翁祖桐

摘 要：【目的】探討壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲快速生長(zhǎng)的最適宜光照強(qiáng)度?！痉椒ā恳詨喜诵缕贩N申福2號(hào)自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲為培養(yǎng)材料，研究不同光照強(qiáng)度（10、20、40、80、100 μmol·photons m-2·s-1）對(duì)自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲生長(zhǎng)、光系統(tǒng)PSⅡ最大量子效率、光合色素含量、光合作用及抗氧化酶活性的影響?！窘Y(jié)果】經(jīng)25 d培養(yǎng)后，壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的增重隨光照強(qiáng)度梯度增加而表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，其中80 μmol·photons m-2·s-1光照強(qiáng)度培養(yǎng)下的藻體增重最多，且光系統(tǒng)PSⅡ最大量子效率Fv/Fm值最高。葉綠素a、類胡蘿卜素、藻紅蛋白含量整體上隨光強(qiáng)的增加而逐漸降低，藻藍(lán)蛋白含量則在各組間差異不顯著。藻體CA和RubisCO酶活性均隨光強(qiáng)增加而呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。其中，以40 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的酶活性最強(qiáng)，80 μmol·photons m-2·s-1次之。超氧陰離子自由基和SOD在不同光強(qiáng)下的活性隨光強(qiáng)增加呈現(xiàn)先減弱后增強(qiáng)的趨勢(shì)，80 μmol·photons m-2·s-1下培養(yǎng)的壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲這兩種酶的活性均最低，分別為最高活性試驗(yàn)組的24.0%和22.9%?！窘Y(jié)論】在80 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下，壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲增重最多，藻體最大量子效率Fv/Fm值最大，RubisCO和CA活性較強(qiáng)，超氧陰離子和SOD活性最低，該光照強(qiáng)度最有利于壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的快速增殖。

關(guān)鍵詞：壇紫菜;自由絲狀體;光照強(qiáng)度;生長(zhǎng);生理指標(biāo)

中圖分類號(hào)：S 968.43文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）04-488-07

Abstract：【Objective】Intensity of LED light for optimal growth of free-living conchocelis of Pyropia haitanensis （FCP） was studied.【Method】The effects of varied light intensities （i.e.， 10， 20， 40， 80 or 100 μmol ·photons m-2·s-1） using LED on the growth， maximal quantum efficiency （Fv/Fm） on PS II， content of photosynthetic pigments as well as the photosynthesis and antioxidant enzymes of Shenfu No.2， a new cultivar of P. haitanensis， were determined.【Result】After 25 d of culturing， the weight of algae increased with increasing intensity of illumination and peaked when 80 μmol·photons m-2·s-1 was applied. As the weight reached the maximum， the Fv/Fm on PS II was also at its highest level. On the other hand， the contents of chlorophyll a， carotenoids， and phycoerythrin decreased gradually as the light intensity increased. No significant differences on phycocyanin among the groups were observed. The greatest activities of CA and RubisCO in the algae were observed under 40 μmol·photons m-2·s-1 followed by 80 μmol·photons m-2·s-1 treatment before a decline. Upon an increase on light intensity， the activities of superoxide anion radicals and SOD decreased to the lowest level under 80 μmol·photons m-2·s-1 and then raised again. 【Conclusion】 The vegetative filaments of FCP cultured under 80 μmol·photons m-2·s-1 light appeared to render the highest algae growth rate and Fv/Fm， lowest activities of superoxide anions and SOD， and strongest activities of RubisCO and CA.

Key words： Pyropia haitanensis; free-living conchocelis; light intensity; growth; physiological characteristics

0 引言

【研究意義】壇紫菜Pyropia haitanensis在系統(tǒng)分類上屬于紅藻門，原紅藻綱Protoflorideae，紅毛菜目Bangiales，紅毛菜科Bangiaceae，Pyropia屬[1]，廣泛栽培于我國(guó)福建、浙江、廣東等沿海地區(qū)，其年產(chǎn)量占全國(guó)紫菜年總產(chǎn)量的3/4以上。隨著壇紫菜優(yōu)良品種培育工作的不斷深入，許多新品種（系）都開(kāi)始采用自由絲狀體采苗的育苗工藝[2-4]。以壇紫菜自由絲狀體為種源，可保持新品種（系）的遺傳穩(wěn)定，防止因其他外源種質(zhì)混入而引起的種質(zhì)退化。因此，通過(guò)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)出豐富優(yōu)質(zhì)的壇紫菜良種的自由絲狀體，對(duì)實(shí)現(xiàn)壇紫菜的良種化生產(chǎn)至關(guān)重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前有關(guān)壇紫菜自由絲狀體生長(zhǎng)發(fā)育的生態(tài)因子研究，主要集中在光照[5-7]、溫度[5]、鹽度和營(yíng)養(yǎng)鹽供給水平[6]等方面。光是光合生物進(jìn)行光合作用的能量來(lái)源，是大多數(shù)生物賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)。光照強(qiáng)度是光的一個(gè)重要屬性，不同光照強(qiáng)度會(huì)對(duì)植物體生長(zhǎng)、發(fā)育產(chǎn)生不同程度的影響[8-9]。相關(guān)研究表明，在弱光下，許多藻類會(huì)增加藻膽蛋白及光合色素含量，有效收集光合作用所需的光能，而當(dāng)光照強(qiáng)度加強(qiáng)時(shí)，捕光色素比例降低，減少光吸收，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞[10]。不同光照強(qiáng)度還會(huì)影響藻類光合過(guò)程的關(guān)鍵限速酶活性[11]，并改變光系統(tǒng)活性[12-13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】紫菜葉狀體通常具有較高的光飽和點(diǎn)[14]，絲狀體較葉狀體卻對(duì)光強(qiáng)更為敏感，相關(guān)的壇紫菜自由絲狀體培養(yǎng)大多數(shù)處在較低的光照強(qiáng)度（20、27、40 μmol·photons m-2·s-1）下[5-6]，而在高光強(qiáng)下（156 μmol·photons m-2·s-1）絲狀體光系統(tǒng)PSⅡ的電子傳遞速率會(huì)明顯下降[15]。因此，在此基礎(chǔ)上，篩選出最適宜光強(qiáng)進(jìn)行壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的快速增殖，不僅可以充分發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)藻絲的光適應(yīng)能力，還能夠提高其光能利用效率和生長(zhǎng)速率，具有重要的實(shí)際生產(chǎn)意義。但有關(guān)絲狀藻絲營(yíng)養(yǎng)增殖與光因子的關(guān)系卻鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以光照強(qiáng)度作為單一變量，研究了不同梯度的光照強(qiáng)度（10、20、40、80、100 μmol·photons m-2·s-1）的LED光源對(duì)壇紫菜新品種申福2號(hào)自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的特定生長(zhǎng)率、PSⅡ最大光量子效率、主要光合色素含量及部分抗氧化酶活性等生理指標(biāo)的影響，旨在篩選出最適宜的光照強(qiáng)度用于壇紫菜良種自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的快速擴(kuò)繁。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以壇紫菜新品種申福2號(hào)自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲作為試驗(yàn)材料[4]，材料保存于福建省大成水產(chǎn)良種繁育試驗(yàn)中心的保種室內(nèi)，保存方法參照Kato等[16]的方法。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的同步化培養(yǎng) 同步化培養(yǎng)參考韓軍軍等的方法[7]。每5 d更換一半MES培養(yǎng)基[16]，直至培養(yǎng)至試驗(yàn)所需的藻體生物量。

1.2.2 試驗(yàn)光源設(shè)定與藻體培養(yǎng) 采用LED復(fù)合型白光源，所有光源安裝在同一培養(yǎng)架的不同培養(yǎng)層，通過(guò)調(diào)節(jié)各培養(yǎng)層的燈管數(shù)量和輻照高度，并采用PLA-20植物光照分析儀測(cè)定光照強(qiáng)度，使照射到培養(yǎng)瓶底部的光量子通量密度分別為10、20、40、80和100 μmol·m-2·s-1。取同等質(zhì)量（0.85±0.01）g預(yù)先同步化培養(yǎng)的壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲，轉(zhuǎn)入1 000 mL錐形培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將錐形瓶分別置于不同光強(qiáng)條件下充氣培養(yǎng)（大氣CO2濃度）。每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)條件為：光周期12L∶12D，溫度（24±0.5）℃，鹽度30。每隔5 d更換1次MES培養(yǎng)液，并稱量藻體鮮重，培養(yǎng)時(shí)間為25 d。

1.2.3 藻體特定生長(zhǎng)率的測(cè)定 每5 d測(cè)定并計(jì)算各組樣品的特定生長(zhǎng)率（Specific Growth Rate，SGR），其計(jì)算公式為：SGR（%）=100×（LnST-LnST-5）/5。其中，ST為第T天藻體鮮重，ST-5代表前一次稱量時(shí)的藻體鮮重。

1.2.4 PSⅡ最大量子效率和主要光合色素含量的測(cè)定 采用超便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xMINI PAMⅡ（德國(guó)WALZ公司）測(cè)定藻體PSⅡ最大量子效率Fv/Fm，方法參考文獻(xiàn)[17]。稱量新鮮藻體100 mg，暗光于甲醇（100%）溶液中研磨粉碎。4℃避光過(guò)夜后離心（10 000 r·min-1，10 min），取上清液。之后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-3200，日本島津公司）測(cè)定樣本的吸光度。葉綠素a（chlorophyll a，Chl.a）和類胡蘿卜素（carotenoid，Car）含量的測(cè)定分別采用Porra[18]和Parsons等[19]的方法。同時(shí)，稱量鮮藻100 mg，置于8 mL磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 6.5）中研磨粉碎，4℃避光過(guò)夜后離心（19 000 r·min-1，15 min），取上清液，參考Beer等[20]的方法計(jì)算藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）和藻藍(lán)蛋白（phycocyanin，PC）含量。

1.2.5 部分光合作用及抗氧化酶活性的測(cè)定 壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase，CA）活性的測(cè)定參照Haglund等[21]的方法。樣本的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose Bisphosphate Carboxylase，RubisCO）活性測(cè)定參照Ronan等[22]報(bào)道的非放射性微孔板法。所有處理樣品經(jīng)溫化孵育后用Infinite 200 Pro NanoQuant酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）測(cè)定其在450 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算酶活力。

稱取新鮮藻體100 mg，按照重量（g） ∶體積（mL）=1∶9的比例加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液，研磨成勻漿后離心（10 000 r·min-1，4℃，10 min），取上清液，參照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定超氧陰離子自由基和超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)作圖采用Excel 2016。利用SPSS 23.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），差異顯著水平設(shè)置為P<0.05，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的表示方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的生長(zhǎng)曲線與特定生長(zhǎng)率

在不同光照強(qiáng)度下，壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的增重呈現(xiàn)差異。如圖1所示，經(jīng)25 d培養(yǎng)后，光強(qiáng)80 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的藻體增重最多，為5.29 g;10 μmol·photons? m-2·s-1藻體增重最少，僅為2.70 g。光強(qiáng)范圍為10～80 μmol·photons m-2·s-1藻體增重整體上趨于隨光強(qiáng)增強(qiáng)而增加，而光強(qiáng)增加至100 μmol·photons m-2·s-1時(shí)藻體增重下降。不同階段不同光強(qiáng)下壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的特定生長(zhǎng)率（SGR）也存在差異（表1），在初始培養(yǎng)5 d后測(cè)定特定生長(zhǎng)率，20 μmol·photons m-2·s-1下SGR最高，100 μmol·m-2·s-1最低，其他組間無(wú)明顯差異。培養(yǎng)10 d后，10 μmol·photons m-2·s-1下藻體的SGR逐漸降低，整體低于其他試驗(yàn)組;20 μmol·photons m-2·s-1下絲狀體的SGR在5 d后一直保持在均衡狀態(tài);80 μmol photons·m-2·s-1下絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的特定生長(zhǎng)率相對(duì)于其他試驗(yàn)組保持在中上水平，其中在15～25 d藻體的SGR較高。

2.2 主要光合色素及藻膽蛋白含量

如圖2所示，不同光強(qiáng)下壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的葉綠素a含量存在差異，呈現(xiàn)出隨光照強(qiáng)度增強(qiáng)而降低的趨勢(shì)。其中，10 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的藻體葉綠素a含量最高，為330.11 μg·g-1;100 μmol·photons m-2·s-1組最低，為270.05 μg·g-1，兩組間存在顯著差異（P<0.05）。與葉綠素a含量的測(cè)定結(jié)果相類似，類胡蘿卜素含量總體上也隨光照強(qiáng)度增加而逐漸下降，但光強(qiáng)在10～80 μmol·photons m-2·s-1范圍內(nèi)差異不明顯，而當(dāng)光強(qiáng)增加至100 μmol·photons m-2·s-1時(shí)，培養(yǎng)的藻體類胡蘿卜素含量顯著降低，含量為13.13 μg·g-1，約為20 μmol·photons m-2·s-1光強(qiáng)培養(yǎng)下的1/3（P<0.05）。藻體的藻紅蛋白含量也隨著光照強(qiáng)度增加而降低（圖3），10 μmol·photons m-2·s-1組含量最高，為61.36 mg·g-1，100 μmol·photons m-2·s-1組含量最低，為38.60 mg·g-1。藻藍(lán)蛋白含量最低的是100 μmol·photons m-2·s-1組， 為3.63 mg·g-1，顯著低于其他各組。其他各組間藻藍(lán)蛋白含量無(wú)顯著差異。

2.3 PSⅡ最大量子效率Fv/Fm

如圖4所示，壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲在光強(qiáng)40 μmol·photons m-2·s-1下培養(yǎng)，PSⅡ最大量子效率Fv/Fm值最小，為0.668，顯著低于其他各試驗(yàn)組。而80 μmol·photons m-2·s-1組的Fv/Fm值顯著高于其他各組，為0.741，是40 μmol·photons m-2·s-1組的1.11倍。10和20 μmol·photons m-2·s-1組間的Fv/Fm值無(wú)顯著差異。

2.4 光合作用及抗氧化相關(guān)酶活性

不同光強(qiáng)下培養(yǎng)藻體的CA和RubisCO活性如圖5所示，藻體CA和RubisCO的酶活性均隨光強(qiáng)增加而呈現(xiàn)先加強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。在低光強(qiáng)下（10～40 μmol·photons m-2·s-1）隨光強(qiáng)增加而提高，高光強(qiáng)（40～100 μmol·photons m-2·s-1）下則反之。其中以40 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的酶活性最強(qiáng)，分別較最低組增加19.39%和13.86%（P<0.05）。

不同光強(qiáng)下藻體的超氧陰離子自由基和SOD活性存在差異（圖6），且具有一定的規(guī)律性。在10 μmol·photons m-2·s-1光強(qiáng)培養(yǎng)下，藻體的超氧陰離子自由基活性最強(qiáng)，為157.01 U·L-1，隨著光強(qiáng)增加，其活性逐漸降低，當(dāng)光強(qiáng)增至80 μmol·photons m-2·s-1時(shí)，其活性最低，為37.74 U·L-1。而在100 μmol·photons m-2·s-1下培養(yǎng)時(shí)，酶活性又增強(qiáng)至72.63 U·L-1。與超氧陰離子自由基相類似，藻體的SOD活性也隨光強(qiáng)增加而呈現(xiàn)先減弱后增強(qiáng)的趨勢(shì)。10 μmol·photons m-2·s-1光強(qiáng)培養(yǎng)下活性最強(qiáng)，為22.40 U·L-1。光強(qiáng)80 μmol·photons m-2·s-1下培養(yǎng)活性最低，為5.13 U·L-1。光強(qiáng)繼續(xù)增強(qiáng)至100 μmol·photons m-2·s-1時(shí)，酶活性又增強(qiáng)至9.23 U·L-1。

3 討 論

特定生長(zhǎng)率（SGR）常用于衡量生物體生長(zhǎng)狀況，SGR 值越大，說(shuō)明生物體生長(zhǎng)越快[23-24]。本研究的結(jié)果顯示，在光強(qiáng)10～80 μmol·photons m-2·s-1，壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲生長(zhǎng)速度隨光照強(qiáng)度增加而加快，表現(xiàn)為SGR值升高。這與張前前等在硅藻研究中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致[25]。但是，隨著光照強(qiáng)度的持續(xù)增加，在100 μmol·photons m-2·s-1光強(qiáng)下培養(yǎng)的藻體生長(zhǎng)減緩。這表明光照過(guò)強(qiáng)會(huì)對(duì)藻體的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用。正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)v/Fm是一個(gè)較穩(wěn)定的值，反映了植物體潛在的最大光合活性，與生長(zhǎng)速度之間存在一定的相關(guān)性。本研究中，最大量子效率Fv/Fm值總體上隨光強(qiáng)增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，其中80 μmol·photons m-2·s-1光強(qiáng)培養(yǎng)下的Fv/Fm值最大，表明該光強(qiáng)下的植物潛在光合作用活性最強(qiáng)，這也與藻體SGR的結(jié)果相類似。與野生型壇紫菜絲狀體不同的是，野生型壇紫菜絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲在較高光強(qiáng)（78 μmol·photons m-2·s-1）下的實(shí)際量子效率（Y）和最大相對(duì)電子傳遞速率（rETRmax）均會(huì)顯著下降[15]，這可能與人工選育的新品種申福2號(hào)絲狀體種質(zhì)長(zhǎng)期處在LED光照環(huán)境下擴(kuò)大培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)藻絲自身賦予了更高的光適應(yīng)能力有關(guān)。

本研究中，壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲在弱光條件培養(yǎng)下，藻體葉綠素a、類胡蘿卜素及藻紅蛋白含量均表現(xiàn)出較高的水平，但當(dāng)光照過(guò)強(qiáng)（100 μmol·photons m-2·s-1）時(shí)，則含量顯著性下降。藻藍(lán)蛋白含量在100 μmol·photons m-2·s-1組同樣最低，但其他各組間差異不明顯。以往的研究已經(jīng)證實(shí)，低光強(qiáng)下培養(yǎng)的海藻光合色素含量上升，光合作用單元和PSⅡ反應(yīng)中心數(shù)量會(huì)增多，這有助于藻體對(duì)光能的捕獲和傳導(dǎo)，而當(dāng)光照過(guò)強(qiáng)時(shí)，藻體吸收的光能超過(guò)光合作用所需時(shí)，過(guò)多的光能使海藻處于脅迫狀態(tài)，藻體光合色素含量也相應(yīng)降低[15，26]，這是一種植物體常見(jiàn)的光適應(yīng)策略。

RubisCO和CA是植物光合作用和CO2濃縮機(jī)制中的兩個(gè)關(guān)鍵酶，可以調(diào)節(jié)光合反應(yīng)的CO2同化和光呼吸，并在一定程度上影響植物體的光合速率[27]。本研究中，這兩種酶的活性同樣隨光強(qiáng)遞增而呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，其中，以40 μmol·photons m-2·s-1光強(qiáng)下活性最高，80 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下也表現(xiàn)出較高的酶活性。超氧陰離子自由基是逆境脅迫下最早形成的自由基種類，過(guò)高的自由基含量往往會(huì)造成細(xì)胞質(zhì)膜損傷，引起膜系統(tǒng)的癱瘓，從而導(dǎo)致代謝功能喪失[28]。SOD是生物體細(xì)胞內(nèi)清除超氧陰離子自由基的一種特異酶，其活性與超氧陰離子自由基存在一定的相關(guān)性，當(dāng)植物體受到環(huán)境脅迫時(shí)，往往會(huì)表現(xiàn)出較高水平的超氧陰離子自由基[29-31]。研究結(jié)果顯示，80 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲的超氧陰離子和SOD活性最低，說(shuō)明該光強(qiáng)培養(yǎng)下的壇紫菜絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲生長(zhǎng)狀況良好，不存在典型的環(huán)境脅迫效應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究中，80 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)藻絲，在各試驗(yàn)組中藻體的增重最多，最大量子效率Fv/Fm值最大，RubisCO和CA酶活性較強(qiáng)，超氧陰離子和SOD活性最低。這表明80 μmol·photons m-2·s-1是最有利于壇紫菜自由絲狀體營(yíng)養(yǎng)增殖的光照強(qiáng)度。

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（責(zé)任編輯：林海清）