張牡丹 賽鬧汪青 冉瑞蘭

摘 要：在含有不同比例凹凸棒石粘土的混合基質(zhì)中（凹凸棒石粘土∶基質(zhì)的體積比分別為0∶1、1∶100、1∶70、1∶50、1∶20）培育當(dāng)歸幼苗，以研究Cu脅迫對(duì)當(dāng)歸幼苗的生理學(xué)影響及凹凸棒石粘土對(duì)Cu脅迫下當(dāng)歸幼苗的保護(hù)作用。結(jié)果表明：（1）基質(zhì)中不存在凹凸棒石粘土?xí)r，隨著CuCl2處理濃度的上升，當(dāng)歸幼苗葉片的實(shí)際光化學(xué)效率 [Y（Ⅱ）]、PSⅡ電子傳遞速率（ETR）、光化學(xué)淬滅（qP）和葉綠素含量都逐漸降低;而葉片的非光化學(xué)猝滅（qN）、可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT、APX）、過(guò)氧化氫含量以及根和葉片中的Cu含量均顯著性增加，表明Cu脅迫降低了當(dāng)歸幼苗的光化學(xué)效率、葉綠素的合成、增加了組織中Cu含量和氧化壓力。（2）CuCl2脅迫下，當(dāng)基質(zhì)中存在不同比例的凹凸棒石粘土?xí)r，Cu脅迫所導(dǎo)致的葉片Y（Ⅱ）、ETR、qP及葉綠素含量的降低以及葉片qN、可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性、過(guò)氧化氫含量、根和葉片的Cu含量的升高均有所緩解，說(shuō)明凹凸棒石粘土通過(guò)吸附或固定基質(zhì)中游離的以及可交換的Cu離子，減少了當(dāng)歸幼苗對(duì)有效Cu離子的吸收，從而緩解了Cu離子對(duì)植物造成的生理學(xué)壓力，且這種緩解作用依次為1∶70 > 1∶50 > 1∶20 ≥ 1∶100 > 0∶1，這是基質(zhì)中存在過(guò)多的凹凸棒石粘土?xí)r，其在吸收基質(zhì)中Cu離子的同時(shí)也會(huì)影響基質(zhì)的通氣性、透水性和酸堿度等。這表明凹凸棒石粘土在基質(zhì)中的適當(dāng)加入能緩解Cu脅迫對(duì)當(dāng)歸幼苗造成的的生理學(xué)壓力。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸幼苗，? 銅脅迫， 凹凸棒石粘土， 氧化壓力， 緩解作用

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945.78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）04-0453-11

Abstract：Seeds of Angelica sinensis were planted in a matrix containingdifferent proportions of attapulgite clay （the volume ratio of attapulgite clay and matrix was 0∶1， 1∶100， 1∶70， 1∶50， 1∶20） to study the physiological effects of Cu stress on A. sinensis seedlings and the protective effect of attapulgite clay on A. sinensis seedlings under CuCl2 stress. The results were as follows：（1） With the increase of exogenous CuCl2 concentration， Y（Ⅱ） （PS Ⅱ operation efficiency）， ETR （rate non-cyclic electron transport throughPS Ⅱ ）， qP （photochemical quenching）， and chlorophyll content of leaves of A. sinensis seedlingsdecreased， while the qN （non-photochemical quenching）， soluble protein content， activities of antioxidant enzymes （SOD， POD， CAT， and APX）， the content of H2O2and the CuCl2 content in the leaves and roots increased significantly. The results showed that the Cu stressdecreased in both photochemical efficiency and chlorophyll synthesis of A. sinensis seedlings， and increased the content of Cu and oxidation pressure in tissues. （2） Under Cu stress， the presence of attapulgite clay in the growth matrix could alleviate the copper-stress-induceddecreases in the Y（Ⅱ）， qP， ETR， and chlorophyll content of the leaves， and could alleviate the copper-stress-induced increases of the qN， soluble protein content， activities of antioxidant enzymes， content of H2O2 as well as copper contents in the leaves and roots. Our results indicate that the attapulgite clay can reduce the absorption of available Cu2+ by adsorbing or immobilizing free and exchangeable Cu2+ in the matrix， thus relieving the physiological pressure caused by Cu2+ on plants， which is propitious to its growth. And in the order of the mitigation is 1∶70 > 1∶50 > 1∶20 ≥ 1∶100 > 0∶1， this isdue to the fact that when there is too much attapulgite clay in the matrix， the absorption of Cu2+ in the matrix will also affect the original physical properties of the matrix such as aeration， permeability and pH and so on. These results together manifest that the attapulgite clay in the matrix can alleviate the copper-induced physiological stress on A. sinensis seedlings.

Key words：Angelica sinensis seedlings， copper stress， attapulgite clay， oxidant pressure， alleviation effect

當(dāng)歸（Angelica sinensis）為傘形科植物，在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，其根可用于補(bǔ)益血液，潤(rùn)腸，治療月經(jīng)失調(diào)、虛寒腹痛、風(fēng)濕痹痛、跌撲損傷，并作為慢性瀉藥來(lái)治療體弱老人的便秘（Wei et al.， 2009;Fang et al.，2012）。目前，當(dāng)歸在甘肅、四川、云南、湖北等地都有栽培，其中以甘肅省栽培面積最大，主要分布在甘肅省岷山山脈東支南北兩面山麓地區(qū)（邱黛玉等，2010）。

銅（Cu）作為植物必需的微量元素，其在蛋白質(zhì)構(gòu)成、光合電子傳遞和細(xì)胞壁的新陳代謝等方面起著重要作用（Guerrero，2005）。然而，過(guò)量的Cu離子則會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生不良影響。Maksymiec & Krupa（2006）發(fā)現(xiàn)，在重金屬Cu脅迫早期，植物組織中的H2O2含量和抗氧化酶活性增加，表明過(guò)量的Cu會(huì)引起植物細(xì)胞的氧化壓力。同時(shí)，謝佳佳等（2018）研究表明，Cu脅迫還會(huì)阻礙植物的光合作用和影響葉綠素的合成。Kopittke et al.（2006）進(jìn)一步的研究表明，這些Cu脅迫所引起的生理學(xué)的變化最終會(huì)引起植物的生長(zhǎng)發(fā)育受阻，甚至造成植物死亡。近年來(lái)，Cu離子對(duì)環(huán)境污染較為嚴(yán)重（Sharma & Agrawal， 2005;謝佳佳等，2018），尤其是銅礦導(dǎo)致的水土污染（Li et al.，2008;趙靜，2009）以及含銅殺蟲(chóng)劑（如波爾多液，Cu離子含量在1.5 g·L-1）（Druart et al.，2012）的大量施用使環(huán)境中的植物遭受?chē)?yán)重的Cu離子脅迫。因此，研究Cu脅迫對(duì)植物（特別是對(duì)重金屬有著嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)的藥用植物）的生理學(xué)影響具有重要意義。然而，Cu脅迫對(duì)植物生理學(xué)影響的研究多集中于擬南芥等模式植物或重要作物中，而其對(duì)當(dāng)歸等藥用植物影響的研究則鮮有報(bào)道。

如何有效降低Cu離子對(duì)植物的影響也是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。凹凸棒石粘土，簡(jiǎn)稱(chēng)凹土，是一種具有土和石特性的非金屬礦質(zhì)資源（胡濤等，2005）。凹凸棒石粘土可通過(guò)吸收、離子交換等多種形式減少環(huán)境中游離的重金屬離子，且其成本低廉（魏榮道和崔嶠，2005;朱海清和周杰，2004）。目前，已有研究利用凹凸棒石粘土對(duì)Pb、Cu、Cd等污染的生態(tài)環(huán)境進(jìn)行修復(fù)（王成等，2016;楊秀敏和胡桂娟，2004;譚科艷等，2011），發(fā)現(xiàn)凹凸棒石粘土能夠吸附和固定基質(zhì)中游離的重金屬，從而保護(hù)生態(tài)環(huán)境?；诎纪拱羰惩恋倪@一特性，在栽培基質(zhì)中加入凹凸棒石粘土有可能緩解Cu脅迫對(duì)當(dāng)歸等藥用植物產(chǎn)生的不良影響。然而，這方面的研究在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

基于以上原因，本研究以當(dāng)歸幼苗為材料，研究了在短期重金屬Cu的脅迫下，當(dāng)歸幼苗的生理學(xué)變化以及凹凸棒石粘土對(duì)Cu脅迫的緩解作用，以期能進(jìn)一步豐富凹凸棒石粘土在農(nóng)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，并對(duì)如何減少重金屬離子對(duì)植物的毒害作用提供一定的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料的培養(yǎng) 供試驗(yàn)材料當(dāng)歸（Angelica sinensis）品種為岷當(dāng)歸。種子用蒸餾水沖洗4次，并用1%的NaClO消毒處理10 min，然后用蒸餾水清洗8次以除去種子表面殘存的NaClO。之后將種子放在鋪有雙層紗布的培養(yǎng)皿中，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)催芽。7d后，挑選發(fā)芽一致的種子栽種于不同比例的混合基質(zhì)中（凹凸棒石粘土：基質(zhì)的體積比分別為0∶1、1∶100、1∶70、1∶50、1∶20，且各混合基質(zhì)的總體積相等，下同），并澆灌1/2倍的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液至基質(zhì)完全濕潤(rùn)，在25 ℃、200 μmol · m-2 · s-1光強(qiáng)條件下進(jìn)行生長(zhǎng)，待子葉展開(kāi)后每隔3d澆一次營(yíng)養(yǎng)液。

1.1.2 材料處理 選取30d苗齡、長(zhǎng)勢(shì)一致的當(dāng)歸幼苗作為供試驗(yàn)材料進(jìn)行如下兩個(gè)實(shí)驗(yàn)：（1）分別用60 mL濃度為5、15、25、35 mmol·L-1的CuCl2溶液[參考趙靜（2009）報(bào)道設(shè)立Cu污染濃度）施加于基質(zhì)中（該基質(zhì)不含有凹凸棒石粘土）]，對(duì)照組加等量蒸餾水，處理24 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)量（不同處理單獨(dú)取樣4個(gè)，各指標(biāo)均重復(fù)3次，下同）。（2）用60 mL 25 mmol·L-1 CuCl2溶液施加于各混合基質(zhì)中（凹凸棒石粘土∶基質(zhì)體積比分別為0∶1、1∶100、1∶70、1∶50、1∶20），對(duì)照組加等量蒸餾水，繼而在培養(yǎng)室培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)量。

1.2 研究方法

1.2.1 葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)系數(shù)的測(cè)定 參照Genty et al.（1989）、Flexas et al.（1999）、Hazrati et al.（2016）的方法，用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)——IMAGING-PAM對(duì)當(dāng)歸幼苗進(jìn)行測(cè)定，具體測(cè)定步驟如下：連接儀器，儀器正常運(yùn)行后測(cè)得暗適應(yīng)狀態(tài)的初始熒光（Fo）和最大熒光（Fm），當(dāng)所測(cè)材料在作用光下的實(shí)時(shí)熒光（Fs）達(dá)到穩(wěn)態(tài)（20 s）后打開(kāi)飽和脈沖光，測(cè)得最大熒光（Fm′），再打開(kāi)遠(yuǎn)紅外光，測(cè)光最小熒光（Fo′）。公式如下：光適應(yīng)下實(shí)際光化學(xué)效率[Y（Ⅱ）]=（Fm′-Fs）/Fm′;電子傳遞速率（ETR）=[（Fm′-Fs）/Fm′]×PAR×0.5×0.84;光化學(xué)猝滅（qP）=（Fm′-Fs）/（Fm′–Fo′）; 非光化學(xué)猝滅（qN）=（Fm′-Fo′）/（Fm-Fo），測(cè)量結(jié)束后導(dǎo)出記錄。

1.2.2 葉綠素含量的測(cè)定 當(dāng)歸幼苗葉片的葉綠素含量根據(jù)Arnon（1949）所報(bào)道的方法進(jìn)行。稱(chēng)取真葉0.02 g切碎，置于5 mL的離心管中，加入4 mL 80%的丙酮提取液，黑暗浸提至葉片發(fā)白（4 ℃），搖勻后取浸提液3 mL于比色杯中，在645 nm和663 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，并計(jì)算葉綠素含量。

1.2.3 可溶性蛋白含量的測(cè)定 當(dāng)歸幼苗葉片的可溶性蛋白含量參照趙英永等（2016）描述的方法進(jìn)行。稱(chēng)取當(dāng)歸幼苗真葉0.01 g放入研缽中，加4 mL蒸餾水研磨成勻漿，放置30 min后在4 000 r·min-1離心20 min，棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管，并以蒸餾水定容所得提取液。吸取提取液1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白溶液，充分混合，放置2 min后，在595 nm下測(cè)定吸光值，并依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量（mg·g-1）。

1.2.4 抗氧化酶活性和過(guò)氧化氫含量的測(cè)定 用Nishikimi et al.（1972）的氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性;用Fernández et al.（2013）和Martins et al.（2011）的愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性;用Chance & Maehly （1995）的方法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性;參照Nakano & Asada（1981）的方法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化酶（APX）的活性;用Ferguson et al.（1983）的方法測(cè)定過(guò)氧化氫酶含量。

1.2.5 植物組織中銅含量的測(cè)定 為了測(cè)定Cu的含量，用70% HNO3溶液微波下消解植物材料（當(dāng)歸幼苗的根和葉），根據(jù)Chen et al.（2004）的報(bào)道，

采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Excel和Origin統(tǒng)計(jì)軟件完成試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的處理和制圖，并將數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)采用雙尾總體t檢驗(yàn)，以P<0.05表明在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的CuCl2處理對(duì)當(dāng)歸幼苗組織中的Cu含量的影響

表1結(jié)果表明，隨著CuCl2濃度的上升，當(dāng)歸幼苗根和葉片中的Cu含量增加。當(dāng)CuCl2的濃度為5 mmol·L-1時(shí)，當(dāng)歸幼苗葉片中的Cu含量和對(duì)照相比沒(méi)有顯著性差異，而根中的Cu含量和對(duì)照相比已有顯著性差異;CuCl2濃度達(dá)到15 mmol·L-1，葉片中的Cu含量和對(duì)照相比顯著性升高。這表明CuCl2脅迫導(dǎo)致植物根和葉中積累了大量的Cu，且隨著CuCl2濃度的上升，Cu在當(dāng)歸幼苗的根和葉中的積累越多。

2.2 不同濃度的CuCl2對(duì)當(dāng)歸幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)、葉綠素含量及可溶性蛋白含量的影響

當(dāng)歸幼苗根和葉片中的Cu含量隨CuCl2濃度的升高而顯著性上升（表1）。由表2可知，用5 mmol·L-1的CuCl2處理后，當(dāng)歸幼苗Y（Ⅱ）、ETR與對(duì)照相比無(wú)顯著性變化;當(dāng)CuCl2的濃度升高至15 mmol·L-1時(shí)，當(dāng)歸幼苗的Y（Ⅱ）、ETR均顯著性下降，并隨CuCl2濃度的升高而進(jìn)一步下降。較之Y（Ⅱ）和ETR，qP和qN對(duì)于CuCl2脅迫更加敏感，與對(duì)照相比，當(dāng)歸幼苗隨CuCl2濃度的升高，qP顯著性下降，qN顯著性上升（表2）。說(shuō)明外源CuCl2濃度的升高不僅僅使得根細(xì)胞中Cu含量上升，且過(guò)量的Cu可以導(dǎo)致光合電子傳遞鏈中QB結(jié)合蛋白以及PSⅡ氧化側(cè)或還原側(cè)一些電子傳遞相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致PSⅡ電子傳遞的紊亂（衛(wèi)丹丹，2016;Baker et al.，1988;Amina et al.，2013），最終導(dǎo)致葉片中Cu的積累以及PSⅡ反應(yīng)中心開(kāi)放比例、 激發(fā)能捕獲效率以及運(yùn)行效率的下降，進(jìn)而通過(guò)影響PSⅡ中電子傳遞體的功能而導(dǎo)致當(dāng)歸葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化。此外，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，伴隨當(dāng)歸幼苗葉片中的Cu含量和葉綠素?zé)晒獾淖兓?，葉綠素含量隨之降低（表2），推測(cè)這可能是Cu取代了葉綠素中的 Fe2+、Zn2 +、Mg2+等離子，致使葉綠素中心離子組成發(fā)生變化而失活，從而使葉綠素含量降低（Rousos & Harrison，1987;Liu et al.，2008;彭向永和宋敏，2011;薛盈文等，2016）。由于葉綠素的含量也影響著PSⅡ的光能利用率（楊揚(yáng)等，2016;馮鵬等，2016），因此，CuCl2所造成的葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化應(yīng)該是PSⅡ中電子傳遞體的功能改變以及葉綠素結(jié)構(gòu)破壞綜合作用的結(jié)果。

可溶性蛋白含量作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物抵御逆境脅迫中起重要作用，它的變化可作為一項(xiàng)生理指標(biāo)反映外界環(huán)境對(duì)植物的影響（鮑思偉等，2001;陳明濤等，2010）。研究發(fā)現(xiàn)，隨CuCl2濃度的升高，當(dāng)歸幼苗葉片的可溶性蛋白含量與對(duì)照相比顯著性增加，表明CuCl2脅迫對(duì)當(dāng)歸幼苗葉片的蛋白質(zhì)代謝造成了影響。

2.3 不同濃度的CuCl2對(duì)當(dāng)歸幼苗葉片抗氧化酶活性和過(guò)氧化氫含量的影響作用

SOD、POD、CAT及APX是活性氧清除系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，能保護(hù)細(xì)胞免受氧化壓力的損傷;同時(shí)，其活性的變化是表征植物抗氧化壓力的重要指標(biāo)（龔雙姣等，2008;孫衛(wèi)紅等，2005），例如，SOD可以有效阻止活性氧對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生的傷害（Cakmak & Horst， 2006; Kornyeyev et al.， 2001）;POD 作為活性較高的適應(yīng)性酶，能反映植物體內(nèi)代謝狀況以及對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性（周超凡等，2016）;APX 和 CAT 屬于不同的 H2O2清除酶類(lèi)別（Mittler， 2002）;同時(shí)，H2O2含量的增加，可表明植物細(xì)胞受到了環(huán)境脅迫（Qrozco-Cárdenas et al.， 2001; Foyer & Noctor， 2003; Knight， 2004）。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，隨CuCl2濃度的升高，當(dāng)歸幼苗葉片的抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT、APX）均顯著性增加，SOD分別增加了1.4倍、1.9倍、2.5倍、3.3倍;POD分別增加了1.9倍、3.4倍、6.2倍、7.8倍;CAT分別增加了2.2倍、3.2倍、5.7倍、6.7倍;APX分別增加了2.0倍、3.0倍、3.1倍、4.1倍（表3）。同時(shí)，與對(duì)照相比，隨CuCl2濃度的上升，當(dāng)歸幼苗葉片中的H2O2含量也依次增加?？梢?jiàn)，栽培基質(zhì)中過(guò)量的Cu對(duì)當(dāng)歸幼苗產(chǎn)生了生理學(xué)壓力。

2.4 CuCl2脅迫下基質(zhì)中凹凸棒石粘土對(duì)當(dāng)歸幼苗組織中Cu含量的影響

本研究結(jié)果表明，Cu脅迫下當(dāng)歸幼苗根和葉片均受到了不良影響。而在25 mmol·L-1的CuCl2脅迫下，當(dāng)歸幼苗的生理學(xué)參數(shù)均明顯改變，而且該濃度的Cu離子含量和波爾多液中的Cu離子含量近似。因此，在進(jìn)一步的研究中，我們將生長(zhǎng)于混合基質(zhì)（凹凸棒石粘土∶基質(zhì)的體積比分別為0∶1、1∶100、1∶70、1∶50、1∶20）的當(dāng)歸幼苗置于25 mmol·L-1的CuCl2脅迫下，并將上述的生理學(xué)參數(shù)進(jìn)行對(duì)比，以判斷基質(zhì)中凹凸棒石粘土的添加能否緩解CuCl2對(duì)當(dāng)歸幼苗造成的生理學(xué)壓力。

本研究首先對(duì)CuCl2脅迫后當(dāng)歸幼苗根和葉中Cu含量進(jìn)行測(cè)定（表4）。表4結(jié)果表明，在CuCl2處理下，當(dāng)凹凸棒石粘土與基質(zhì)的比值為1∶100時(shí)，當(dāng)歸幼苗根和葉中的Cu含量和不含凹凸棒石粘土的基質(zhì)中生長(zhǎng)的植株相比無(wú)顯著性差異;隨著凹凸棒石粘土在基質(zhì)中含量的增加，當(dāng)歸幼苗根和葉中的Cu含量和不含凹凸棒石粘土的基質(zhì)中生長(zhǎng)的植株相比呈現(xiàn)出顯著性遞減。這可能是因?yàn)榘纪拱羰惩镣ㄟ^(guò)吸收、離子交換等形式減少了基質(zhì)中游離的Cu離子所導(dǎo)致的。

2.5 CuCl2脅迫下基質(zhì)中凹凸棒石粘土對(duì)當(dāng)歸幼苗葉綠素?zé)晒饧叭~綠素含量的影響

測(cè)量發(fā)現(xiàn)，在CuCl2脅迫下，和不含凹凸棒石粘土的基質(zhì)相比，基質(zhì)中存在凹凸棒石粘土可使當(dāng)歸幼苗葉片的Y（Ⅱ）、ETR和qP有所上升，同時(shí)使qN有所下降（圖1）。表明，添加凹凸棒石粘土可以吸附基質(zhì)中過(guò)量的Cu離子，阻止了Cu離子對(duì)光合電子傳遞鏈中QB結(jié)合蛋白以及PSⅡ氧化側(cè)或還原側(cè)一些電子傳遞相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)的改變，減輕了PSⅡ電子傳遞的紊亂程度，從而緩解了CuCl2脅迫對(duì)PSⅡ的不良影響。進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)中凹凸棒石粘土的比例從1∶100增加到1∶70時(shí)，凹凸棒石粘土緩解CuCl2對(duì)PSⅡ造成的不良影響的作用也隨之增強(qiáng);但隨著基質(zhì)中凹凸棒石粘土比例的進(jìn)一步增加，該作用仍然存在，但是和含有1∶70凹凸棒石粘土的基質(zhì)相比較，其緩解CuCl2對(duì)PSⅡ的不良影響的作用有所減弱，且其緩解作用依次為1∶70>1∶50>1∶20>1∶100>0∶1，這可能是由于過(guò)多的凹凸棒石粘土在吸收基質(zhì)中Cu離子的同時(shí)也影響了基質(zhì)的通氣性、透水性和酸堿度等多種理化因素，其具體原因需要進(jìn)一步查明（下同）。

如圖2所示，在CuCl2脅迫下，和不含凹凸棒石粘土的基質(zhì)相比，在基質(zhì)中存在1∶70和1∶50的凹凸棒石粘土可以使葉綠素含量顯著性上升。其中，基質(zhì)中凹凸棒石粘土比例為1∶70時(shí)這種作用最為明顯。表明，添加凹凸棒石粘土能夠通過(guò)吸附或固定基質(zhì)中游離的Cu，從而減少葉綠素中的 Fe2+、Zn2 +、Mg2+等被Cu2+所取代，即減少了葉綠素中心離子組成的變化或失活程度，進(jìn)而緩解了CuCl2脅迫對(duì)葉綠素合成造成的抑制作用。

2.6 CuCl2脅迫下基質(zhì)中凹凸棒石粘土對(duì)當(dāng)歸幼苗的可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性和過(guò)氧化氫含量的影響

3 討論與結(jié)論

本研究中，CuCl2脅迫導(dǎo)致當(dāng)歸幼苗的Y（Ⅱ）、ETR、qP以及葉綠素含量下降，說(shuō)明Cu脅迫使葉片PSⅡ的容量和PSⅡ在光下運(yùn)行效率降低，同時(shí)使PSⅡ接受和傳遞電子的能力也下降。和上述變化相應(yīng)的是，表征能量耗散的qN在CuCl2脅迫下顯著性升高，表明了CuCl2脅迫使得更多的光能無(wú)法用于光反應(yīng)，而以熱的形式耗散掉（謝佳佳等，2018）。同時(shí)，隨著植物組織中Cu含量的積累，當(dāng)歸葉片中的可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性以及過(guò)氧化氫含量顯著性升高（表1、表3、表4），表明Cu脅迫對(duì)當(dāng)歸葉片產(chǎn)生了嚴(yán)重的生理壓力。

如上文所述，凹凸棒石粘土對(duì)重金屬離子具有良好的吸附性能（胡濤等，2005;魏榮道和崔嶠，2005），可通過(guò)吸附或離子交換原理在栽培基質(zhì)中固定一部分重金屬元素，從而降低植物對(duì)重金屬的吸收量（譚科艷等，2011）。因此我們研究了基質(zhì)中凹凸棒石粘土的添加能否有效緩解Cu脅迫對(duì)當(dāng)歸幼苗造成的上述生理學(xué)壓力。在進(jìn)一步的研究中，我們將生長(zhǎng)于混合基質(zhì)（凹凸棒石粘土∶基質(zhì)的體積比分別為0∶1、1∶100、1∶70、1∶50、1∶20）的當(dāng)歸幼苗置于25 mmol·L-1的CuCl2脅迫下（該濃度的Cu離子含量和波爾多液中的Cu離子含量近似），并將上述的生理學(xué)參數(shù)進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在CuCl2脅迫下，和不含凹凸棒石粘土的基質(zhì)相比，含凹凸棒石粘土的基質(zhì)使得當(dāng)歸幼苗中的Cu含量、可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT、APX）及過(guò)氧化氫含量顯著性降低，同時(shí)也使得光化學(xué)效率和葉綠素含量升高，說(shuō)明在基質(zhì)中添加凹凸棒石粘土能緩解Cu離子對(duì)當(dāng)歸幼苗造成的生理壓力，提示了凹凸棒石粘土應(yīng)是通過(guò)吸附或固定基質(zhì)中游離的以及可交換的Cu離子，通過(guò)減少當(dāng)歸幼苗對(duì)有效Cu離子的吸收，從而緩解Cu離子對(duì)植物造成的生理學(xué)壓力。值得注意的是，CuCl2脅迫下，盡管基質(zhì)中凹凸棒石粘土比例的上升能夠不斷降低植物組織中Cu的積累，但凹凸棒石粘土對(duì)其他生理學(xué)壓力的緩解作用沒(méi)有呈現(xiàn)出絕對(duì)的平行性關(guān)系。從整體數(shù)據(jù)分析來(lái)看，基質(zhì)中凹凸棒石粘土比例低于1∶70時(shí)，凹凸棒石粘土緩解CuCl2對(duì)當(dāng)歸幼苗產(chǎn)生的生理壓力的作用隨凹凸棒石粘土比例的上升而隨之增強(qiáng)，但其比例高于1∶70時(shí)，凹凸棒石粘土仍然能夠在不同程度上緩解CuCl2對(duì)當(dāng)歸幼苗產(chǎn)生的生理學(xué)壓力，然而，這種作用隨著基質(zhì)中凹凸棒石粘土比例的上升在不同程度上有所減弱，且凹凸棒石粘土與基質(zhì)的這種緩解作用的體積比依次為1∶70>1∶50>1∶20≥1∶100>0∶1。這可能是由于基質(zhì)中存在過(guò)多的凹凸棒石粘土?xí)r，其在吸收基質(zhì)中Cu離子的同時(shí)也影響了基質(zhì)的通氣性、透水性和酸堿度等（譚科艷等，2011），其具體原因需要進(jìn)一步查明。

綜上所述，適量的凹凸棒石粘土在一定程度上能夠緩解CuCl2脅迫對(duì)植物所造成的生理學(xué)壓力。在大田種植當(dāng)歸的過(guò)程中，添加凹凸棒石粘土能夠緩解重金屬對(duì)當(dāng)歸的毒害作用，且當(dāng)凹凸棒石粘土與栽培基質(zhì)的體積比為1∶70時(shí)，這種緩解作用最佳。

參考文獻(xiàn)：

AMINA B， REDAdM， RACHID R， et al.， 2013. Physiological and biochemical changes observed in alternative cellular model：Paramecium tetraurelia treated with paracetamol [J]. Int J Biosci， 9（3）：132-141.

ARNONdI， 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris [J]. Plant Physiol， 24（l）： 1.

BAKER J，dENNSTEELE CV，dURE L， 1988.Sequence and characterization of 6 Lea proteins and their genes from cotton [J]. Plant Mol Biol， 11（ 3）：277-291.

BAO SW， TAN F， LIAO ZH， 2001. Effects of soildrought on the osmoregulating ability of Vicia faba leaves [J]. J SW Agric Univ， 23 （4）：353-359.? [鮑思偉， 談 鋒， 廖志華， 2001. 土壤干旱對(duì)蠶豆葉片滲透調(diào)節(jié)能力的影響 [J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 23（4）：353-359.]

BOULASSEL A，dJEBAR MR， ROUABHI R， et al.， 2013. Physiological and biochemical changes observed in alternative cellular model：Paramecuim tetraurelia treated with paracetamol [J]. Int J Biol， 3（9）：132-141.

CAKRNMAK I， HORST WJ， 2006. Effect of aluminium on lipid peroxidation， superoxidedismutase， catalase， and peroxidase activities in root tips of soybean （Glycine max） [J]. Physiol Plant， 83（3）：463-468.

CHANCE B， MAEHLY AC， 1995. Assay of catalase and peroxidase [J]. Meth Enzymol， 2：764-775.

CHEN CT， CHEN TH， LO KF， et al.， 2004. Effects of proline on copper transport in rice seedlings under excess copper stress [J]. Plant Sci， 166：103-111.

CHEN MT， ZHAO Z， QUAN JE， 2010. Variation of soluble protein components and contents in seedling root tips of four trees underdrought stress [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 30（6）：1157-1165.? [陳明濤， 趙忠， 權(quán)金娥， 2010. 干旱對(duì)4種苗木根尖可溶性蛋白組分和含量的影響 [J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 30（6）：1157-1165.]

DRUART C， SCHEIFLER R， MILLET M， et al.， 2012. Landsnail eggs bioassays：A new tool to assess embryotoxicity of contaminants in the solid， liquid or gaseous phase of soil [J]. Appl Soil Ecol， 53（1）：56-64.

FANG L， XIAO XF，LIU CX， et al.， 2012. Recent advance in studies on Angelica sinensis [J]. Chin Herb Med， 4（1）：12-25.

FENG P， SUN L， SHEN XH， et al.， 2016. Response and enrichment ability of Perennial ryegrass under lead and cadumium stress? [J].? Acta Pratac Sin， 25（1）：153-162.? [馮鵬， 孫力， 申曉慧， 等， 2016. 多年生黑麥草對(duì)Pb、Cd脅迫的響應(yīng)及富集能力研究 [J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 25（1）：153-162.]

FERGUSON IB， WATKINS CB， HARMAN JE， 1983. Inhibition by calcium of senescence ofdetached cucumber cotyledons：Effect on ethylene and hydroperoxide production [J]. Plant Physiol， 71（1）：182-186.

FERNNDEZ R， BERTRAND A， REIS R， et al.， 2013. Growth and physiological responses to cadmium stress of two populations of Dittrichia viscosa（L.） Greuter [J]. J Hzar Mater， 244-245（2）：555-562.

FLEXAS J， ESCALONA JM， MEDRANO H， 1999. Water stress inducesdifferent levels of photosynthesis and electron transport rate regulation in grapevines [J]. Plant Cell Environ， 22（1）：39-48.

FOYER CH， NOCTOR G， 2003. Redox sensing and signalling associated with reactive oxygen in chloroplasts， peroxisomes and mitochondria [J]. Physiol Plant， 119（3）：355-364.

GENTY B， BRIANTAIS JM， BAKER NR， 1989. The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence [J]. Biochim Biophys Acta， 990（1）：87-92.

GONG SJ， MA TW， JIANG YF， et al.， 2008. Antioxidant enzyme activities induced by Cadmium stress in three species of Mosses [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 28（9）：1765-1771.? [龔雙姣， 馬陶武， 姜業(yè)芳， 等， 2008. 鎘脅迫下3種蘚類(lèi)植物抗氧化酶活性變化的比較研究 [J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 28（9）：1765-1771.]

GUERRERO IY， 2005. Copper in plants [J]. Braz J Pl Physio， 17（1）.

HAZRATI S， TAHMASEBI-SARVESTANI Z， MODARRES-SANAVY SA， et al.， 2016. Effects of water stress and light intensity on chlorophyll fluorescence parameters and pigments of Aloe vera L. [J]. Plant Physiol Biochem， 106：141-148.

HU T， QIAN YH， JIN YL， et al.， 2005. Study on the application of attapulgite clay [J] . China Min Maga， 14 （10）：73-76.? [胡濤， 錢(qián)運(yùn)華， 金葉玲， 等， 2005. 凹凸棒土的應(yīng)用研究 [J]. 中國(guó)礦業(yè)， 14（10）：73-76.]

KNIGHT MR， 2004. Oxidative stress-induced Calcium signaling in Arabidopsis [J]. Plant Physiol， 135（3）：1471-1479.

KOPITTKE PM，dART PJ， MENZIES NW， 2006. Effect of Cu on the growth and nodulation of Cowpea （Vigna unguiculata） [C]// World congress of soil science-frontiers of soil science [J]. Int Union Soil Sci， 1-1.

KORNYEYEVd， LOGAN BA， PAYTON P， et al.， 2001. Enhanced photochemical light utilization anddecreased chilling-induced photoinhibition of photosystem Ⅱ in cotton overexpressing genes encoding chloroplast-targeted antioxidant enzymes [J]. Physiol Plant， 113（3）：323-331.

LI H， GUO A， WANG H， 2008. Mechanisms of oxidative browning of wine [J]. Food Chem，108（1）：1-13.

LIU SH， LIU XH， HOU J， et al.， 2008. Study on the spectral response of Brassica Campestris L. leaf to the copper pollution [J]. Sci China ， 51（2）：202-208.

MAKSYMIEC W， KRUPA Z， 2006. The effects of short-term exposition to Cd， excess Cu ions and jasmonate on oxidative stress appearing in Arabidopsis thaliana [J]. Environ & Ex Bot， 57（1-2）：187-194.

MARTINS LL， MOURATO MP， CARDOSO AI， et al.， 2011. Oxidative stress induced by cadmium in Nicotiana tabacum L.：Effects on growth parameters， oxidativedamage and antioxidant responses indifferent plant parts [J]. Acta Physiol Plant， 33（4）：1375-1383.

MITTLER R， 2002. Oxidative stress， antioxidants and stress tolerance [J]. Trends Plant Sci， 7（9）：405.

NAKANO Y， ASADA K， 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in Spinach chloroplasts [J]. Plant Cell Physiol， 22：867-880.

NISHIKIMI M， RAO AN， YAGI K， 1972. The occurrence of super oxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen [J]. Biochem Biophys Res Comm， 46：849-854.

PENG XY， SONG M， 2011. Effects of exogenous cysteine on growth， copper accumulation and antioxidative systems in wheat seedlings under Cu stress [J]. Acta Ecol Sin， 31（12）：3504-3511.? [彭向永， 宋敏， 2011. 外源半胱氨酸對(duì)銅脅迫下小麥幼苗生長(zhǎng)、銅積累量及抗氧化系統(tǒng)的影響 [J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)， 31（12）：3504-3511.]

QIUdY， LIN HM， CHEN Y， et al.， 2010. Effect of altitude， longitude and altitude on Angelica growth and early bolting in medicine formation period [J]. Acta Agr Sin， 18 （6）：838-843.? [邱黛玉， 藺海明， 陳 垣， 等， 2010. 經(jīng)緯度和海拔對(duì)當(dāng)歸成藥期植株長(zhǎng)勢(shì)和早期抽薹的影響 [J] .草地學(xué)報(bào)，18（6）：838-843.]

QROZCO-CRDENAS ML， RYAN CA， 2001. Hydrogen peroxide acts as a second messenger for the induction ofdefense genes in tomato plants in response to wounding， systemin， and methyl jasmonate [J]. Plant Cell， 13（1）：179-91.

ROUSOS PA， HARRISON HC， 1987. Identification ofdifferential responses of cabbage cultivars to copper toxicity in solution culture [J]. J Am Soc Hortic Sci， 112（ 6）：928-931.

SHARMA RK， AGRAWAL M， 2005. Biological effects of heavy metals：An overview [J]. J Environ Biol， 26（2 Suppl.）：301.

SUN WH，WANG WQ， MENG QW， 2005. Functional mechanism and enzymatic and molecular characteristic of ascorbate peroxidase in plants [J]. Acta Phytophysiol Sin， 41（2）：143-147.? [孫衛(wèi)紅， 王偉青， 孟慶偉， 2005. 植物抗壞血酸過(guò)氧化物酶的作用機(jī)制、酶學(xué)及分子特性 [J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 41（2）：143-147.]

TAN KY， LIU XD， LIU JC， et al.， 2011. Remediation experiments of attapulgite clay to heavy metal contaminated soil [J]. Rock Min Anal， 30（4）：451-456.? [譚科艷， 劉曉端， 劉久臣， 等， 2011. 凹凸棒石用于修復(fù)銅鋅鎘重金屬污染土壤的研究 [J]. 巖礦測(cè)試， 30（4）：451-456.]

WEIdD， 2016. The protection mechanism of glycinebetaine on photosynthesis under chilling stress in tomato leaves [D]. Jinan：J Shangdong Agric Univ.? [衛(wèi)丹丹， 2016. 低溫脅迫下甜菜堿對(duì)番茄葉片光合作用的保護(hù)機(jī)制 [D]. 濟(jì)南：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)]

WANG C，CAO JS，XIE K， et al.， 2016. Research progress of the modification of attapulgite and its application in water treatment [J]. Appl Chem Ind， 45（8）：1575-1578.? [王成， 操家順， 謝坤，等， 2016. 凹凸棒土改性及其在水處理中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 應(yīng)用化工， 45（8）：1575-1578. ]

WEI RD， CUI Q， 2005. The exploitation and application of the attapulgite claydeposit in Linze， Gansu Province [J]. Gansu Sci Sin， 17 （3）：43-45.? [魏榮道， 崔嶠， 2005. 甘肅臨澤凹凸棒石粘土礦開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究 [J]. 甘肅科學(xué)學(xué)報(bào)，17（3）：43-45.]

WEI W， GONG SX， ZHANG TJ， 2009. Research progress on the compositions of angelica polysaccharide and their pharmacological action [J] .drug Eval Res， 32（2）：130-134.

XIE JJ， LU LN， SHIdL， et al.， 2018. Protective effects of alternative respiratory pathway on photosystem Ⅱ in Phaseolus vulgaris under CuCl2 stress [J].Bull Bot Res， （1）：75-80.? [謝佳佳， 蘆麗娜， 石岱龍， 等， 2018. 交替呼吸途徑對(duì)CuCl2脅迫下菜豆葉片光系統(tǒng)Ⅱ的保護(hù)作用 [J]. 植物研究， （1）：75-80.]

XUE YW， WANG YF， ZHAO CJ， et al.， 2016. Effects of copper stress on germination and antioxidant system in wheat seedlings [J] . Acta Agric Univ Jiangxi （Nat Sci Ed）， 38（1）：54-59.? [薛盈文， 王玉鳳， 趙長(zhǎng)江， 等， 2016. 銅脅迫對(duì)小麥種子萌發(fā)及幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響 [J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 38（1）：54-59.]

YANG XM， HU GJ， 2004. Study on remediation of cadmium contaminated soil by attitugite [J]. J Heilongjiang Sci Technol Univ， 14（2）：80-82.? [楊秀敏， 胡桂娟， 2004. 凹凸棒石修復(fù)鎘污染的土壤 [J]. 黑龍江科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 14（2）： 80-82.]

YANG Y， WANG XY， WANG J， et al.， 2016. Effects of speciesdiversity on plant growth and remediation of Cd contamination in soil? [J]. Acta Sci Cirumst， 36（6）：2103-2113.? [楊揚(yáng)， 王曉燕， 王江， 等， 2016. 物種多樣性對(duì)植物生長(zhǎng)與土壤鎘污染修復(fù)的影響 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，36（6）： 2103-2113.]

ZHAO J， 2009. Elsholtzia splendens remediation of copper contaminated soil assisted by trichoderma [D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University.? [趙靜， 2009. 銅污染土壤的木霉強(qiáng)化海州香薷修復(fù)研究 [D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)]

ZHAO YY，dAI Y， CUI XM， et al.， 2016.determination of protein contents of Radix aconiti kusnezoffii using Coomassie Brillant Blue G-250dye binding? [J] . J Yunnan Natl Univ （Nat Sci Ed）， 15 （3）：235-237. [趙英永， 戴云，崔秀明， 等， 2016. 考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定草烏中可溶性蛋白質(zhì)含量 [J]. 云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 15（3）：235-237.]

ZHOU CF， WU GX， LI T， et al.， 2016. Effect of exogenous hydrogen sulfide on photosynthesis and antioxidant system of cucumber leaves under low temperature in solar-greenhouse [J]. Acta Hortic Sin， 43（3）：462-472. [周超凡， 吳幗秀， 李婷， 等， 2016. 外源H2S對(duì)低溫下日光溫室黃瓜光合作用及抗氧化系統(tǒng)的影響 [J]. 園藝學(xué)報(bào)， 43（3）：462-472.]

ZHU HQ， ZHOU J， 2004. The present exploitation situation anddevelopment trend of attapulgite clay [J]. Conserv Utiliz Min Res， 4：14-17.? [朱海清， 周杰， 2004. 凹凸棒石粘土的開(kāi)發(fā)利用現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì) [J] .礦產(chǎn)保護(hù)與利用， 4：14-17.]