胱氨酸、滅菌瘤胃液與無菌水的比例為1：1，劑量為500mL，pH值為7.1-7.2，進行滅菌操作后，在混合液中加入1mL濃度為10%的NaC1、500mL濃度為5%的Na2S、檸檬酸鐵混合液濃度為7%。

2結(jié)果

2.1纖毛蟲數(shù)量變化特征值

改造黃牛血細胞計數(shù)板，并對瘤胃原液利用甲基綠甲醛液進行稀釋，分別對選取的10頭黃牛纖毛蟲數(shù)量在瘤胃液中的情況及24h內(nèi)纖毛蟲數(shù)量變化情況進行分析，共發(fā)現(xiàn)纖毛蟲12種，數(shù)量特征值為毛頭蟲占總纖毛蟲的70.4%-72.5%。黃牛瘤胃液中24h內(nèi)纖毛蟲變化情況：上午10：00至下午2：00，由于黃牛瘤胃液排空且大量進食，纖毛蟲數(shù)量有所下降;下午2：00-6：00，即喂養(yǎng)精料和水前，由于黃牛喂食減輕，纖毛蟲數(shù)量有所增加。因此，可得出纖毛蟲數(shù)量與黃牛食用飼料有直接關(guān)系[2]。纖毛蟲在上午喂食精料及飲水后，伴隨黃牛瘤胃液排空數(shù)量顯著下降，隨后又由于喂食及養(yǎng)分增加，纖毛蟲數(shù)量有明顯上升。

2.2細菌數(shù)量變化特征值

在特殊培養(yǎng)基改良、分離、培養(yǎng)的作用下，對真菌及細菌進行計數(shù)，選取地高辛標記法對真菌及細菌進行雜交。結(jié)果顯示，細菌數(shù)量變化情況和纖毛蟲數(shù)量變化情況保持一致，細菌在上午喂食精料及飲水后數(shù)量下降，在喂食精料和水前有所增長，與黃牛瘤胃內(nèi)物質(zhì)養(yǎng)分組成相同。

3討論

在黃牛瘤胃中可溶性糖90%在微生物的作用下，被發(fā)酵分解為CO2及VFA，且有能量生成，為微生物繁殖提供條件，瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)分解菌占總數(shù)的12%-18%。由此可知，導(dǎo)致N源及可溶性糖出現(xiàn)變化的因素為黃牛喂食的時間以及食物停留于黃牛瘤胃中的時間。對于黃牛喂養(yǎng)時間及形式詳細進行介紹，N源的消化時間分別在喂食精料、上午采食前以及喂食精料前、停止采食后，此段時間由于瘤胃物質(zhì)更新速度較慢，因此瘤胃內(nèi)N源得以消化。喂食精料后2h內(nèi)，可溶性糖出現(xiàn)最高值，此時淀粉分解量達最大。普遍微生物分泌的復(fù)合酶促進纖維素進行分解，復(fù)合酶涵蓋胞外酶及胞內(nèi)酶，在二者的共同作用下，纖維素先行分解為多糖分支較少，隨后分解為二碳糖，在酶水解的作用下，纖維二糖分解為葡萄糖，此時糖量值處于穩(wěn)定狀態(tài)，在試驗中可溶性糖共有2個高峰值，且均是喂食精料后，微生物分解2-3h內(nèi)生成淀粉[3]。

飼養(yǎng)草料中的營養(yǎng)成分直接影響纖毛蟲的數(shù)量，由于西藏地區(qū)草料營養(yǎng)價值略低、纖維素含量較高，在纖維素降解中由于瘤胃真菌、細菌、原蟲的存在，導(dǎo)致半纖維素及纖維素均被降解。但瘤胃中其余微生物無法對半纖維素及纖維素進行直接降解。瘤胃內(nèi)纖毛蟲總數(shù)為每毫升1.5×206～8.6×206。纖毛蟲在西藏黃牛體內(nèi)主體為毛蟲科，而纖毛蟲屬于毛蟲科，主要依靠纖維素生存，密毛蟲在均毛蟲科中占較大比例，占總體的5.4%-6.9%。而內(nèi)毛蟲又在毛蟲科中占絕大比例，約占總體的70.9%。纖毛蟲在瘤胃中的數(shù)量以及變化情況受黃牛喂食時間、飼料營養(yǎng)成分組成以及食物停留在瘤胃中時間的影響。黃牛在上午12：00至晚上8：00會大量消耗攝取到的食物，伴隨瘤胃內(nèi)物質(zhì)的排空，纖毛蟲數(shù)量有所下降，在下午黃牛停止喂食時，纖毛蟲數(shù)量達至最大，此時，纖毛蟲得以大量繁殖，纖毛蟲總數(shù)可達1.5×106/mL。

4結(jié)論

黃牛瘤胃中微生物數(shù)量及種類較多，其中包含大量的真菌、細菌以及蟲類，通過對瘤胃中的纖毛蟲數(shù)量、細菌數(shù)量進行研究分析，得出影響其數(shù)量及變化規(guī)律的因素，但由于黃牛瘤胃內(nèi)微生物生態(tài)系統(tǒng)極具復(fù)雜性，本文僅是對于其中的幾點微生物進行探究，不具備完善性，因此，還需有關(guān)人員對其進行更深一步的研究。

參考文獻

[1]朱昊鵬，鄭月，顏培實.精料補飼水平對錦江黃牛生長性能和瘤胃液理化指標的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，2017，49（3）：24-29.

[2]魏園，趙晨旭，李心慰，等.不司粗纖維源口糧對梅花鹿瘤胃微生物區(qū)系的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2018，38（1）：217-221.

[3]李君風，原現(xiàn)軍，蕈志浩，等.西藏地區(qū)牦牛瘤胃中兼性厭氧纖維素降解菌的分離鑒定[J].草業(yè)學(xué)報，2017，26（6）：176-184.

作者簡介：巴桑珠扎（1979-），男，藏族，西藏拉薩人，就職于西藏自治區(qū)畜牧獸醫(yī)研究所，主要從事反芻動物遺傳育種工作。

通信作者：姜南（1977-），男，漢族，就職于西藏白治區(qū)畜牧獸醫(yī)研究所，主要從事畜禽免疫病理研究工作。